Summary
Aqui nós propor métodos simples para testar e avaliar a presença de espécies reativas de oxigênio nas células.
Abstract
Espécies reativas de oxigênio incluir um número de moléculas que danificam o DNA e RNA e oxidar proteínas e lipídios (peroxydation lipídica). Estas moléculas reativas de oxigênio contêm um e incluem H 2 O 2 (peróxido de hidrogênio), NO (óxido nítrico), O 2 - (ânion óxido), peroxinitrito (ONOO -), ácido hydrochlorous (HOCl) e radical hidroxila (OH -) .
Espécies oxidativas são produzidos não apenas em situações patológicas (câncer, reperfusão isquêmica /, patologias neurológicas e cardiovasculares, doenças infecciosas, doenças inflamatórias 1, doenças auto-imunes 2, etc ...), mas também em situações fisiológicas (não patológicas), tais como o metabolismo celular 3 , 4. De fato, ROS desempenham um papel importante em muitas vias de sinalização celular (proliferação, ativação de células 5, 6, 7 migração etc.). ROS pode ser prejudicial (então é referido como"Stress oxidativo e nitrosativo") quando produzida em quantidades elevadas nos compartimentos intracelulares e células geralmente respondem a ROS por upregulating antioxidantes como a superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa (GSH), que protege convertendo-los perigosos radicais livres em moléculas inofensivas (água, por exemplo). Vitaminas C e E também têm sido descritos como scavengers ROS (antioxidantes).
Os radicais livres são benéficos em pequenas quantidades 3. Macrófagos e neutrófilos mediada por resposta imune envolvem a produção e liberação de NO, que inibe vírus, patógenos e da proliferação do tumor 8. NO também reage com ROS outros e, assim, também tem um papel como um desintoxicante (scavenger ROS). Finalmente NO age em navios para regular o fluxo de sangue que é importante para a adaptação do músculo ao exercício prolongado 9, 10. Várias publicações têm demonstrado também que ROS estão envolvidas na sens insulinaitivity 11, 12.
Vários métodos para avaliar a produção de ROS estão disponíveis. Neste artigo, propomos vários ensaios simples, rápido e acessível, estes ensaios têm sido validados por muitas publicações e são usados rotineiramente para detectar ROS ou dos seus efeitos em células de mamíferos. Embora alguns desses ensaios detectar múltiplas ROS, outros detectam apenas um único ROS.
Protocol
1. Detecção de ROS usando carboxi-H 2 DCFDA
Carboxi-H 2 DCFDA não é fluorescente, mas na presença de ROS, quando este reagente é oxidado, torna-se verde fluorescente.
- Imediatamente antes da utilização, prepare uma solução estoque fresca de DCFDA 2 carboxi-H em dimetilsulfóxido estéril (DMSO) ou etanol 100%. Evite descongelar múltiplos / congelar os ciclos de sua tintura.
- Lavar as células com tampão HEPES solução de sal (HBSS) ou tampão fosfato (PBS) para remover os vestígios do meio original.
- Carregar as células com o corante (dye eo controle, cf seção de nota). Neste ensaio usamos Jurkat, uma linha de células humanas de leucemia. Use carboxi-H 2 DCFDA em uma concentração final de 1 Hm em meio de cultura com soro normal reduzida (2%).
- Incubar as culturas por 30 minutos no escuro, em uma incubadora convencional (37 ° C, 5% de CO2). Descartar todas as soluções de corante não utilizados.
- Remover carboxi-H 2 DCFDA contendo meio e lavar duas vezes com HBSS ou PBS. A partir deste passo em frente, proteger as células da luz.
- Adicione meio fresco contendo sua droga de escolha para o carboxi-H 2 DCFDA células-carregados e incubar conforme desejado. Para este exemplo, usamos H 2 O 2 (0,03%) por 1 hora.
- Avaliar ROS por analisar imediatamente suas células por citometria de fluxo através do canal de FL1 (fluorescência verde), ou pelo leitor de placas de fluorescência, ou por microscopia de fluorescência. A fluorescência pode ser detectada por meio de excitação e emissão comprimentos de onda que são apropriadas para fluorescência verde.
Nota: Os controlos devem incluir carboxi-H 2 DCFDA-carregado células não tratadas e imaculada células não tratadas. Carboxi-H 2 DCFDA é conhecido por detectar peróxidos mas também pode ser oxidado pelo ROS outros. Este reagente também pode ser modificado por outros meios, a oxidação de corante controle insensível como a 5 - (e-6)-carboxi-2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetato (carboxi-DCFDA) deve ser incluído no teste.
2. Medição da produção de óxido nítrico (NO)
Você vai precisar de sulfanilamida e N-1-napthylethylenediamine dicloridrato (NED) soluções e padrão de nitrito. Este ensaio é chamado de ensaio de Griess.
NED solução: faça uma solução de 0,1% do N-1-napthylethylenediamine dicloridrato diluída em solução estéril water.Sulfanilamide: Faça uma solução de 1% sulfanilamida diluídos em ácido fosfórico 5%. Padrão de nitrito: Diluir o padrão de nitrito de sódio 0,1 M de ações para 100μM em meio estéril, fazer uma diluição em série no mesmo meio.
Condições de armazenamento: Loja de produtos químicos, conforme indicado pelo fabricante à temperatura ambiente. Quando reconstituído, NED e soluções Sulfanilamida são armazenados imediatamente após o uso, a 4 ° C, no escuro, e por um máximo de 3 meses.
- Cultura de células em um prato de 96 poços,use triplicatas para cada condição, e incluem controles adequados de acordo com suas experiências.
- Tratar células para induzir a produção de NO. Em nosso experimento utilizamos lipopolissacarídeo (LPS) (100 ng / ml) e IL-4 recombinante para o tratamento de nossas células. Neste protocolo, foram utilizados 264,7 RAW, um rato linha de células de macrófagos (Mouse linhagem de células leucêmicas monócitos macrófagos).
- No dia do ensaio, colocar ambos os reagentes à temperatura ambiente.
- Girar seu prato, colher sobrenadantes de células e transferência 50μl para uma placa de 96 novas também. Prepare limitando poços de diluição da solução estoque padrão para fazer uma curva padrão.
- Adicionar 50μl de solução de sulfanilamida a cada amostra e controle bem e misture bem.
- Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos no escuro.
- Adicionar 50μl de N-1 napthylethylenediamine solução de dicloridrato de cada amostra e controle bem e misture bem.
- Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos no escuro.
- Medida absorbance imediatamente, usando um leitor de placas com filtro de comprimentos de onda entre 520nm e 550nm.
Se você utilizar diferentes placa / prato tamanhos, use 1/1/1 volume para cada solução e sobrenadante da amostra.
A cor violeta vai aparecer nos poços positivos. Resultados obtidos com o padrão irá ajudá-lo a verificar a estabilidade de suas soluções.
3. Detecção de ROS ação: proteínas oxidadas
Um método diferente para identificar a produção de ROS é olhar para os resultados finais, detectando a oxidação de proteínas. De fato, ROS modificar glutationa, um antioxidante que é expresso na maioria das células e desempenha um papel protetor contra ROS. Após a oxidação por ROS, modificação da glutationa reduzida (GSH) os resultados do grupo (tiol) sulfidrila de sua cisteína estar ligada a uma segunda glutationa através de uma ponte dissulfeto. Isso leva à formação de uma proteína dimerizada (GSSG proteína oxidada). GSH pode ser restaurada através de modificação de GSSG pela glutationa reductase da enzima. O aumento da relação GSSG / GSH reflete o estresse oxidativo. O ensaio a seguir é baseado na detecção e quantificação destas proteínas oxidadas. Este método não é seletivo para ROS específicos, mas sim detectar os efeitos do NO, H 2 O 2, O 2 - e outras ROS. Aqui medimos a quantidade total de oxidada (GSSG) e reduzida (GSH) a glutationa usando sinais bioluminescente.
- Semente de suas células em uma placa de 96 poços (branco / transparente, fundo plano), como de costume. Para nosso experimento, foi utilizado 1x10 4 células por poço de aderentes Raw 264,7 e A549 e células Jurkat suspensão. Dependendo do tamanho de suas células, estes números podem ser ajustados. Recomendamos para as células placa aderente um dia antes do teste para permitir que eles atribuem ao prato. Suficiente poços devem estar preparados para a detecção da proteína oxidada e reduzida, bem como para "apenas médio" ecélulas não tratadas como controle. Use triplicatas para todas as condições.
- Tratar as células com o seu medicamento para o tempo necessário. Aqui nós tratamos as células Jurkat e células A549 por 1h com H 2 O 2 (a 5mM e 2,5 mm, respectivamente). Raw 264,7 células foram tratadas com 200ng/ml de LPS por 16 h. Durante este tempo de incubação, trazer todos os seus reagentes à temperatura ambiente (RT). Faça todos os reagentes não mais que 30 minutos antes de realizar o teste. A tabela abaixo mostra os volumes de reagentes por poço. Quando possível, é importante para remover a mídia que contém o agente redutor antes de prosseguir com o teste.
| Células aderentes | Células em suspensão | |||
| Lise Glu totais | Oxidado Lise Glu | Lise Glu totais | Oxidado Lise Glu | |
| NEM, 25mm | nenhum | 0.5μl | nenhum | 0.5μl |
| Luciferina-NT | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| Tampão de Lise passiva, 5X | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| Água destilada | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| Volume final por poço | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- Remova o meio de poços com células aderentes. Não remova o meio de poços com células em suspensão.
- Adicionar reagente de lise glutationa reduzida ou reagente de lise glutationa oxidada correspondentes aos poços e agitar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Adicionar o reagente geração luciferina e incubate por 30 minutos em temperatura ambiente.
- Adicione o reagente de detecção Luciferina e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Leia o sinal bioluminescente no tempo de integração de 0,25-1 segundo por bem utilizar um leitor de placas luminômetro.
| Células aderentes | Células em suspensão | |
| Número de células por poço | 1x10 4 | 1x10 4 |
| Suspensão celular por drogas + bem | 100 l, para ser removido antes de 3,4 | 25μl, para não ser removido |
| Reagente de Lise glutationa reduzida | 50 ul | 25μl |
| Reagente de Lise Glutationa oxidada | 50 ul | 25μl |
| Luciferina Reagente Generation | 50 ul | 50 ul |
| Luciferina Reagente de Detecção | 100 l | 100 l |
4. Resultados representativos:
Detecção figura 1 do ROS usando carboxi-H2DCFDA corante. Células Jurkat (linhagem de células humanas de leucemia) tratados com H 2 O 2 foram comparados com os não tratados células. ROS induz a modificação de DCFDA 2 carboxi-H que fluoresce verde como detectada por citometria de fluxo, o pico fluorescentes em H 2 O 2 células tratadas mudança em comparação com os picos nos controles (H 2 O 2 células tratadas marcadas com corante de oxidação insensível e não tratados com células coradas com DCFDA 2 carboxi-H). Resultados confirmam a presença de ROS em células tratadas.
Figura 2 Detecção de of NO utilizando reagentes Griess. RAW 264,7 células (mouse macrófagos) foram tratados com LPS e IL-4. Um aumento significativo na produção de NO foi detectada em células tratadas em relação ao controle de células não tratadas.
| Linhagens de células | Não tratados | Tratado |
| Raw 264,7 | 13,0 | 8,3 |
| A549 | 21,6 | 10,5 |
| Jurkat | 5,2 | 2,8 |
Detecção tabela 1 de ROS mediada oxidação de proteínas. RAW 264,7 células foram tratadas com LPS, Jurkat e A549 (câncer de pulmão humano), as células foram tratadas com H 2 O 2. Os resultados são expressos como a razão reduzida (GSH) / oxidada (GSSG) glutationa. Rácios mais baixos de glutationa (GSH) / (GSSG) foram detectados em células tratadas em comparação comcontrole de células não tratadas, revelando que as proteínas foram mais oxidado em células tratadas.
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Discussion
Várias situações patológicas como doenças inflamatórias, câncer, isquemia / reperfusão, e também tratamentos como a radioterapia ou quimioterapia (cisplatina ou seja) induzem a superprodução de ROS. Assim, a detecção e medição dos níveis de ROS é importante em muitos básica, estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, ROS têm semi-vidas muito curtas e pode ser complicado de detectar. Aqui, propomos testes simples que são usados rotineiramente e amplamente aceites para a detecção de produção de radicais livres em células de mamíferos.
Protocolos de detecção utilizando corantes permitem que o pesquisador usar vários métodos amplamente disponíveis (como a microscopia, citometria de fluxo, etc ... leitor de placas.) Para avaliar a presença de ROS. Citometria de fluxo e microscopia de fornecer informações sobre a viabilidade celular ea porcentagem de células nulas, baixa e alta produção de ROS. Microscopia também fornece informações sobre os efeitos do ROS na morfologia celular e adesão celular. Detecção utilizando r placaeaders permite que a informação em sua maioria quantitativos. NO detecção por Griess é quantitativa, mas não fornece qualquer informação sobre a forma ou a adesão das células estudadas. NO detecção é relativamente simples em células de camundongos. No entanto, menores quantidades de NO são encontrados em amostras humanas, por isso é importante para ser ainda mais cuidadoso em cada etapa do processo de detecção e de incluir controles. Detecção de oxidação de proteínas investiga os efeitos totais de todos os ROS produzida pelas células estudadas, aqui a intensidade do sinal obtido representa a quantidade de ROS produzidos. A detecção de H 2 O 2 efeitos é mais complicado, pois é muito rapidamente eliminado por catalase. O ensaio de GSH-GSSG-Glo tem a capacidade de detectar GSSG diretamente, este ensaio minimizar os problemas de oxidação, pois é realizada diretamente em amostras sem extração e com poucas células. Para melhorar leituras GSH / GSSG, a solução HBSS ou glutationa livre de mídia (como DMEM) deve ser preferida;trabalhar com soro mídia livre vai melhorar ainda mais a leitura. É importante ter em mente que vários fatores, incluindo a natureza das células (tipo de tecido, tecidos normal versus patológico), a confluência da monocamada de cultura de células, o status de ativação e estresse, a idade (número de passagens), bem como a taxa de proliferação de suas células terão um efeito sobre a produção de ROS.
A maioria dos reagentes utilizados para detecção de ROS são suscetíveis a mudanças de luz, oxigênio e temperatura, é fundamental que o pesquisador utiliza um cuidado especial para armazenamento e uso de todos os reagentes e amostras a serem testadas, e executar a obra rapidamente.
Cada experimento usando corantes deve incluir controles adequados, tais como não tratada (sem drogas), descarregados (sem corante), carregado tratada, e descarregados células tratadas como controles para a produção de ROS / detecção. Usando meio sem vermelho de fenol vai reduzir a interferência com corantes fluorescentes (ou seja, carboxYH 2 DCFDA, CM-H 2 DCFDA). Antes de iniciar essas experiências, é importante verificar a fluorescência natural do seu medicamento / tratamento e de suas células não tratadas para se adaptar a esse protocolo. Carregando suas células com o corante fluorescente deve ser feito antes ou depois de tratamentos dependendo da duração (minutos / horas versus vários dias) e tipo de tratamento (drogas, isquemia / reperfusão, estresse mecânico) que será aplicado para as células. A concentração de corante necessários para detectar ROS podem variar dependendo do tipo celular e sobre o estado de activação das células. Nosso conselho é começar com as concentrações de corante de 10μM e 100μM, para verificar a toxicidade e eficácia da coloração, e em seguida reduzir a concentração para determinar a melhor dose a utilizar para seus experimentos.
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Disclosures
Recebemos o apoio da Promega para esta publicação.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (CA142664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
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