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Bioengineering

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

doi: 10.3791/3349 Published: January 17, 2012

Summary

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 '유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

Abstract

이 방법의 전반적인 목표는 층류 조건에 점착 성의 세포를 제목과 잘 같지는 유체 전단 응력 1 자신의 응답을 평가하는 기술을 설명하는 것입니다.

우리의 흐름 챔버 설계 및 흐름 회로 (그림 1) (그림 11C) 흐름 동안 여러 시간 지점에서 (그림 11A, B) 흐름을 바로 앞에 셀 형태의 세포 접착 및 이미징의 테스트를 가능하게하는 투명한 가시 영역을 포함 및 이후 흐름 (그림 11D). 이 실험은 인간의 탯줄과 함께 그림 아르 혈액 파생 내피 전구 세포 (EPCs)와 돼지의 EPCs 2,3합니다.

이 방법은 또한 다른 자기편 셀 유형, 예를 들어 평활근 세포 (SMCs) 또는 섬유아 세포에 적용됩니다.

챔버 및 회로의 모든 부분은 쉽게 증기 autoclaving로 소독하고 있습니다. 다른 대조적으로여왕님 예 microfluidic의 챔버 셀 (셀 크기에 따라> 1 만달러)의 큰 번호, 세포 배양 또는 다른 실험 예 DNA 또는 RNA 추출, 또는 immunohistochemistry (그림 11E)에 대한 살균 조건 하에서 유동 실험 후 복구할 수 또는 전자 현미경 5 스캔. 전단 응력은 perfusate, 유체 점성, 또는 채널의 높이와 넓이의 흐름 속도를 변화하여 조정할 수 있습니다. 한 차원 흐름이 유지되는 확보하면서 후자는 액체 볼륨 또는 셀 요구를 줄일 수 있습니다. 챔버의 높이가 크게 여러 실험의 용이성을 증가 가스켓의 사용에 의존하지 않기 때문에 그것은 실험 챔버 사이의 높이를 측정하는 필요가 없습니다. 또한, 회로 설계를 쉽게 분석 및 / 또는 유체 전단 응력의 ​​노출에 따라 세포에 의해 분비 metabolites의 부량, 예를 들어 질산 산화물 (그림 12) 6 perfusate 샘플의 수집을 가능하게

Protocol

1. 내피 전구 세포의 분리

  1. 전에 주변 사람 혈액의 모든 모음, 귀하의 기관 심사위원회 (IRB)에 연구 프로토콜을 제출하고 승인 후, 자원 봉사 기증자를 얻는 '정보 동의 (말초 혈액 수집 및 EPC 절연이와 듀크 대학 IRB 승인했다를 ) 인간 연구 참가자의 보호에 관한 미국 규제 요구 사항을 완전 준수하고 있습니다.
  2. 동물 - 파생 EPCs 작업을하는 경우, 연구 프로토콜은 기관 동물 케어 승인하고위원회 (IACUC)를 사용합니다. 우리의 모든 돼지의 실험은 듀크 대학 IACUC 승인했다 그리고 인간 치료의 최고 수준에 따라 실시되었다.
  3. 내피 전구 세포의 분리 들어, 항응고제 citrat 가득 혈액 봉투에 동의 자원 봉사 기증자에서 표준 정맥 절개 기법을 통해 말초 혈액의 50 ML을 수집전자 인산 덱스 트로 오스와 행크의 버퍼 소금 솔루션 1시 1분 (CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 제외) Histopaque 동등한 볼륨에 레이어가 잘 정의된 레이어를 만들 수있는 솔루션을 희석.
  4. 원심 분리기 (30 분, 740g, 낮은 브레이크 설정) 및 mononuclear 세포 (MNC) (버피 코트) 레이어를 수집합니다. Resuspend과 Dulbecco의 인산과 함께 씻어 MNCs X 3 (MCDB - 131 중간 5 전체 EPC 성장 매체에 두 12 자 접시에 도금하기 전에 10 % 태아 소 혈청 (FBS) × 10 분, 515g와 (과 DPBS) 염분 버퍼 37에서 200 mm까지 L - 글루타민 10 % FBS 및 EGM - 2 SingleQuots)의 ML ° C, 5 % CO 2.
  5. 천천히 다음 첫 번째 7 일간, 매일 다른 하루를 24 시간마다 중간 변경할 수 있습니다. EPC의 식민지들은 조약돌 형태에 따라 14 일 평균 사용 시간 후에 확인할 수 있습니다. 일단 12 잘 면적의 문화 커버 ¼에 EPCs는 세포를 확장하고 표면 마커의 존재에 대해 테스트하여 유동세포계측법와 EPC 신원을 확인CD31 및 이전 6 설명된대로 CD14, CD45의 부재. 수행할 수 있습니다 기타 assays는 세포 형태학 및 DiI - AC - LDL과 라벨을 포함합니다.
  6. 실험 본 설명을 위해 그들이 37 humidified 인큐베이터에서 EPC 중간 3 T - 75 세포 배양 flasks 거의 합류 때까지 격리 EPCs을 확장 ° C 5 % CO 2.

2. 전단 응력 계산

  1. 우리는이 계산이 얻을 수있는 조건에 대한 철저한 이해를 가지고 챔버와 채널을 제조하기 전에 수행하는 것이 좋습니다. 원하는 가위에 기초하여 회로의 perfusate의 흐름 속도를 계산은 식 1에 따라 세포에 적용하는 응력

등식 1

Q 원하는 유량 어디에, τ는 타겟의입니다스트레스가 세포에 tangentially 행동 듣고, W의 흐름 챔버의 너비이고, H는 흐름 챔버의 높이이며, μ는 perfusate (유동 매체)의 점도있다.

  1. 사용 매체에 대한 점도의 전형적인 값 (μ)은 0.9 CP (0.009 g cm -1의 -1)입니다. 점성도 이렇게 7을 원하는 경우 높은 분자량 dextran을 사용하여 올릴 수 있습니다. 대상 전단 응력의 ​​전형적인 값 (τ)는 위에 - 생리학 전단 응력이 원하는 경우, 15 dynes / cm 2, (전형적인 동맥 전단 응력) 또는 100 dynes / cm 2 사용됩니다. 267 μm의 - 우리 챔버는 일반적으로 166의 범위에서 1.9 cm 및 높이 (H)의(W)를하고 있습니다.

3. 흐름 챔버 제조

  1. 일의 위쪽과 아래쪽을 잘라 접시7 X 2 X 0.5 "7 X 2 X 0.25과 하단 차원"의 처음 크기와 알루미늄 합금 6061 직사각형 주식에서 전자 챔버.
  2. 쉬는 시간 0.125은 1.375 "(폭) x 0.3125"깊은 유체 수용기에 대한 끝마다 "깊은, 0.950를 떠나"로 중앙 부분에서 최고의 판.
  3. 아래쪽에서 16분의 1 "(폭) x 0.625"긴 슬롯 유입과 유출의 종료에있는 저수지에 침투하기 위해 드릴.
  4. 각각의 상위 판의 끝에서 유체 저수지에 침투 호스 미늘 중앙에 위치한 32분의 10 "폴리 프로필렌 팔분의 일에 대한 인치당 트랙 (TPI)는 구멍을"드릴. 유입 엔드에서 "폴리 프로필렌 팔분의 일에 대한 구멍 TPI"32분의 10와 호스 미늘을 측면 플러그를 만듭니다.
  5. 유체의 혼합을위한 적절한 0.518 정도의 유리 볼 창에 액체 유입으로부터 테이퍼는 맨 아래쪽.
  6. 상단 보는 윈도우에 맞춰 하단의 접시에 유리 슬라이드 창을 잘라. 챔버에 수족관 시멘트, 접착제 유리 슬라이드를 사용합니다. 적어도 24 시간 동안 치료하실 수 있습니다.보는 창이 75 X 25 X 1mm 현미경 유리 슬라이드 챔버에서 내리 앉을 수 있도록 recessed 있는지 확인하십시오.
  7. 그들이 "0.02로 떨어져 간격되는 등 상단 및 하단 플레이트의 아래쪽 주위에 O - 링을위한 휴회를 만듭니다. 고무 O - 링을 삽입합니다.
  8. 민머리 나사 "32분의 8와 함께 사용하기위한 상단 및 하단 실에서 TPI 구멍"10 일치 32분의 8을 드릴.

4. 흐름 회로 어셈블리

  1. 먼저 전체 흐름 회로를 조립 후의 살균과 함께 진행합니다.
  2. "(연결 펄스 dampener의 한쪽 끝을 팔분의 일을 통해)에 하드 튜브의 세그먼트"36 연결합니다. 다른이를 위해 부드러운 튜브의 18 "세그먼트를 연결합니다.
  3. 단계 4.2에 언급된 소프트 튜브 섹션 1 / 8 "18의 끝에 남자 luer 어댑터"를 넣으십시오. 1 / 8로 남성 luer를 연결 "여성 luer 어댑터. 새로운 18 여성 luer를 첨부하여"세그먼트 부드러운 튜브.
  4. 튜브에 맞게 250 ML 유리 비커 모자로 3 개의 구멍을 뚫어라. 나한 구멍과 250 ML 유리 병 (저수지 등) (그림 2)에 모자에있는 다른 두 구멍을 통해 하드와 소프트 튜브의 자유로운 끝을에 부드러운 튜브의 1.5 "세그먼트를 (공기 등) nsert. 하드 관이 (저수지에서 유출 튜브 등) 저수지의 바닥에 도달했는지 확인하십시오.
  5. 121에서 증기 autoclaving하여 위의 부분을 소독 ° C 60 분. 또한 하나의 완전한 흐름 챔버, 3 압력솥​​ X 2 luer 어댑터, 4 X ½ "부드러운 튜브, 1 남 1여 팔분의 일의 세그먼트" "6 X 16분의 5"8-32 민머리 나사, 핀셋 1 쌍 한 75 X 25 X 1mm 유리 슬라이드 (또는 다른 원하는 세포 표면 재질), 2 외과 수건.
  6. 층류 후드에 멸균 수건을 놓으십시오. 이 멸균 분야에 흐름 회로, 흐름 챔버, 4 X 4 방식 stopcocks, 1 X 1 방식 꼭지, 그리고 단계를 4.5에서 모든 살균 부분을 넣으십시오.
  7. 지금이 4 방향 stopcocks를 연결 멸균 장갑을 사용하십시오. 오픈 샘플 포트에서 장소 모자. 흐름 회로의 두 부드러운 튜브 세그먼트를 연결 남성과 여성의 luer 어댑터를 분리하고 연결 stopcocks (그림 3) 삽입합니다.
  8. 30 ML의 주사기에 저수지에 삽입 부드러운 튜브를 부착하고 주사기의 피스톤을 제거합니다. EPC 매체 (그림 4) 125 ML로 병을 채우십시오.
  9. 공기 배출구 (그림 4)에 멸균 주사기 필터를 놓습니다.
  10. 37 humidified 인큐베이터에 흐름 회로를 이동 ° C 5 % CO 2.
  11. 튜빙의 종류 (그림 5)와 함께 사용하기위한 표시된 롤러 펌프 헤드에 하드 튜브를 고정. 튜브는 롤러 펌프 장착 트랙과 중복되지 않는 것을 확인하십시오. 튜빙을 표시 어디에 그것이 출구 표시 펜으로 양쪽에 펌프 헤드를.
  12. 모든 stopcocks이 샘플 포트쪽으로 폐쇄되었는지 확인하고 흐름 회로를 따라 엽니다. 펌프를 시작합니다. 흐름의 방향을 확인합니다. perfusate는 천을를 이동해야합니다톰 펄스 dampener에 하드 튜브를 통해 유리 저수지.

5. EPC 형광 라벨링

  1. 37 흐름 회로 따뜻해지는 ° C, 슬라이드에 시딩에 대한 세포를 준비하는 동안. 세포는 불투명 재료, 예를 들어 티타늄 (TI)에 시각 수있다면 형광 라벨이 필요합니다.
  2. 디메틸 sulfoxide (DMSO)의 90 μl와 50 μg CTO 분말을 diluting하여 셀 커 오렌지 (CTO)의 1 ㎜ 주식 솔루션을 만듭니다. 빛의 노출 (흐름 후드를 작동하는 동안 불을 끄고)에서이 혼합물을 방패해야합니다.
  3. 혈청 프리 MCDB - 131 중간 18 ML로 CTO 주식 솔루션 36 μl를 diluting하여 CTO의 2 μm의 작업 솔루션을 만듭니다.
  4. 10 ML DPBS (CA 또는 MG없이)과 합류 T - 75 세포 배양 flasks 근처 3 EPCs을 씻어.
  5. 각 플라스크에 2 μm의 CTO 작업 솔루션 6 ML을 추가합니다. 37 15 분 품어 ° C. 10 ML의 DPBS (CA 또는 MG 제외) 각 플라스크에게 X 2 린스.
  6. EPC 매체 5 ML에 600g과 resuspend에서 원심 분리 X 5 분 씻으십시오.

6. 챔버 어셈블리를 유동하기 전에 슬라이드의 세포 시딩

  1. 유리, 티타늄, 또는 기타 소재로 만들어 슬라이드 사용할 수 있으며 슬라이드 표면은 고분자와 스핀 코팅에 의해 수정 또는 금속 레이어를 추가할 수 있습니다. 멸균 사각 안경 챔버 세포 배양 용기 (또는 폴리스티렌 표면이 원하는 경우 사용하는 조직 문화 슬라이드 플라스크)에 슬라이드를 삽입합니다. 합류 셀 계층은 흐름의 개시 (그림 11A)에서 원하는 경우 EPC 중간 X 6 시간 5 ML에있는 슬라이드에 세포 및 종자 1.5 X 10 6 세포를 세어보세요.
  2. 유체 전단 응력 하에서 확산 셀 및 접착력을 테스트하기 위해, 3 X 10 6 세포가 흐름의 시작 (빠른 시딩) 전에 15 분 준수하도록 (

7. 흐름 챔버 어셈블리

  1. 멸균 장갑을 사용하여, 여성 luer 어댑터 "1 / 8로 부드러운 튜브 세그먼트"한 2 연결합니다. 남성 luer 어댑터 다른 2 "1 / 8로 부드러운 튜브 세그먼트"를 연결합니다.
  2. "유입 포트에 여성 luer 어댑터와 부드러운 튜브. 2 첨부"2 첨부 유출 포트에 남성 luer와 부드러운 튜브합니다. 이러한 luer 어댑터 모두 4 방향 stopcocks를 첨부하십시오. 버블 트랩을 오는 사이드 포트 커넥터에 나머지 2 "부드러운 튜브 조각을 연결하고 1 방향 꼭지 (그림 6) 연결합니다.
  3. 멸균 핀셋을 사용하여 세포 배양 용기 (또는 슬라이드 플라스크를 사용하는 경우, 슬라이드에있는 술병을 제거)에서 셀 씨앗 슬라이드를 제거하고 흐름 챔버의 아래쪽 접시에 쉬는 시간에 넣습니다. 슬라이드가 위로 직면하고있는 셀 씨앗 면을 배치되었는지 확인합니다.
  4. 슬라이드에 따뜻한 EPC 매체의 Pipet 10 ML. 매체 슬라이드와 흐름 챔버, B를 커버하도록 허용UT는 아래 판에있는 O - 링 위에 매체를 누설하지 않습니다.
  5. 나사 구멍을 정렬, 하단 플레이트에 흐름 챔버의 상단에 접시를 놓습니다. 두 접시가 평행 유지하여이 단계에서 챔버에 공기 방울을 소개 안됩니다.
  6. 함께 나사 플레이트 (이 절차는 자동으로 배터리로 작동하는 드라이버 속도).
  7. 유입 쪽 버블 트랩 포트에 연결된 1 방식 꼭지를 열어 유입 버블 트랩에서 공기 방울을 제거하고 부드럽게 10 ML의 주사기를 사용하여 EPC 매체로 유입 튜브를 플러시. 그런 다음이 꼭지와 뚜껑 그것 (그림 7)에서 닫습니다.
  8. 이제 4 방향 꼭지 유출 포트를 열어 부드럽게 10 ML의 주사기를 사용하여 다시 흐름 챔버를 통해 EPC 매체를 플러시하여 챔버 채널에서 공기 방울을 제거합니다. 큰 거품이 남아있는 경우, 45 ° 각도 (그림 8)로 챔버의 유출 엔드를 올립니다.
  9. 모자 4 방식 꼭지 연결의 모든 프로그램을 종료그들 해제. 조립 흐름 회로 (그림 9)와 함께 보육에 흐름 챔버를 이동합니다.
  10. 흐름 회로 펌프를 일시 중지합니다. 누출을 방지하고 챔버의 내부는 멸균 유지하는 흐름의 방향으로 흐름 회로 stopcocks를 닫습니다. 흐름 회로에 흐름 후드의 흐름 챔버를 전송. 흐름 회로 흐름 챔버를 연결합니다. 흐름의 방향으로 stopcocks을 엽니다. 흐름 펌프를 재개. perfusate가 올바른 방향으로 흐르고 있는지 확인합니다. 원하는 전단 응력에 흐름 속도를 조정합니다.
  11. 흐름 실험을 진행하는 동안 흐름 챔버는 빛 또는 형광 현미경을 통해 이미지의 회로에서 세포를 제거할 수 있습니다. 이렇게하기 위해서는 꼭지 - 꼭지 연결의 흐름 회로에서 흐름 챔버를 분리합니다. 챔버의 불임을 유지하기 위해, 흐름의 방향으로 흐름 회로 stopcocks 및 흐름 챔버 stopcocks을 닫고 흐름 회로를 제거하기 전에 모든 stopcocks을 캡인큐베이터 (그림 9)에서.

8. Perfusate 샘플 모음

  1. 분석을 위해 perfusate 샘플을 쉽게 수집 (예 : 질산 산화물 합성) 먼저 일시 정지 펌프하십시오.
  2. 펄스 dampener에 가장 가까운 위치 꼭지를 닫습니다. 는 보호 마개를 제거하고 샘플 포트에 작은 크기의 주사기, 예를 들어 3 ML에 주사기를 삽입합니다. 뚜껑을 유지하고 그것이 거꾸로 그것을 배치하여 오염이 될 것이라고 보장합니다.
  3. 펄스 dampener 개방의 방향으로 샘플 포트와 회로를 유지, 흐름 챔버의 방향으로 꼭지를 닫습니다.
  4. 회로에서 샘플 원하는 금액 예 150 μl를 그립니다. 주사기를 제거하기 전에 샘플 포트쪽으로 꼭지를 닫습니다. 80 ° C (나중 지점에서 질산 산화물 결정을위한) -에 표시 약병과 동결에 perfusate 샘플을 저장합니다.
  5. 샘플 포트를 요점을 되풀이하고 모든 stopcocks이 시작하기 전에 열려있는 것을 확인 흐름.

9. 대표 결과

우리의 빠른 종자 방법을 사용하여, 인간 혈액 유래 내피 전구 세포는 15 분 동안 티타늄 슬라이드에 씨앗을 품고 15 dynes / cm 2의 생리 (간선) 전단 세력에 따라 준수하실 수 있습니다.

그림 10과 같이, EPCs는 657로 즉시 시딩 후, 210에서 흐름의 영향 ± 11.4 μm의 2를 따르는 확산 삼시간 후, 그리고 1152에 ± 39.1 μm의 ± 15의 유체 전단 응력 24 시간 후 55.3 μm의 dynes / cm 2 (그룹 간의 차이가 P <0.0001, 1 방향 ANOVA로 통계적으로 의미입니다.) 빛 또는 형광 중 현미경으로 투명한 챔버를 통해 몇 군데 수있는 셀 영역의 증가에 병렬, 진원도는 방정식 2 6에 따라 계산

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878 × 10 -3 ± 5.9 671 × 10 -3로 바로 시딩 후, × 10 -3 ± 19.2 X 10 3 시간 이후 -3, 그리고 526 × 10 -3 ± 19.2 × 10 -3 후 48 시간에서 감소 같은 유체 전단 응력 노출 (그룹 간의 차이는 P <0.0001, 1 방향 ANOVA로 다시 통계적으로 의미입니다.)

그림 11D는 EPCs 15 dynes / 그림 11A와 같이 6 시간 정적 시딩 기간, 이후 자신의 임의의 방향에 비해 cm 2 유체 전단 응력의 ​​48 시간 이후 흐름 방향으로 정렬하고 동양 보여줍니다.

우리의 방법은 또한 분석 및 / 또는 분비 세포 metabolites의 부량에 대해 미리 정해진 시간 지점에서 perfusate의 샘플을 얻기위한 수 있습니다. 대표적인 예를 들어 우리는 produc를 묘사그림 12에서 돼지의 EPCs와 함께 48 시간 흐름 실험 도중 - 아질산의 기 (NO 2). 우리는 직접 6시간에서 12.0 nmol, 12 시간에 13.1 nmol, 24 16.3 nmol로 다른 시간 지점에서 흐름 회로에서 수집한 중간 샘플의 NO에 대한 대리 마커로서 질산 산화물 (NO)의 기본 산화 제품을 측정 시간, 15 dynes / cm 2 6 1 X 10 6 세포에 대한 48 시간 후 24.6 nmol.

그림 1
그림 1. 유동 회로 조립 및 유동 실험의 개요를 보여주는 도식. 흐름 챔버 않고 (A) 흐름 회로 조립. 저수지, 펄스 dampener, 하드 튜브, 부드러운 튜브, 4 방향 stopcocks와 연결 luer 어댑터뿐만 아니라, 공기 필터가 여기에 포함되어 있습니다. (B) 흐름 펌프의 머리에 하드 튜브 세그먼트를 통해 흐름 챔버를 연결합니다. (C)에서 흐름 챔버 (D)의 맨 아래 접시에 EPC - 씨앗 슬라이드 sertion. 흐름 챔버와 흐름 회로의 조립을 완료합니다.

그림 2
살균을 위해 그림 2. 완전 조립 흐름 회로.

그림 3
그림 3. stopcocks과 살균에 포함된 조립 흐름 회로 후.

그림 4
그림 4. EPC 매체의 125 ML와 유리 저수지를 채운.

그림 5
그림 5. 흐름 회로는 이전 흐름 챔버 삽입으로 흐름 펌프의 머리에 채워.

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그림 6. 탑 챔버 플레이트 조립체.

그림 7
그림 7. 챔버의 유입 측면에서 거품을 제거하는 EPC 매체와 버블 트랩을 플러쉬.

그림 8
그림 8. 슬라이드와 챔버의 유출 측면에서 거품을 제거하는 EPC 매체와 챔버를 플러쉬.

그림 9
그림 9. 완전히 플로우 실험 도중 삽입된 플로우 챔버와 흐름 회로를 조립.

그림 10
그림 10. EPC 영역 (μm의 2) 유동 실험의 시간 코스 이상 증가합니다.

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그림 11. (A) HUCB EPCs의 빛 현미경 이미지 100 X 확대 X 6시간 전에 흐름에 fibronectin 코팅 유리 슬라이드에 씨앗을 품고. (B) HUCB 100 X 확대 형광 현미경과 시각, 티 슬라이드 이전 흐름 X 15 분에 CTO와 빠른 씨앗으로 표시 EPCs. HUCB의 EPCs와 (C) 동일한 티 슬라이드 아래로 (B), 100 dynes / cm 2 흐름 3 시간 후 100 X 확대 투명한 챔버를 통해 몇 군데. 흐름 3 시간 후 세포의 확산되지만 임의의 오리 엔테이션을합니다. 지금 100 X 확대 흐름 노출 48 시간 후 (D) 같은 티 슬라이드. EPCs은 CTO 및 세포 핵이 흐름 후 Hoechst 염색 (파란색)과 함께 묻은으로 표시됩니다. 흐름의 방향으로 세포의 정렬합니다. (E) 티에 대한 비교에 대한 돼지의 EPCs의 흐름 48 시간 15 dynes / cm 후

그림 12
그림 12. 그래프 흐름을 48 시간 동안 돼지의의 EPCs의 어떠한 생산을 묘사하지 않습니다. NO의 산화 주요 제품, 아질산은 (NO 2 -), 유동하는 동안 다른 시간 지점에서 수집한 중간 샘플을위한 대리 마커로 측정되었다.

그림 13
그림 13. 흐름 챔버가 상단 (A) 0.5되는 "X 2"X 7 "및 아래 섹션 (B) 0.25"차원 X 2 "X 7"로, 알루미늄 합금 6061 직사각형 주식에서 이루어집니다. 최고가"실링에 대한 평면도를 확보하기 위해 인치 상단 부분 0.125하기 위해 중심 부분에 recessed은"0.45하기 위해 아래쪽 O - 링 접촉 표면에 계획이었습니다 X 1.375 "유체 저수지"0.3125에 대해 당 엔드 "0.95을 떠난되는.이 상단의 저수지는 3/8-24 TPI와 스레드 스테인레스 스틸 플러그를받을 수 0.25 "깊이를 스레드입니다. "X 0.625"을 16분의 1을 측정하는 슬롯이 저수지에 침투 아래쪽으로 가공되었다. 유입 측면 플러그는 꼭지에 연결하는 호스 미늘 32분의 10 "폴리 프로필렌 팔분의 일에 대한 통하여 구멍"을하고 있습니다. 각 단위 엔드는 0.45 "X 2"결국 호스 미늘 "폴리 프로필렌 팔분의 일에 대한 깊은 부분에"0.25로 중앙에 위치한 스레드 32분의 10 TPI 있습니다. "저수지에 침투를 통해 스레드의 바닥에서 구멍. 상단 섹션의 아래쪽은 테이퍼 지역 0.6875있다"끝이 0.07을 사용하는 1.460의 거리 "에 대한 LH 슬롯의 중심에서 0.518도, 다양한 있습니다.이 테이퍼 glas의 마지막에서 "0.6875"(폭) x 0.0118 "깊고 0.590 평면 영역에 결합의 (또는 다른 표면, 예를 들어 티타늄 슬라이드) 리세스. 슬라이드가 설치되면이 평면은 유리 (또는 다른 표면 예 : 티타늄 슬라이드)로 플러시해야합니다. 테이퍼와 평면을 연마하고 있습니다. 슬라이드의 표면은 0.0118 "은 아래쪽 표면에서 recessed. 0.0118"쉬는 시간이 RH 끝에 저수지 슬롯을 계속하고있다. O - 링은 O - 링 그루브와 슬라이드 사이에 원래의 표면의 "0.020를 떠나 슬롯 및 슬라이드 주위에 전적으로 recessed입니다. 윗면과 아랫면 단위는 10 구멍 뚫고 있습니다. 상단 부분은 32분의 8 TPI 접시 평면에 대한 통관 구멍을 가지고 머리 나사. 하단 부분은 상단 구멍을 일치 배치 구멍을 가지고 있으며, 32분의 8 TPI를 스레드입니다. 하단 단위는 세포 표면 유리 슬라이드 (또는 티타늄 슬라이드)를 통해 위치의 표면을 가진 투명 유리 슬라이드 창 recessed 플러시 있습니다. 단위는 하단의 슬라이드와 내부 O - 링 그루브 사이에 원래의 표면의 "0.04를 떠나 폭 맨 단위 슬롯을 포함 O - 링 홈이 있습니다. O - 린천 붉은 실리콘 AS568A, 아래 섹션의 상단과 046에 대한 대시 번호 044아르.

Discussion

우리의 흐름 회로와 흐름 챔버은 우리가 정의된 유체 전단 응력에 자기편 세포, 예를 들어 EPCs를 대상 수 있습니다. 챔버 위쪽과 아래쪽은 투명, 세포 부착과 형태가 챔버 자체를 통해 실시간으로 중 평가하거나 흐름 챔버 분해 흐름 실험 후 수 있습니다.되기 때문에 그 시점에서, 세포는 무균 조건 하에서 수확 수 있으며, 다시 도금하거나, 또는 추가 분석을 위해 DNA 또는 RNA 등을 수집하는 데 사용됩니다.

층류 흐름을 달성하기 위해 챔버의 디자인은 몇 가지 조건이 충족되는 등해야합니다.

첫째, 흐름 점성 세력에 관성 세력의 비율이다는 레이놀즈수 (재)를 계산하여 확인할 수 판상,해야합니다. (점성 세력이 predominate면, 다시 작은이고 흐름 판상 또는 '완전히 개발'이다 - 일반적으로 다시 <2300하십시오.관성 세력이 predominate 경우가 불안정 때까지 흐름이 점점 더 무작위되는대로 다시> 4000의 경우입니다.) 우리는 방정식 3 8에 따라 다시 계산할 수 있습니다

등식 3

ρ는 유체 밀도는 어디, Q는 유량이며, μ는 점도이다, W와 H는 각각 챔버의 너비와 높이,, 그리고 D H는 방정식 4 8에 의해 정의, 유압 직경입니다

방정식 4

166에 이르기까지 높이와 세명의 흐름 챔버의 레이놀즈 번호 - 267 μm의, 13.9의 범위 - 34.6 유동 속도에서 C15 dynes / cm 2의 전단 응력을 구하는 alculated. 234-100 dynes / cm 2의 전단 응력 계산 유량에서 실의 레이놀즈 번호는 90.4에서였다. 이러한 레이놀즈 번호의 모든 2300보다 훨씬 낮은이며, 층류에 대한 기준을 충족.

둘째, 속도 필드와 전단 응력에 대한 흐름 채널 (즉, 완전히 개발), 입구의 길이, L 전자 이상이어야합니다 슬라이드 유체 유입구로부터 거리를 따라 거리 독립적 있습니다. 이것은 방정식 5 9 따르면, 입구 길이를 계산하여 만족하실 수 있습니다.

방정식 5

위에 나열된 값을, 입구 길이는 0.01에서 0.25 cm로 다양합니다.

셋째, 측면 방향으로 속도와 전단 응력이 다양하지 않도록하기 위해서는크게 한 차원 채널 유동에 대한 값 (Δ의 수소 이온 농도 / 2L)에서 비율 H / W 1보다 훨씬 작아야합니다. 한 차원 유동에서 벽면 전단 응력의 95 %로 2 차원 흐름 조건에서 평균 벽 전단 응력 들어, H / W는 0.10와 동일해야하며 2 차원 흐름 조건에서 벽면 전단 응력에 대한 수 한 차원 유동에서 벽면 전단 응력의 97.5 %가 H / W는 0.05와 동일해야합니다. 우리의 설계 흐름 챔버 1.7 가로 cm 및 166의 크기로 - 높이 267 μm의 이러한 기준을 만족하고 있습니다.

입구에는 측면 압력 그라디언트가없는 경우 압력 흐름의 방향에서만 달라집니다. 이것은 흐름 경로에 염료 또는 입자를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 또한, 꾸준한 유동 실험, 펄스 dampener은 유동 회로에 삽입됩니다. 펄스 dampener은 puls의 대부분을 밖으로 걸립니다atility은 회로에서 롤러 펌프에 의해 발생하고, 우리는 지속적인 흐름의 대략적인 가정 수 있습니다. 그것이 효과적으로 롤러 펌프의 특정 주파수의 출력 흐름 pulsations를 없앨 수 있도록주의의 활용 펄스 dampener는 회로에 사용되는 펌프와 튜브와 호환되어야합니다. 및 I / P 26 튜브 - 모든 Masterflex L / S 시리즈 펌프 (600 RPM을 0)으로 배출 라인에서 사용할 때 우리가 데모에서 Masterflex L / S 펄스 dampener는 층류 흐름을 실현하고 있습니다. 타악기 흐름 들어, 프로그램 펌프는 다양한 파형을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

타악기 흐름 들어, 프로그램 펌프는 다양한 파형을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

또한 회로가 perfusate 이러한 것을 표본을 설계 쉽게 셀 또는 유동 매체의 오염을 위험없이 다른 시간 지점에서 수령하실 수 있습니다. 우리 예제에서, NO 2의 농도가 -와 chemiluminescence에 의해 측정되었다Ionics / Sievers 질산 산화물 분석기 (NOA 280, Sievers 악기, 볼더, CO는)로 이전 10 설명했다. 아질산 분석에 사용 reductant 아니오로 아질산염을 변환하지 절감 잠재력을 가지고 있지만 같은 질산염과 같은 질소의 높은 산화물을 줄이기 위해 부족한 초산 (14.5 M 아세트산 산 및 0.05 M KI)에 칼륨 요오드화물되었으며 따라서 상대적이다 아질산염에 대한 특정. 샘플 6하면서 잃어버린 볼륨 조정하면서 생산 총액의 아질산이 생성 농도 및 회로의 총 볼륨의 제품으로 계산되었다.

다음 단계는 유동 실험의 성공적인 실행을 위해 중요하다 :

  1. 거품들이 표면에서 세포를 찢을 수있는 잠재력을 갖고 있기 때문에 그것은 흐름을 설정하는 동안 거품 형성을 방지하는 것이 바람직하다. 이 최선의 하단 부분에 흐름 챔버의 상단 부분을 게재할 때 돌보는 방지할 수 있습니다서로 모두 평행을 유지하고 readjustments없이 한 움직임 하단에 상단을 낮추는 방법으로 성취. 이렇게에서 유동 채널의 현재 및 / 또는 부동 수 있습니다 작은 공기 방울은 알루미늄 하우징 중 하나를 끝에있는 버블 트랩으로 우회한다.
  2. 저수지의 유출 관이 저수지의 바닥까지 도달하도록하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 공기 perfusate 수준이 약간 튜브 끝 아래 일인 경우는 저수지에서 챔버로 연결 튜브에 빨려 수 있습니다.
  3. 연구원은 펌프가 실수로 공기가 회로와 챔버로 빨려을 초래 하리라는 흐름을 개시,시 반대 방향으로 실행되지 않도록 펌프 흐름의 방향을 잘 알고 있어야합니다.
  4. 거품의 형성을 (혈청에 포함된 단백질 변성에 의한)하지 않으려면, 우리는 perfusa 위의 약 인치 챔버에서 저수지로 연결 튜브를 낮출 조언저수지 안쪽 테 수준. 그러나, 유동 매체 수준 이상을 유지하면 실험 중에 저수지에 흐름을 확인할 수 있습니다.
  5. 함께 챔버 부품을 폈다하면 다른 손으로 전기 드라이버를 운영하면서 굳게 한 손으로 주택을 파악하는 것이 중요합니다. 전기 드라이버의 움직임이 나사가 강화되면 '주변의 챔버를 던지다'가능성을 가지고 토크로 번역됩니다.
  6. 회로의 형성과 그 표면에 묻은 세포를 리프팅로부터 압력 파를 방지하려면 모든 stopcocks이 흐름을 시작하기 전에 열려 있는지 확인합니다.
  7. 특히 장기 흐름 연구 (> 48시간) 우리는 튜브의 파괴 방지하기 위해 펌프 헤드에 삽입되도록 더 더 탄력 튜브를 사용하는 것이 좋습니다.
  8. 튜브가 아프 - 조정 펌프 헤드 치아로 인해 펌프 헤드 내부에 '마이 그 레이션'이라는 수도 있습니다. 그러므로 우리는 어떻게 욕조에 가까운주의를 기울이고 제안ING는 펌프 헤드의 확보와 튜브가 '에서 가져온'또는 실험 중에 dislodged 경우 쉽게 통보 수와 같은 표시 펜으로 튜브의 각 끝을 표시합니다.
  9. 항상 신중하게 잘못된 연결로 인해 실험 기간 동안 perfusate의 누출을 방지하기 위해 재관류를 시작하기 전에 회로와 챔버의 모든 단일 커넥터를 확인하십시오. 이것은 펄스 완충기의 유입과 유출 커넥터 특히 중요합니다!
  10. 당신은 형광 라벨을 사용하면 조명 노출을 제한할 것을 잊지 마십시오.

우리의 흐름 챔버 가능한 제한 높이가 채널의 높이 알루미늄으로 가공하여 고정된다는 점입니다. 그러나, 이것은 각각의 실험하기 전에 채널의 높이를 확인하고 조정할 필요하지 않는 장점을 가지고 있으며, 따라서 단지 원하는 값으로 펌프 흐름을 조정하여 전단 응력 계산을 단순화합니다. 연구 목표에 따라, 그것은하는 것이 바람직하다 수 있습니다증가 펌프 속도없이 전단 응력을 향상시킬 수 있습니다. 이 경우에는 우리가 perfusate의 점도를 증가하는 것이 좋습니다, 예를 들어,이 매체 11 dextran을 추가.

흐름 회로의 수 제한이 세포 metabolites의 매우 작은 농도를 정할려고 할 때 문제가 될 수있는 사용할 매체의 큰 볼륨입니다. 여기에 표시되지 있지만, 그것은 실질적으로 작은 저수지와 펄스 dampener를 사용하여 회로 볼륨을 줄이고 튜브 길이와 직경을 감소 수 있습니다.

또한, 문화의 세포에 유체 전단 응력을 적용하는 데 사용할 수있는 여러 상용 시스템이있다. Microfluidic 기반 시스템은 이러한 채널 12,13,14에 대한 입력 및 출력 저수지 역할을 잘 접시에 솔루션을 로드된 다른 microfluidic 유동 채널 세포의 동시 분석을 활성화 Fluxion에서 BioFlux 시스템을 예. 그러나 이러한 및 기타 마이크로유체 시스템은 표준 현미경 슬라이드와 호환되지 않습니다 및 RT - PCR이나 서양 얼룩과 같은 추가 실험을위한 세포 충분히 대량의 복구를 위해 허용하지 않습니다. 또한, 그들은 덜 사용자 친절 40,000 달러 최소 비용 및 액세서리 장비에 따라 10 만 달러 이상의 총 도달 수 있습니다.

Flexcell 국제 공사, Flexcell의 테이프와 FlexFlow 시스템에서 사용할 두 macrofluidic 시스템이 성공적으로 내피 세포 15,16,17, 유체 유동 조건 하에서 인간의 고리 세포 18 섬유아 세포 19 연구하는 데 사용되었습니다. GlycoTech를 통해 제공되는 세 번째 시스템은, 종양 세포 접착 20 내피 백혈구 유착 monolayers에 21 연구 활용되었습니다.

테이프 시스템은 여러 개의 슬라이드가 한 번에 동일한 전단 응력 조건에서 실행되도록하지만,보기 창을 부족 - 우리와 달리를설계 - 흐름에 따라 세포의 실시간 시각화를위한 허용하지 않습니다.

FlexFlow 시스템은보기 창을 가지고 있지만, 대부분의 실험실에서 사용되는 표준 현미경 없을 수도 똑바로 현미경을 필요로합니다. 또한, FlexFlow 시스템은 흐름 챔버에 배치하면 반전이 될 수있는 셀 코팅 커버 슬립이 필요합니다. 이것은 우리가 우리의 연구에서 보여주는 이러한 티타늄 코팅 유리로 불투명 표면에 형광 세포의 시각화 걸​​로. 마지막으로, 전문적인 커버 전표는 Flexcell의 테이프 시스템과 유사한 멀티 - 만 달러 가격 범위에있는 FlexFlow 시스템에 대해 구체적으로 구매해야합니다.

GlycoTech 상당히 저렴하지만, 편리하게 우리의 챔버처럼 autoclaved 줄기 수없는 주조 아크릴에서 제조됩니다 원형과 사각형 병렬 플레이트 흐름 챔버 스를 제공합니다. 참고의 설명했습니다 다른 흐름 챔버 스는 autoclavable 수그들은 특별한 미세 렌즈 22,23을 필요로하기 때문에 허무 나타납니다. GlycoTech 시스템은 반복 사용과 두께의 변화하므로 시간 (제조 업체가 매 10 사용 후 새로 구입하는 것이 좋습니다)를 통해 챔버의 높이가 변경됩니다 상단 및 하단 플레이트 사이 interposed 실리콘 고무 가스켓을 사용합니다. O - 링 내장된 우리 알루미늄 챔버의 상단 및 하단 플레이트의 완전한 반대에 대한 허용과 실험 사이의 지속적인 챔버의 높이를 보장합니다. 마지막으로, 진공 펌프는 우리 디자인에서 필요하지 않습니다 GlycoTech 실, 등 많은 유동 챔버 설계의 누설 방지 밀봉을 달성하기 위해 필요합니다.

여기에 표시되지 반면, 흐름 챔버는 세포 부착 및 / 또는 행동의 실시간 영상에 대한 전체 흐름을 실험 중에 현미경으로 보관하실 수 있습니다. 이것이 원하는 경우, 우리는 37 perfusate 온도를 유지하기 위해 챔버에 따라 열 램프 또는 온수 패드를 사용하는 것이 좋습니다 ° C. 모피셀 또는 metabolites 또는 investigational 약물 또는 대리인 중 하나도 '재순환'이 24 원하는하지 않은 경우도, 롤러 펌프는 주사기 펌프로 대체하실 수 있습니다.

그것은 유체 전단 응력에 따라 휴대 전화의 상호 작용을 평가하기 위해 합류 EPCs의 계층 이상의 자기편 세포, 예를 들어 형광등 혈소판 (Achneck 외 의해 설명되어있는 혈소판 분석을 사용합니다. 6,25)을 통해 다르게 표시 세포를 유동하는 것도 가능합니다. 우리의 흐름 챔버는 perfusate 샘플링 포트와 보는 창 같은 다른 사용 가능한 유동 회의소의 귀중한 기능을 결합하여 하나 거꾸로 또는 직립 현미경과의 호환성의 중요한 이점이 있습니다. 그것은 완전히 autoclavable하고 지속적인 챔버의 높이에서, leakproof 인감을 달성하기위한 진공 펌프의 필요없이 반복 실험 수 있습니다.

Disclosures

생산이 비디오 문서의 무료 액세스 콜 - Parmer 악기 (주) 후원됩니다

Acknowledgments

저자는 가공과 흐름 회의소를 통해 이미지 세포 기술의 지원에 대한 Leica Microsystems에서 흐름 챔버 부품 및 매트 Maudsley를 모으는 그의 지칠 줄 모르는 노력에 대한 바이오 메디컬 악기와 기계 공장에서 조 오웬 감사드립니다. 우리는 듀크 재관류 서비스에서 케빈 콜린스와 유동 회로 설계에 대한 유용한 제안 의생명 공학과에서 박사 스티브 월레스에게 빚을 수 있습니다. 우리는 또한 RC1HL099863 - 01 "장치를 지원 순환계의 biocompatibility을 향상시키기 위해 Autologous EPC 내막 '부여를 통해 지원 알렉 산드라 Jantzen와 NIH 지원을위한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 장학생 프로그램을 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 ml Syringe Cole-Parmer 07940-12
1-Way Stopcoks Cole-Parmer 30600-00
30 ml Syringe BD Biosciences 309650
4 -Way Stopcocks Cole-Parmer 30600-04
Aluminum Alloy N/A 6061
Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) Thermo Fisher Scientific, Inc. 267061
Cell Tracker Orange Invitrogen C34551
DMSO Research Organics 2162D
DPBS (-/-) Invitrogen 14190-144
EGM-2 Singlequots Lonza Inc. CC-4176
Female Luer Adaptor Cole-Parmer SI-45500-04
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895-2MG
Glass Bottle (250ml) with Cap Cole-Parmer 34594-24
Hard Tubing Cole-Parmer 06508-16
HBSS Sigma-Aldrich H8264-500ML
Histopaque Sigma-Aldrich H8889-500ML
H–chst Stain Solution Sigma-Aldrich H6024
Hyclone FBS Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30071.01
L-glutamine Lonza Inc. 17-605E
Male Luer Adaptor Cole-Parmer EW-45505-04
MCDB-131, 1X Medium Cellgro 15-100-CV
Barbed Polypropylene Fittings Cole-Parmer 06365-90
O-Rings N/A AS568A
Pulse-Dampener Cole-Parmer 07596-20
Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) Cole-Parmer 7524-40
Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) Cole-Parmer 07518-60
Slide Cole-Parmer 48500-00
Soft Tubing Cole-Parmer 96400-16
Syringe filter Cole-Parmer 02915-12
Sytox Orange Nucleic Acid Stain Invitrogen S-11368
Trypsin EDTA Lonza Inc. CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution Lonza Inc. CC-5002

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References

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층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로
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Lane, W. O., Jantzen, A. E., Carlon, T. A., Jamiolkowski, R. M., Grenet, J. E., Ley, M. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Lin, F. H., Allen, J. D., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J. Vis. Exp. (59), e3349, doi:10.3791/3349 (2012).More

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