Summary
Här föreslår vi enkla metoder för att testa och utvärdera förekomsten av reaktiva syreradikaler i cellerna.
Abstract
Reaktiva syreradikaler omfattar ett antal molekyler som skadar DNA och RNA och oxiderar proteiner och lipider (lipid peroxydation). Dessa reaktiva molekyler innehåller en syre och inkluderar H 2 O 2 (väteperoxid), NO (kväveoxid), O 2 - (oxid anjon), peroxynitrit (ONOO -), hydrochlorous syra (HOCl) och hydroxylradikaler (OH -) .
Oxidativ arter produceras inte bara under patologiska situationer (cancer, ischemisk / reperfusion, neurologiska och hjärt sjukdomar, infektionssjukdomar, inflammatoriska sjukdomar 1, autoimmuna sjukdomar 2, osv ...) men även under fysiologiska (icke-patologiska) situationer såsom cellulär metabolism 3 , 4. Ja, ROS spelar viktiga roller i många cellulära signalvägar (proliferation, cell aktivering 5, 6, migration 7 osv.). ROS kan vara skadligt (är det då kallas"Oxidativ och nitrosative stress") vid produktion i stora mängder i de intracellulära fack och celler svarar i allmänhet på ROS med upregulating antioxidanter som superoxiddismutas (SOD) och katalas (CAT), glutation peroxidas (GPx) och glutation (GSH) som skyddar dem genom att omvandla farliga fria radikaler till ofarliga molekyler (t.ex. vatten). Vitamin C och E har också beskrivits som ROS renhållare (antioxidanter).
Fria radikaler är bra i små mängder 3. Makrofager och neutrofiler-medierade immunsvar omfattar produktion och frisättning av NO, som hämmar virus, patogener och tumörer spridning 8. NO reagerar även med andra ROS och därmed också har en roll som en detoxifier (ROS renhållare). Slutligen INGEN verkar på fartyg för att reglera blodflödet vilket är viktigt för anpassning av muskeln att långvarig träning 9, 10. Flera publikationer har också visat att ROS är inblandade i insulin Sensitivity 11, 12.
Många metoder för att utvärdera ROS-produktionen finns. I denna artikel kommer vi att föreslå flera enkel, snabb och prisvärd analyser, dessa analyser har validerats av många publikationer och används rutinmässigt för att upptäcka ROS eller dess effekter i däggdjursceller. Medan några av dessa analyser upptäcka om flera ROS, andra känner bara en enda ros.
Protocol
1. Upptäckt av ROS använda karboxi-H 2 DCFDA
Karboxyterminerad H 2 DCFDA är icke-fluorescerande, men i närvaro av ROS, när detta reagens oxideras, blir det grönt fluorescerande.
- Omedelbart före användning, förbereda en ny stamlösning av karboxi-H 2 DCFDA i sterila dimetylsulfoxid (DMSO) eller 100% etanol. Undvik att flera tina / frysa cykler av din färg.
- Tvätta cellerna med HEPES buffrad saltlösning (HBSS) eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna spår av den ursprungliga medium.
- Ladda cellerna med färgen (och kontroll färg, se not avsnitt). I denna analys använde vi Jurkat, en mänsklig leukemi cellinje. Använd karboxi-H 2 DCFDA till en slutlig koncentration av 1μM i regelbundna odlingsmedium med nedsatt serum (2%).
- Inkubera kulturerna i 30 minuter i mörkret, i en konventionell kuvös (37 ° C, 5% CO2). Kassera alla oanvända dye-lösningar.
- Ta bort karboxi-H 2 DCFDA med medelhög och tvätta två gånger med HBSS eller PBS. Från denna steg framåt, skyddar dina celler från ljus.
- Lägg till nya medium som innehåller dina droger till karboxi-H 2 DCFDA-laddade celler och inkubera som önskat. För detta exempel använder vi H 2 O 2 (0,03%) i 1 timme.
- Bedöm ROS genom att omedelbart analysera dina celler med flödescytometri med FL1 kanal (grön fluorescens), eller genom fluorescens plattläsaren, eller genom fluorescensmikroskopi. Fluorescensen kan detekteras med hjälp av upphetsning och emissionsvåglängder som är lämpliga för grön fluorescens.
Obs: Kontroller bör innehålla karboxi-H 2 DCFDA-laddad obehandlade celler och ofärgade obehandlade celler. Karboxyterminerad H 2 DCFDA är känt för att upptäcka peroxider, men kan också oxideras av andra ROS. Detta reagens kan också ändras på annat sätt, oxidation okänslig kontroll färgämne som 5 - (och-6)-karboxi-2 ', 7'-dikloroanilinofluorescein diacetat (karboxi-DCFDA) bör därför ingå i testet.
2. Mätning av kväveoxid (NO) produktion
Du behöver Sulfanilamide och N-1-napthylethylenediamine dihydroklorid (NED) lösningar, och nitrit standard. Denna analys kallas Griess analysen.
NED lösning: Gör en 0,1% lösning av N-1-napthylethylenediamine dihydroklorid utspätt i steril water.Sulfanilamide lösning: Gör en 1% lösning av sulfanilamide utspädd i 5% fosforsyra. Nitrit Standard: Späd den 0,1 miljoner standarden nitrit lager natrium till 100μM i sterila medium, gör en seriell utspädning i samma medium.
Förvaring: Förvara kemikalier enligt anvisningar från tillverkaren i rumstemperatur. Efter beredning är NED och lösningar Sulfanilamide lagras omedelbart efter användning vid 4 ° C, i mörker, och för högst 3 månader.
- Kultur celler i ett 96 brunnar,använder tre exemplar för varje tillstånd, och inkluderar riktiga kontroller enligt dina experiment.
- Behandla celler att inducera ingen produktion. I vårt experiment använder vi lipopolysackarid (LPS) (100 ng / ml) och rekombinant IL-4 för att behandla våra celler. I detta protokoll använde vi RAW 264,7, en mus makrofag cellinje (Mouse leukemiska monocyt makrofagcellinjer cellinje).
- På dagen för analysen, ta med både reagenser till rumstemperatur.
- Snurra din tallrik, samla cell supernatanterna och överföra 50μl till en ny platta med 96 brunnar. Förbered begränsa utspädningen brunnar din standard stamlösning för att göra en standardkurva.
- Tillsätt 50μl av Sulfanilamide lösning till varje prov och kontroll väl och blanda väl.
- Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter i mörker.
- Tillsätt 50μl av N-1-napthylethylenediamine dihydroklorid lösning till varje prov och kontroll väl och blanda väl.
- Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter i mörker.
- Mät absorbaNCE omedelbart med en tallrik läsare med filter av våglängder mellan 520nm och 550nm.
Om du använder annan tallrik / skål storlekar använder 1/1/1 volymen för varje lösning och prov supernatanten.
En violett färg kommer att synas i positiva brunnar. Resultat som erhållits med standard hjälper dig att kontrollera stabiliteten hos dina lösningar.
3. Upptäckt av ROS insatser: oxiderade proteiner
En annan metod för att identifiera produktionen av ROS är att titta på slutresultatet genom att upptäcka oxidation av proteiner. I själva verket spelar ROS ändra glutation, en antioxidant som uttrycks i de flesta celler och en skyddande roll mot ROS. Efter oxidation av ROS, modifiering av reducerat glutation (GSH) resultat i sulfhydryl (thiol) grupp av cystein är kopplat till en andra glutation via en disulfide bro. Detta leder till bildandet av en dimeriserade protein (oxiderad protein GSSG). GSH kan återställas genom modifiering av GSSG av enzymet glutation reduktas. Ökningen i GSSG / GSH förhållande speglar oxidativ stress. Följande analys är baserad på detektion och kvantifiering av dessa oxiderade proteiner. Denna metod är inte selektiva för specifika ROS, utan snarare känner av effekterna av NO, H 2 O 2, O 2 - och andra ROS. Här mäter vi den totala mängden oxiderat (GSSG) och minskad (GSH) glutathione med självlysande signaler.
- Seed dina celler i ett 96 brunnar (vit / transparent, platt botten) som vanligt. För vårt experiment använde vi 1x10 4 celler per bra för anhängare Raw 264,7 och A549 celler och fjädring celler Jurkat. Beroende på storleken på dina celler dessa siffror kan justeras. Vi rekommenderar att plattan anhängare celler dagen före testet så att de kan fästa på plattan. Tillräckligt brunnar bör vara redo för oxiderat och reducerat protein upptäckt samt för "medium bara" ochobehandlade celler som kontroller. Använd tre exemplar för alla förhållanden.
- Behandla dina celler med ditt läkemedel för den tid som krävs. Här har vi behandlat Jurkat celler och A549 celler för 1h med H 2 O 2 (vid 5 mm och 2,5 mm respektive). Raw 264,7 celler behandlades med 200ng/ml av LPS för 16 h. Under denna inkubationstid samla alla dina reagenser till rumstemperatur (RT). Gör alla reagenser inte mer än 30 minuter innan du utför testet. Tabellen nedan visar mängden reagens per brunn. Om möjligt är det viktigt att ta bort det medium som reduktionsmedel innan du fortsätter med testet.
| Vidhäftande celler | Fjädring celler | |||
| Totalt Glu Lysis | Oxiderad Glu Lysis | Totalt Glu Lysis | Oxiderad Glu Lysis | |
| NEM, 25mm | Ingen | 0.5μl | Ingen | 0.5μl |
| Luciferin-NT | 1 l | 1 l | 1 l | 1 l |
| Passiv lyseringsbuffert, 5X | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| Destillerat vatten | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| Slutliga volymen per brunn | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- Ta bort mediet från brunnar med tillhörande celler. Ta inte bort medium i brunnar med fjädring celler.
- Lägg till reducerat glutation lyseringsreagenset eller oxiderat glutation lyseringsreagenset till motsvarande brunnar och skaka i 5 minuter i RT.
- Tillsätt luciferin generationen reagens och incubate för 30 minuter vid RT.
- Tillsätt luciferin upptäckt reagens och inkubera i 15 minuter vid RT.
- Läs självlysande signal vid integrering tidpunkten för 0,25-1 sekund per brunn med en luminometer plattläsaren.
| Vidhäftande celler | Fjädring celler | |
| Cell nummer per brunn | 1x10 4 | 1x10 4 |
| Cellsuspension per brunn + drog | 100 l, tas bort innan 3,4 | 25μl, inte tas bort |
| Reducerat glutation lyseringsreagenset | 50 l | 25μl |
| Oxideras Glutation lyseringsreagenset | 50 l | 25μl |
| Luciferin Generation Reagens | 50 l | 50 l |
| Luciferin Detection Reagens | 100 l | 100 l |
4. Representativa resultat:
Figur 1 Upptäckt av ROS använda karboxi-H2DCFDA färgämne. Jurkat celler (mänskliga leukemi cellinje) behandlas med H 2 O 2 jämfördes med icke-behandlade celler. ROS inducerar ändring av karboxi-H 2 DCFDA som fluorescerar i grönt som upptäcks genom flödescytometri, den fluorescerande topp i H 2 O 2 behandlade cellerna förskjutning jämfört med topparna i kontrollerna (H 2 O 2 behandlade cellerna färgas med oxidation okänslig färg och icke -behandlade celler som färgats med karboxi-H 2 DCFDA). Resultaten bekräftar förekomsten av ROS i behandlade cellerna.
Figur 2 Detection of NO med Griess reagenser. RAW 264,7 celler (mus makrofag) behandlades med LPS och IL-4. En betydande ökade i NO produktion upptäcktes i behandlade cellerna jämfört med kontrollgruppen obehandlade celler.
| Cellinjer | Icke-behandlade | Behandlade |
| Raw 264,7 | 13,0 | 8,3 |
| A549 | 21,6 | 10,5 |
| Jurkat | 5,2 | 2,8 |
Tabell 1 Upptäckt av ROS medierad oxidation av proteiner. RAW 264,7 celler behandlades med LPS, Jurkat och A549 (mänskliga lungcancer) var celler som behandlats med H 2 O 2. Resultaten uttrycks som kvoten minskat (GSH) / oxiderad (GSSG) glutation. Lägre kvoter av glutation (GSH) / (GSSG) upptäcktes i behandlade cellerna jämfört medkontroll obehandlade celler, och avslöjar att proteinerna var mer oxideras behandlade cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera patologiska situationer som inflammatoriska sjukdomar, cancer, ischemi / reperfusion och även behandlingar som strålning och kemoterapi (t.ex. cisplatin) inducera ROS överproduktion. Således, att upptäcka och mäta ROS nivåer är viktigt i många grundläggande, prekliniska och kliniska studier. Men ROS har mycket korta halveringstider och kan vara komplicerat att upptäcka. Här föreslår vi enkla tester som rutinmässigt används och allmänt accepterade för detektion av produktionen av fria radikaler i däggdjursceller.
Detection protokollen använda färgämnen låta försöksledaren använda olika allmänt tillgängliga metoder (t.ex. mikroskopi, flödescytometri, plattläsaren etc ....) För att bedöma förekomsten av ROS. Flödescytometri och mikroskopi ge information om cellernas livskraft och procent av null, låg och hög ROS celler. Mikroskopi ger också information om effekterna av ROS på cellmorfologin och celladhesion. Detektering med hjälp av plåt readers låter mestadels kvantitativ information. INGEN upptäckt av Griess är kvantitativ men ger inte någon information om form eller vidhäftning av de studerade celler. INGEN upptäckt är relativt enkelt i musceller. Men lägre mängder av NO finns i prover från människa, är det därför viktigt att vara ännu mer noggrann vid varje steg i att upptäcka förfarandet och att inkludera kontroller. Detektion av protein oxidation undersöker den totala effekterna av alla ros som produceras av de studerade celler, här intensiteten i den erhållna signalen representerar den mängd ROS produceras. Detektion av H 2 O 2 effekterna är svårare eftersom det är mycket snabbt elimineras av katalas. Den GSH-GSSG-Glo analys har förmågan att upptäcka GSSG direkt, denna analys att minimera problemen med oxidation eftersom den görs direkt på prover utan brytning, och med färre celler. För att förbättra GSH / GSSG avläsningar, HBSS lösning eller glutation-fria medier (till exempel DMEM) är att föredra;arbeta med serum fria medier kommer att ytterligare förbättra läsning. Det är viktigt att komma ihåg att flera faktorer, inklusive vilken typ av celler (vävnadstyp, normal kontra patologiska vävnader), den confluency av cellslager cellodling, aktivering och stress status, ålder (antal passager), samt som spridning bland dina celler kommer att ha en effekt på produktionen av ROS.
De flesta reagens som används för ROS upptäckt är känsliga för ljus, syre och temperatur förändringar, det är därför viktigt att försöksledaren använder särskild omsorg för lagring och användning av alla reagenser och prover som skall testas, och utföra arbetet snabbt.
Varje experiment med färgämnen bör innehålla ordentliga kontroller som obehandlade (utan droger), last (ingen färg), laddad obehandlad, och lossas behandlade cellerna som kontroller för ROS-produktion / upptäckt. Använda medium utan fenolrött kommer att minska störningar med fluorescerande färgämnen (dvs. carboxYH 2 DCFDA, CM-H 2 DCFDA). Innan du börjar dessa experiment är det viktigt att kontrollera den naturliga fluorescens av din drog / behandling och av dina obehandlade celler att anpassa sig till detta protokoll. Laddar dina celler med fluorescerande färg bör göras före eller efter behandlingar beroende på hur länge (minuter / timmar kontra flera dagar) och typ av behandling (läkemedel, ischemi / reperfusion, mekanisk stress) som ska tillämpas till cellerna. Koncentrationen av färgämnet som krävs för att upptäcka ROS kan variera beroende på celltyp och på aktiveringsstatus av cellerna. Vårt råd är att börja med färg koncentrationer av 10μM och 100μM, kontrollera toxicitet och effekt för färgning och sedan minska koncentrationen för att bestämma den bästa dosen att använda för dina experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi fick stöd av Promega för denna publikation.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (CA142664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
- Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
- Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
- Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
- Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
- Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
- Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).
