Summary
ここでは、細胞内の活性酸素種の存在をテストし、評価するための簡単な方法を提案する。
Abstract
活性酸素種は分子に損傷を与えるDNAとRNAの数が含まれており、タンパク質や脂質（脂質のperoxydation）を酸化する。 （OH - ）、hydrochlorous酸（HOCl）、およびヒドロキシルラジカルこれらの反応性分子は、酸素が 含まれており、H 2 O 2（過酸化水素）、NO（一酸化窒素）、O 2が含まれます- - （酸化物アニオン）を、ペルオキシナイトライト（尾さん） 。
酸化種のみならず病理学的状況（癌、/虚血再灌流、神経学的および心血管病変、感染症、炎症性疾患1、自己免疫疾患2、等...）の下だけでなく、細胞の代謝3のような生理的（非病理学的）な状況の間に生産されています、4。確かに、ROSは（増殖、細胞の活性化5、6、マイグレーション7等。）多くの細胞内シグナル伝達経路において重要な役割を果たしている。 ROSは有害です（それはその後と呼ばれています"酸化およびニトロソ化ストレス"）一般的に保護するスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）とカタラーゼ（CAT）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPX）とグルタチオン（GSH）と酸化防止剤をアップレギュレートすることによってROSへの応答の細胞内区画と細胞内に多量に生産するときに無害な分子（すなわち水）に危険なフリーラジカルを変換することによって、それら。ビタミンCとEは、ROSのスカベンジャー（抗酸化物質）として記載されている。
フリーラジカルは、低量3で有益です。マクロファージと好中球性免疫応答は、ウイルス、病原体や腫瘍増殖8を阻害NOの産生および放出を伴います。 NOはまた、他のROSと反応していないので、またデトックス（ROSのスカベンジャー）としての役割を持っています。長時間運動9、10〜筋肉の適応のために重要である血流を調節するために船で最後にNOを作用しません。いくつかの出版物はまた、ROSはインシュリンのSENSに関与していることが示されているitivity 11、12。
ROS産生を評価するための多数のメソッドが使用可能です。この記事では、いくつかの、シンプルで速く、そして手頃なアッセイを提案する、これらのアッセイは、多くの出版物によって検証され、日常的に哺乳動物細胞でROSやその効果を検出するために使用されます。これらのアッセイのいくつかは複数のROSを検出しながら、他は単一のROSを検出する。
Protocol
1。カルボキシ- H 2 DCFDAを使用してROSの検出
カルボキシ- H 2 DCFDAは非蛍光性であるが、ROSの存在下では、この試薬 が酸化されるとき、それは蛍光緑色になります。
- 使用直前に、無菌ジメチルスルホキシド（DMSO）または100％エタノールでカルボキシ- H 2 DCFDAの新鮮なストック溶液を調製。あなたの染料の複数の融解/凍結サイクルを避けてください。
- HEPESで細胞を洗浄しても、元の媒体のトレースを削除するには、塩溶液（HBSS）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を。
- 染料（と制御色素、CFのノートセクション）で細胞をロードする。このアッセイでは、Jurkat細胞、ヒト白血病細胞株を使用。低血清との定期的な培地（2％）に1μMの最終濃度でカルボキシ- H 2 DCFDAを使用してください。
- 従来のインキュベーター（37℃、5％CO2）で、暗所で30分間培養をインキュベートする。すべての未使用の色素溶液を捨てます。
- カルボキシを削除します。- H 2 DCFDAは、培地を含有し、HBSSまたはPBSで2回洗浄する。前進このステップから、光から細胞を保護する。
- カルボキシ- H 2 DCFDA -ロードされた細胞に選択のあなたの薬剤を含有する新鮮培地を追加し、必要に応じて培養する。この例では、1時間、H 2 O 2（0.03％）を使用してください。
- 直ちにFL1チャンネル（緑色蛍光）を使用してフローサイトメトリーによって、または蛍光プレートリーダーによって、または蛍光顕微鏡であなたの細胞を解析することによってROSを評価する。蛍光は、緑色の蛍光に適した励起および発光波長を用いて検出することができます。
注：コントロールは、カルボキシ- H 2 DCFDA -ロードされた未処理細胞と未染色の未処理の細胞が含まれている必要があります。カルボキシ- H 2 DCFDAは、過酸化物を検出することが知られていますが、他のROSにより酸化することができます。この試薬はまた、5のように、他の手段によって酸化を区別しないコントロールの染料を変更することができます - （および-6） - カルボキシ-2'、7' - dichlorofluoresceinジアセテート（カルボキシ- DCFDAが）したがって、試験に含まれるべきです。
2。一酸化窒素（NO）産生の測定
あなたは、スルファニルアミドとN - 1 - napthylethylenediamine二塩酸塩（NED）ソリューション、および亜硝酸の標準が必要になります。このアッセイは、グリースアッセイと呼ばれています。
NED液：5％リン酸で希釈したスルファニルアミドの1％溶液を作る：滅菌water.Sulfanilamide液で希釈したN - 1 - napthylethylenediamine二塩酸塩の0.1％溶液を作る。亜硝酸標準：滅菌培地に100μMに0.1Mの標準ストック亜硝酸ナトリウムを希釈し、同じ培地で連続希釈を行う。
保管条件：として、室温で製造業者の指示ストアの化学物質。再構成する場合は、NEDとスルファニルアミド溶液は直ちに4℃、暗所で、3ヶ月、最長使用後に格納されています。
- 96ウェルプレートの培養細胞、使用するには、各条件のために三連、および実験に応じて適切なコントロールが含まれています。
- NO産生を誘導しないため、細胞を扱います。私たちの実験では我々の細胞を治療するためにリポポリサッカライド（LPS）（100 ng / ml）および組換えIL - 4を使用してください。このプロトコルでは、我々はRAW 264.7、マウスのマクロファージ細胞株（マウス白血病単球マクロファージ細胞株）を使用。
- 検定の日に、室温に両方の試薬をもたらす。
- お皿をスピン、細胞上清を収集し、新しい96ウェルプレートに50μlのを転送する。標準曲線を作るためにあなたの標準原液の限界希釈井戸を準備します。
- 各サンプルと同様の制御にスルファニルアミド溶液の50μLを加え、よく混ぜる。
- 暗所で10分間室温でインキュベートする。
- 各サンプルと同様の制御にN - 1 - napthylethylenediamine二塩酸塩溶液を50μlずつを加え、よく混ぜる。
- 暗所で10分間室温でインキュベートする。
- absorbaを測定すぐに520nmと550nmの間の波長のフィルターとプレートリーダーを使用してNCE。
あなたが別のプレート/ディッシュのサイズを利用する場合、各ソリューションおよびサンプルの上清について1/1/1ボリュームを使用してください。
紫の色は、陽性ウェルに表示されます。標準で得られた結果は、あなたのソリューションの安定性を確認するのに役立ちます。
3。 ROS作用の検出：酸化タンパク質
ROSの産生を識別するために、別の方法は、タンパク質の酸化を検出することにより、最後の結果を見ることです。確かに、ROS変更グルタチオン、ほとんどの細胞で発現している抗酸化物質は活性酸素に対する保護的な役割を果たしている。 ROSによって以下の酸化、ジスルフィド架橋を介して第グルタチオンにリンクされて、そのシステインのスルフヒドリル（チオール）基の還元型グルタチオン（GSH）の結果の変更。これは、（酸化タンパク質のGSSG）二量体の蛋白質の形成につながる。 GSHは酵素グルタチオンの還元酵素によりGSSGの変更で復元することができます。 GSSG / GSH比の増加は、酸化ストレスを反映している。以下のアッセイは、これらの酸化タンパク質の検出および定量に基づいています。このメソッドは、特定のROSに対して選択的ではないのではなく、NOの影響を検出する、H 2 O 2、O 2 -およびその他のROS。ここでは、生物発光シグナルを用いて酸化（GSSG）および還元（GSH）グルタチオンの総量を測定する。
- いつものように96ウェルプレートにシードあなたの細胞（透明/白、フラットボトム）。私たちの実験では、我々は、接着RAW 264.7及びA549細胞とサスペンションのJurkat細胞のために、ウェル当たり1 × 10 4細胞を使用していました。あなたの細胞の大きさに応じて、これらの数値を調整することができます。テストは、それらがプレートにアタッチできるようにする前に我々は、プレート接着細胞の日にお勧めします。十分な井戸は、酸化還元タンパク質の検出のためだけでなく、"メディアのみ"のための準備としてくださいコントロールとして未処理の細胞。すべての条件のための三連を使用してください。
- 必要な時間については、薬剤を使用して、細胞を扱います。ここでは、H 2 O 2（5mmと2.5mmのそれぞれにおいて）とJurkat細胞と1HのためのA549細胞を処理した。 RAW 264.7細胞は16時間LPSの200ng/mlで処理したこのインキュベーション時間中に、室温（RT）にすべての試薬をもたらす。 30分以上のテストを実行する前にすべての試薬を加えます。以下の表は、ウェルあたりの試薬の量を示しています。可能な場合、それはテストを続行する前に、還元剤を含有する培地を除去することが重要である。
| 付着細胞 | 浮遊細胞 | |||
| 合計Gluの溶解 | 酸化Gluの溶解 | 合計Gluの溶解 | 酸化Gluの溶解 | |
| NEM、25mMの | なし | 0.5μl | なし | 0.5μl |
| ルシフェリン- NT | 1μL | 1μL | 1μL | 1μL |
| 受動的溶解バッファー、5X | 10μlの | 10μlの | 10μlの | 10μlの |
| 蒸留水 | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| ウェルあたりの最終容量 | 50μlの | 50μlの | 25μlの | 25μlの |
- 接着細胞のウェルから培地を取り除く。浮遊細胞のウェルの培地を除去しないでください。
- 対応するウェルに還元型グルタチオン溶解試薬または酸化型グルタチオンの溶解試薬を追加し、室温で5分間振盪する。
- ルシフェリンの世代の試薬とincubatを追加します。室温で30分間のe。
- ルシフェリン検出試薬を追加し、室温で15分間反応させます。
- 0.25から1秒あたりのウェルプレートリーダーのルミノメーターを使用しての統合時に生物発光シグナルを読む。
| 付着細胞 | 浮遊細胞 | |
| ウェルあたりの細胞数 | 1 × 4 | 1 × 4 |
| ウェルあたりの細胞懸濁液+薬 | 3.4前に削除するに100μlの、 | 25μlの、削除されない |
| 還元型グルタチオンの溶解試薬 | 50μlの | 25μlの |
| 酸化型グルタチオン溶解試薬 | 50μlの | 25μlの |
| ルシフェリン生成試薬 | 50μlの | 50μlの |
| ルシフェリン検出試薬 | 100μlの | 100μlの |
4。代表的な結果：
カルボキシ- H2DCFDA色素を用いてROSの図1検出 。 H 2 O 2で処理したJurkat細胞（ヒト白血病細胞株）の非処理細胞と比較した。 ROSは、H 2 O 2処理した細胞は、酸化を区別しない染料と非で染色対照のピーク（と比較してO 2処理した細胞は、シフトフローサイトメトリーによって検出される緑色蛍光を発するカルボキシ- H 2 DCFDAの変更、H 2の蛍光ピークを誘導カルボキシ- H 2 DCFDAで染色処理した細胞）。結果は、処理した細胞ではROSの存在を確認する。
図2検出OF NOグリース試薬を使用して。 RAW 264.7細胞（マウスマクロファージ）はLPSとIL - 4で処理した。重要なNO産生増加は、未処理の細胞をコントロールと比較して処理した細胞で検出された。
| 細胞株 | 無処理 | 治療 |
| RAW 264.7 | 13.0 | 8.3 |
| A549 | 21.6 | 10.5 |
| Jurkat細胞 | 5.2 | 2.8 |
ROSの表1検出は、タンパク質の酸化を仲介 。 RAW 264.7細胞はLPS、Jurkat細胞及びA549（ヒト肺癌）で処理した細胞は、H 2 O 2で処理した。結果は、比減少（GSH）/酸化（GSSG）グルタチオンのように表される。グルタチオン（GSH）/（GSSG）の低い比率は、に比べて処理した細胞で検出された未処理の細胞を制御し、タンパク質がより多くの処理した細胞で酸化されたことを明らかにする。
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Discussion
このような炎症性疾患、がん、虚血/再灌流を行い、そして、放射線や化学療法などの治療法として、いくつかの病的状態は（すなわちシスプラチン）ROSの過剰産生を誘導する。従って、ROSレベルを検出および測定することは、多くの基本的な、前臨床および臨床研究において重要である。しかし、ROSは非常に短い半減期を持っていると検出するために複雑にすることができます。ここで、我々は、哺乳動物細胞におけるフリーラジカル産生の検出に日常的に使用されると広く受け入れられている簡単なテストを提案する。
染料を使用して検出プロトコルは、実験者はROSの存在を評価するために様々な広く利用可能なメソッド（例えば、顕微鏡、フローサイトメトリー、プレートリーダー等...。など）を使用することができます。フローサイトメトリーや顕微鏡は細胞の生存とヌル、低、および高いROS産生細胞の割合に関する情報を提供しています。顕微鏡は、細胞の形態と細胞接着に対するROSの影響に関する情報を提供します。板のRを使用して検出eadersは、主に定量的な情報が可能になります。グリースによるNOの検出は、定量的ではないが研究、細胞の形状や密着性に関する情報を提供していません。 NOの検出には、マウスの細胞では比較的簡単です。しかし、より少量のNOはヒトサンプルで発見されている、それは検出手順の各ステップではさらに慎重になるとコントロールを含めることが重要です。タンパク質の酸化の検出は、研究細胞が産生するすべてのROSの総効果を調査し、ここで得られた信号の強度は、生成されるROSの量を表します。 H 2 O 2の効果の検出は、それが非常に急速にカタラーゼで除去されるため注意が必要です。 GSH - GSSG -グローアッセイは直接GSSGを検出する能力を持ってそれはない抽出と、そしてより少ない細胞の試料上で直接実行されるため、このアッセイは、酸化の問題を最小限に抑えることができます。 GSH / GSSGの測定値を改善するために、HBSS溶液またはグルタチオン血清培地（例えばDMEMなど）がよいでしょう。無血清培地での作業は、さらに読書が向上します。同様に、細胞（組織のタイプ、通常の対病理学的組織）、単層細胞培養のコンフルエンシー、活性化やストレスの状態、年齢（通路の数）の性質を含むいくつかの要因ということを覚えておくことが重要です。あなたの細胞の増殖速度は、ROSの産生に影響を与えるので。
ROSの検出に使用されるほとんどの試薬は、光、酸素、そして温度変化の影響を受けやすくなっています、それは実験者がテストされ、かつ迅速に作業を実行するすべての試薬およびサンプルの保管及び使用のために特別な注意を使用しているため、非常に重要です。
染料を使用して、各実験には、ROS産生/検出用のコントロールとして未処理にロードなど（無色素）、（無薬剤）未治療の無負荷時のような適切な管理、およびアンロード処理された細胞が含まれている必要があります。フェノールレッドを含まない培地を使用すると、蛍光色素（例えばカルボキシとの干渉を低減しますYH 2 DCFDA、CM - H 2 DCFDA）。これらの実験を開始する前に、それはこのプロトコルに適応するために、薬剤/治療のと未処理の細胞の自然蛍光を確認することが重要です。蛍光色素を使用して細胞を読み込む前にまたはセルに適用される持続時間（分/時間対数日）、治療（薬、虚血/再灌流、機械的ストレス）の種類に応じて、治療後に行われる必要があります。 ROSを検出するために必要な染料の濃度は、細胞の種類や細胞の活性化の状態によって異なりますができます。私たちのアドバイスが10μMと100μMの色素濃度から始めることです、染色の毒性と有効性を確認してから、実験に使用する最適な用量を決定するために濃度を減少させる。
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Disclosures
我々は、このパブリケーションのPromega社の支援を受けた。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（CA142664）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
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