Summary
여기 우리는 세포의 반응 산소 종의 존재를 테스트하고 평가하는 간단한 방법을 제안합니다.
Abstract
반응 산소 종은 분자의 숫자를 포함 피해 DNA와 단백질 및 lipids (지질 peroxydation)을 RNA와 산화. 이러한 반응 분자가 산소를 포함하고 H 2 O 2 (과산화수소), NO (질산 산화물), O 2 포함 - (산화물 음이온), peroxynitrite (ONOO -), hydrochlorous 산성 (HOCl)과 히드록실를 라디칼 (OH -) .
산화 종뿐만 아니라 병적인 상황 (암 / 허혈성 reperfusion, neurologic 및 심혈관 pathologies, 전염성 질환, 염증성 질환 1, 면역 질환 2, 등 ...)에 따라뿐 아니라 세포의 대사 3으로 생리 (비 병적인) 상황 동안 생산됩니다 , 4. 사실, ROS는 (확산, 세포 활성화 5, 6, 7 마이 그 레이션 등.) 수많은 세포 신호 경로에서 중요한 역할을 재생합니다. ROS가 해로운 수 있습니다 (이것은 다음이라고합니다세포내 구획과 세포에 높은 금액에서 생산되는 "산화와 nitrosative 스트레스") 일반적으로 초과 산화물의 dismutase (잔디)와 카탈 라 아제 (CAT), 글루타티온 퍼옥시데이즈 (GPX)와 보호 글루타티온 (GSH)와 같은 산화 억제제를 upregulating하여 ROS에 대응 무해한 분자 (예 : 물)에 위험한 자유 래디 칼을 변환하여. 비타민 C와 E는 ROS의 청소부 (산화 억제제)로 설명되었습니다.
자유 래디 칼은 낮은 금액 3 유용합니다. 대식 세포와 neutrophils - 중재 면역 반응은 바이러스, 병원균과 종양 증식 억제 8 NO의 생산 및 릴리스가 필요합니다. 어떠한 또한 다른 ROS와 반응하지 않으며 따라서, 또한 detoxifier (ROS의 청소)로 역할을하고 있습니다. 오랫동안 운동 9, 10 근육의 적응을위한 중요한 혈액 흐름을 조절하기 위해 선박에 마지막으로 어떠한 행위를하지 않습니다. 여러 출판물은 또한 ROS가 인슐린 SENS에 관련된 것을 증명itivity 11, 12.
ROS 생산을 평가하는 많은 방법이 있습니다. 이 문서에서 우리는 몇 가지 간단하고 신속하고 저렴한 assays을 제안, 이러한 assays는 많은 출판물에 의해 검증되어 있고 정기적으로 포유 동물 세포에 ROS 또는 그 효과를 감지하는 데 사용됩니다. 이러한 assays 중 일부는 여러 ROS를 감지하는 동안, 다른 사람들은 단지 하나의 ROS를 감지합니다.
Protocol
1. 카르복시 - H 2 DCFDA를 사용하여 ROS의 탐지
카르복시 - H 2 DCFDA이 아닌 형광하지만이 시약은 산화는 ROS의 면전에서, 그것은 녹색 형광됩니다.
- 사용하기 바로 전에, 살균 dimethylsulfoxide (DMSO) 또는 100 % 에탄올에 카르복시 - H 2 DCFDA의 신선한 재고 솔루션을 준비합니다. 당신의 염색 여러 해동 / 정지 사이클을 피하십시오.
- HEPES로 세포를 씻어하면 소금 솔루션 (HBSS)을 버퍼 또는 식염수 (PBS)는 원래 매체의 흔적을 제거하는 인산 버퍼.
- 염색과 세포 (및 제어 염료, CF 노트 섹션)로드합니다. 이 분석에서 우리는 Jurkat, 인간의 백혈병 세포 라인을 사용합니다. 감소 혈청 (2 %)와 정기적인 문화 매체에서 1μM의 최종 농도에서 카르복시 - H 2 DCFDA을 사용합니다.
- 종래의 인큐베이터 (37 ° C 5 % CO2)에서, 어둠 속에서 30 분 동안 문화를 품어. 모든 않는 염료 솔루션을 폐기하십시오.
- 카르복시를 제거- H 2 DCFDA는 매체가 포함된 HBSS 또는 PBS로 두 번 씻는다. 앞으로이 단계에서, 라이트로부터 세포를 보호합니다.
- 카르복시 - H 2 DCFDA -로드 셀 선택의 약물을 포함하는 새로운 매체를 추가하고 원하는대로 알을 품다. 이 예를 들어 우리는 1 시간 H 2 O 2 (0.03 %)를 사용합니다.
- 즉시 FL1 채널 (녹색 형광) 또는 형광 판 리더에 의해, 또는 형광 현미경을 사용하여 유동세포계측법하여 세포를 분석하여 ROS을 평가합니다. 형광은 녹색 형광에 적합한 여기 및 방출 파장을 사용하여 검색하실 수 있습니다.
참고 : 컨트롤이 카르복시 - H 2 DCFDA -로드 셀 및 치료 흠없는 치료 세포를 포함해야합니다. 카르복시 - H 2 DCFDA는 peroxides를 감지하는 것으로 알려져 있지만 다른 ROS에 의한 산화 수 있습니다. 이 시약은 또한 5, 기타 방법으로 산화 구별 제어 염료를 수정할 수 있습니다 - (및 6) - 카르복시 - 2 ', 7' - dichlorofluorescein의 디아 세 테이트 (카르복시 - DCFDA)은 따라서 시험에 포함되어야합니다.
2. 질산 산화물 (NO) 생산의 측정
당신은 Sulfanilamide 및 N - 1 - napthylethylenediamine의 dihydrochloride (NED) 솔루션, 아질산염 표준이 필요합니다. 이 분석은 Griess 분석이라고합니다.
NED 솔루션 : 5 % 인산에 희석 sulfanilamide의 1 % 솔루션을 확인하십시오 : 무균 water.Sulfanilamide 솔루션 희석 N - 1 - napthylethylenediamine의 dihydrochloride의 0.1 % 솔루션을 확인하십시오. 아질산염 표준 : 멸균 매체 100μM로 0.1M 표준 재고 아질산 나트륨을 희석 같은 매체에서 시리얼 희석 해.
보관 조건 : 같은 상온에서 제조가 감독한 저장 화학 물질. 재구성하면, NED와 Sulfanilamide 솔루션은 어둠 속에서, 3 개월 최대 즉시 사용 4 ° C 이후에 저장됩니다.
- 96 잘 플레이트 문화 세포,사용은 각각의 조건에 대한 triplicates, 그리고 실험에 따라 적절한 컨트롤을 포함합니다.
- 어떠한 생산을 유도하지 세포를 드셔보세요. 우리의 실험에서 우리는 우리의 세포를 치료 lipopolysaccharide (LPS) (100 NG / ML)와 재조합 IL - 4를 사용합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 RAW 264.7, 마우스 대식 세포의 세포 라인 (마우스 leukaemic 단핵구 대식 세포 세포 라인) 사용됩니다.
- 분석의 날, 상온에 두 시약을 가지고.
- 접시를 스핀, 휴대 supernatants를 수집하고 새로운 96 잘 판에 50μl를 전송할 수 있습니다. 표준 곡선을 만들기 위해 여러분의 표준 재고 솔루션의 희석 우물을 제한 준비합니다.
- 각각의 샘플을 잘 제어하는 Sulfanilamide 솔루션의 50μl를 추가하고 잘 섞는다.
- 어둠 속에서 10 분 동안 상온에서 부화.
- 각각의 샘플을 잘 제어하는 N - 1 - napthylethylenediamine의 dihydrochloride 솔루션의 50μl를 추가하고 잘 섞는다.
- 어둠 속에서 10 분 동안 상온에서 부화.
- absorba를 측정즉시 520nm와 550nm 사이의 파장의 필터 플레이트 리더를 사용 제정신.
당신은 다른 접시 / 그릇 크기를 사용하는 경우, 각 솔루션과 샘플 표면에 뜨는 대한 1/1/1 볼륨을 사용합니다.
바이올렛 색상은 긍정적인 우물에 나타납니다. 표준 얻은 결과는 솔루션의 안정성을 확인 도움이 될 것입니다.
3. ROS 행동 탐지 : 산화 단백질
ROS의 생산을 식별하는 다른 방법은 단백질의 산화를 감지하여 최종 결과를 볼 수 있습니다. 사실, ROS 수정 글루타티온, 대부분의 세포에서 표현하고있는 항산화은 ROS에 대한 보호 역할을합니다. ROS는 이황화 다리를 통해 두 번째 글루타티온에 링크된되고 그 시스테인의 sulfhydryl (thiol) 그룹에서 감소 글루타티온 (GSH) 결과를 수정하여 산화를 따라. 이것은 (산화 단백질 GSSG) dimerized 단백질의 형성에 이르게. GSH는 효소의 환원 효소에 의해 글루타티온 GSSG의 수정을 통해 복원할 수 있습니다. GSSG / GSH 비율의 증가는 산화 스트레스를 반영합니다. 다음과 같은 분석은 이러한 산화 단백질의 탐지 및 부량을 기반으로합니다. 이 방법은 특정 ROS에 대한 선택은 아니지만 오히려 NO의 효과를 감지, H 2 O 2, O 2 -와 다른 ROS. 여기 발광 생물 신호를 사용하여 산화 (GSSG)와 감소 (GSH) 글루타티온의 총 양을 측정합니다.
- 평소처럼 96 잘 플레이트 (투명 / 화이트, 평평한 바닥)에 씨앗 당신의 세포를. 우리의 실험을 위해, 우리는 자기편 원시 264.7 및 A549 세포와 서스펜션 Jurkat 세포에 대해 잘마다 1x10 4 세포를 사용합니다. 당신의 세포의 크기에 따라 숫자가 조정 될 수 있습니다. 테스트 그들이 접시에 첨부할 수 있도록하기 전에 우리가 판 자기편 세포 하루 권장합니다. 충분히 웰스는 산화 및 감소 단백질 탐지뿐만 아니라 "중간에만"에 대한 준비하고 있어야컨트롤로 치료 세포. 사용은 모든 조건 triplicates.
- 소요 시간에 대한 약물로 세포를 처리합니다. 여기 우리는 H 2 O 2 (5mM과 2.5mM 각각에서)와 Jurkat 세포와 1 시간을 위해 A549 세포를 치료. 원시 264.7 세포는 16 H.위한 LPS의 200ng/ml로 치료했다 이 배양 시간 동안 실온 (RT)에 모든 시약을 가지고. 더 이상 30 분 테스트를 수행하기 전에 모든 시약을 만듭니다. 아래의 표는 물론 당 시약의 볼륨을 보여줍니다. 가능한 경우, 그것은 검사하기 전에 줄이고 에이전트를 포함하고있는 미디어를 제거하는 것이 중요합니다.
| 자기편 세포 | 서스펜션 세포 | |||
| 총 GLU의 용해 | 산화 GLU의 용해 | 총 GLU의 용해 | 산화 GLU의 용해 | |
| NEM, 25mM | 없음 | 0.5μl | 없음 | 0.5μl |
| Luciferin - NT | 1 μl | 1 μl | 1 μl | 1 μl |
| 수동 용해 버퍼, 5 배 | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| 증류수 | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| 잘마다 최종 부피 | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- 자기편 세포와 우물에서 매체를 제거합니다. 서스펜션 세포와 우물에서 매체를 제거하지 마십시오.
- 해당 우물로 축소 글루타티온 용해 시약이나 산화 글루타티온의 용해 시약을 추가하고 RT에서 5 분 흔들.
- Luciferin 생성 시약 및 incubat 추가RT에서 30 분 E.
- Luciferin 탐지 시약을 추가하고 RT에서 15 분 동안 품어.
- 0.25-1 초당 잘 플레이트 리더 luminometer를 사용하여 통합시 발광 생물 신호를 읽어 보시기 바랍니다.
| 자기편 세포 | 서스펜션 세포 | |
| 물론 당 핸드폰 번호 | 1x10 4 | 1x10 4 |
| 물론 + 약물 당 세포 현탁액 | 3.4 전에 제거 100 μl, | 25μl, 삭제되지 않도록 |
| 감소 글루타티온의 용해 시약 | 50 μl | 25μl |
| 산화 글루타티온 용해 시약 | 50 μl | 25μl |
| Luciferin 생성 시약 | 50 μl | 50 μl |
| Luciferin 탐지 시약 | 100 μl | 100 μl |
4. 대표 결과 :
카르복시 - H2DCFDA 염료를 사용하여 ROS의 그림 1 탐지. H 2 O 2 처리된 Jurkat 세포는 (인간의 백혈병 세포 라인) 이외의 처리 세포에 비해했다. ROS는 유동세포계측법, O이 치료 세포가 컨트롤의 봉우리 (H 2 O 2 치료 세포를 산화 구별 염색 및 비 물들일에 비해 이동 H 2의 형광 피크 감지와 같은 녹색 fluoresces 카르복시 - H 2 DCFDA의 수정을 유도 카르복시 - H 2 DCFDA 물들일 - 대우 전지). 결과는 치료 세포에 ROS의 존재를 확인합니다.
그림 2 탐지 OF Griess의 시약을 사용하여 어떠한이 없습니다. RAW 264.7 세포 (마우스 대식 세포)가 LPS와 IL - 4로 처리되었습니다. 중요한 NO 생산 증가는 치료 세포를 제어에 비해 처리 세포에서 발견되었다.
| 셀 라인 | 비 - 대우 | 치료 |
| 원시 264.7 | 13.0 | 8.3 |
| A549 | 21.6 | 10.5 |
| Jurkat | 5.2 | 2.8 |
ROS의 표 1 탐지 단백질의 산화를 중재. RAW 264.7 세포는 LPS, Jurkat 및 A549과 함께 치료를했다 (인간 폐암) 세포는 H 2 O 2 치료를했다. 비율이 감소 (GSH) / (GSSG) 글루타티온를 산화로 결과가 표현됩니다. 글루타티온 (GSH) / (GSSG)의 낮은 비율을 비교하여 처리 세포에서 발견되었습니다단백질이 더 많은 치료 세포에 산화다고 공개, 치료 세포를 제어합니다.
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Discussion
같은 염증성 질환, 암, 국소 빈혈 / reperfusion하고, 또한 방사선 또는 화학 요법으로 치료 등 여러 병적인 상황 (즉, cisplatin) ROS의 생산 과잉을 유발. 따라서, 검출 및 ROS의 수준을 측정하는 여러 기본 사전 임상 및 임상 연구에 중요합니다. 그러나, ROS는 매우 짧은 절반 생활을하고 감지하는 복잡한 수 있습니다. 여기, 우리는 포유 동물 세포에 자유 라디칼 생산의 검출을 위해 정기적으로 사용하고 널리 사용할 수 있습니다 간단한 테스트를 제안합니다.
염료를 사용하여 탐지 프로토콜 실험자들이 ROS의 존재를 평가하기 위해 여러 가지 널리 사용되는 방법 (예 : 현미경, 유동세포계측법, 플레이트 리더 등 .... 등) 사용할 수 있습니다. 유동세포계측법 및 현미경은 세포 생존과 NULL, 낮은, 높은 ROS 생산 세포의 비율에 대한 정보를 제공합니다. 현미경은 세포 형태와 세포 부착에 ROS의 영향에 대한 정보를 제공합니다. 플레이트 R을 사용하여 감지eaders 주로 양적 정보를 수 있습니다. Griess으로는 감지 양적는 아니지만 공부 세포의 모양이나 부착에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 아니오 감지 마우스 세포에서 비교적 간단하지 않습니다. 그러나, 낮은 양의 NO가 인간의 샘플에서 발견, 그것은 검색 절차의 각 단계에서 더욱 조심해야하고 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 단백질 산화의 검색은 공부를 세포에 의해 만들어진 모든 ROS의 총 효과를 조사, 여기를 얻은 신호의 강도는 생산 ROS의 양을 나타냅니다. H 2 O 2 효과의 감지는 매우 빠르게 카탈 라 아제에 의해 멸망로 까다롭습니다. GSH - GSSG 저런 형광 분석 직접 GSSG 감지할 수있는 능력을 가지고,이 분석은 그것이없이 추출과 표본에서 직접 수행되기 때문에 산화의 문제를 최소화하고, 적은 세포와 함께. GSH / GSSG 판독, HBSS 용액 또는 글루타티온 프리 미디어 (예 : DMEM 등) 선호해야합니다을 개선하기 위해;혈청 무료로 미디어 작업을하는 것은 더 읽기 향상됩니다. 그것은 염두에 두어야하는 것이 중요하다는 세포의 자연 (조직 유형, 일반적인 비교 pathologic 조직), monolayer 셀 문화의 confluency, 활성화 및 응력 상태, 연령 (구절의 번호)뿐만 등 여러 가지 요인 당신의 세포의 확산 속도가 ROS의 생산에 영향을하므로.
ROS 감지에 사용되는 대부분의 시약은 빛, 산소, 온도 변화에 민감한, 그것은 실험자들이 테스트하고, 신속하게 작업을 수행하는 모든 시약과 샘플의 저장 및 사용에 대한 특별한주의를 사용하므로 매우 중요합니다.
염료를 사용하여 각 실험은 ROS 생산 / 감지를위한 컨트롤로 치료로드 같은 (아니 염료), (마약) 치료 하역 등 적절한 컨트롤, 그리고 언로 드 치료 세포를 포함해야합니다. 페놀 레드없이 매체를 사용하면 (형광 염료로 즉 carbox을 간섭을 줄일 수 있습니다YH이 DCFDA, CM - H 2 DCFDA). 이러한 실험을 시작하기 전에, 그것은이 프로토콜에 적응하여 약물 / 치료 및 치료 세포의 자연 형광을 확인하는 것이 중요합니다. 형광 염료와 함께 세포를로드 전에 또는 세포에 적용됩니다 소요 시간 (분 / 시간 대비 몇 일), 치료 (약물, 국소 빈혈 / reperfusion, 기계적 응력)의 종류에 따라 치료 후 수행하여야한다. 염료의 농도는 ROS는 세포 종류와 세포의 활성화 상태에 따라 달라질 수 있습니다 감지할 필요합니다. 우리의 조언은 10μM과 100μM의 염료 농도로 시작하는 것입니다, 얼룩의 독성 및 효능에 대해 확인하고 다음 실험에 사용할 수있는 최상의 복용량을 결정하기 위해 농도를 줄일 수 있습니다.
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Disclosures
이 게시를 위해 Promega의 지원을 받았다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국립 연구소 (CA142664)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
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