Summary
Her vil vi foreslå enkle metoder for å teste og evaluere tilstedeværelsen av reaktive oksygen arter i cellene.
Abstract
Reaktive oksygen arter omfatter en rekke molekyler som skader DNA og RNA og oksidere proteiner og lipider (lipid peroxydation). Disse reaktive molekylene inneholder en oksygen og inkluderer H 2 O 2 (hydrogenperoksid), NO (nitrogenoksid), O 2 - (oksid anion), peroxynitrite (ONOO -), hydrochlorous syre (HOCl), og hydroksylradikalet (OH -) .
Oksidativt arter er produsert ikke bare under patologiske situasjoner (kreft, iskemisk / reperfusjon, nevrologiske og kardiovaskulære sykdommer, smittsomme sykdommer, inflammatoriske sykdommer 1, autoimmune sykdommer 2, osv. ...) men også i løpet av fysiologiske (ikke-patologiske) situasjoner som cellenes stoffskifte 3 , 4. Faktisk ROS spille viktige roller i mange cellulære signalveier (spredning, celle aktivering 5, 6, 7 migrasjon etc..). ROS kan være skadelig (det er da referert til som"Oksidativt og nitrosative stress") når produsert i store mengder i den intracellulære rom og celler responderer generelt til ROS ved upregulating antioksidanter som superoxide dismutase (SOD) og katalase (CAT), glutationperoksidase (GPX) og glutation (GSH) som beskytter dem ved å konvertere farlige frie radikaler til ufarlige molekyler (dvs. vann). Vitamin C og E har også blitt beskrevet som ROS scavengers (antioksidanter).
Frie radikaler er gunstig i lave mengder 3. Macrophage og nøytrofile-medierte immunresponser involverer produksjon og frigjøring av NO, som hemmer virus, patogener og tumor spredning 8. NO reagerer også med andre ROS og dermed også har en rolle som detoxifier (ROS scavenger). Endelig NO virker på fartøy å regulere blodstrøm som er viktig for tilpasning av muskelen til langvarig trening 9, 10. Flere publikasjoner har også vist at ROS er involvert i insulin Sensitivity 11, 12.
Utallige metoder for å evaluere ROS produksjonen er tilgjengelig. I denne artikkelen foreslår vi flere enkle, raske og rimelige analysene, og disse analysene har blitt validert av mange publikasjoner og blir rutinemessig brukt til å oppdage ROS eller dets virkninger i mammalske celler. Mens noen av disse analyser oppdage flere ROS, andre oppdage bare en enkelt ROS.
Protocol
1. Påvisning av ROS bruke karboksy-H 2 DCFDA
Karboksy-H 2 DCFDA er ikke-fluorescerende men i nærvær av ROS, når dette reagenset er oksidert, blir det grønne fluorescerende.
- Umiddelbart før bruk, utarbeide en frisk stamløsning av karboksy-H 2 DCFDA i sterile Dimetylsulfoksid (DMSO) eller 100% etanol. Unngå flere tine / fryse sykluser av fargestoff din.
- Vask cellene med HEPES bufret salt-løsning (HBSS) eller fosfat-bufret saltvann (PBS) for å fjerne spor av den opprinnelige medium.
- Legg celler med fargestoff (og kontroll fargestoff, jf. note seksjon). I denne analysen brukte vi Jurkat, en human leukemi cellelinje. Bruk karboksy-H 2 DCFDA ved en endelig konsentrasjon på 1μM i vanlige kultur medium med redusert serum (2%).
- Inkuber kulturer i 30 minutter i mørket, i en vanlig inkubator (37 ° C, 5% CO2). Kast alle ubrukte dye løsninger.
- Fjern karboksy-H 2 DCFDA inneholder medium og vask to ganger med HBSS eller PBS. Fra dette skritt fremover, beskytte cellene mot lys.
- Legg frisk medium som inneholder ditt foretrukne narkotiske stoffet til karboksy-H 2 DCFDA-loaded celler og inkuber som ønsket. For dette eksempelet bruker vi H 2 O 2 (0,03%) i 1 time.
- Vurdere ROS ved umiddelbart å analysere cellene ved flowcytometri bruke FL1 kanalen (grønn fluorescens), eller ved fluorescens plateavleseren, eller ved fluorescens mikroskopi. Fluorescens kan oppdages ved hjelp av eksitasjon og emisjon bølgelengder som er aktuelle for grønn fluorescens.
Merk: Styrer bør inkludere karboksy-H 2 DCFDA-loaded ubehandlet celler og unstained ubehandlet celler. Karboksy-H 2 DCFDA er kjent for å oppdage peroksider, men kan også bli oksidert av andre ROS. Denne reagensen kan også endres på annen måte, oksidasjon ufølsom kontroll fargestoff som 5 - (og-6)-carboxy-2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetat (karboksy-DCFDA) bør derfor inkluderes i testen.
2. Måling av nitrogenoksid (NO) produksjon
Du trenger Sulfanilamide og N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride (NED) løsninger, og Nitritt standard. Denne analysen kalles Griess analysen.
NED løsning: Lag en 0,1% løsning av N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride fortynnet i sterile water.Sulfanilamide løsning: Lag en 1% løsning av sulfanilamide fortynnet i 5% fosforsyre. Nitritt Standard: Fortynn 0.1m standard lager natriumnitritt til 100μM i sterile medium, gjør en seriell fortynning i samme medium.
Lagervilkårene: Oppbevares kjemikalier som anvist av produsenten ved romtemperatur. Når rekonstituert er NED og Sulfanilamide løsninger lagres umiddelbart etter bruk ved 4 ° C, i mørket, og for maksimalt 3 måneder.
- Kultur celler i en plate med 96 brønner,bruk triplicates for hver tilstand, og omfatter skikkelig kontroller i henhold til eksperimentene dine.
- Unn celler for å indusere ingen produksjon. I vårt eksperiment bruker vi lipopolysakkarid (LPS) (100 ng / ml) og rekombinant IL-4 skal behandle våre celler. I denne protokollen, brukte vi 264,7 RAW, en mus macrophage cellelinje (mus leukemiske monocytt macrophage cellelinje).
- På dagen av analysen, bringe både reagenser til romtemperatur.
- Spin tallerkenen din, samle celle supernatants og overføre 50μl til en ny plate med 96 brønner. Forbered begrense fortynning brønner på din standard stamløsningen å lage en standard kurve.
- Legg 50μl av Sulfanilamide Solution til hver prøve og styre godt og bland godt.
- Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter i mørket.
- Legg 50μl av N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride løsning for hver prøve og styre godt og bland godt.
- Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter i mørket.
- Mål absorbaNCE umiddelbart ved hjelp av en plate leseren med filter av bølgelengder mellom 520nm og 550nm.
Dersom du benytter forskjellige plate / parabol størrelser, bruk 1/1/1 volum for hver løsning og prøve supernatant.
En fiolett farge vises i positive brønner. Resultater oppnådd med standarden vil hjelpe deg å sjekke stabiliteten på dine løsninger.
3. Påvisning av ROS handling: oksidert proteiner
En annen metode for å identifisere produksjonen av ROS er å se på sluttresultatet ved å registrere oksidasjon av proteiner. Faktisk spiller ROS modifisere glutation, en antioksidant som er uttrykt i de fleste celler og en beskyttende rolle mot ROS. Etter oksidasjon av ROS, modifisering av redusert glutation (GSH) resultater i sulfhydryl (tiol) gruppe av cystein at det blir knyttet til en annen glutathione via en disulfide bro. Dette fører til dannelsen av en dimerized protein (oksidert protein GSSG). GSH kan gjenopprettes via modifisering av GSSG av enzymet glutation reduktase. Økningen i GSSG / GSH ratio reflekterer oksidativt stress. Den følgende analysen er basert på påvisning og kvantifisering av disse oksidert proteiner. Denne metoden er ikke selektiv for spesifikke ROS men registrerer effekten av NO, H 2 2 O, O 2 - og andre ROS. Her har vi måler den totale mengden av oksidert (GSSG) og redusert (GSH) glutation bruker bioluminescent signaler.
- Seed dine celler i en 96 godt plate (hvit / gjennomsiktig, flat bunn) som vanlig. For vårt eksperiment, vi brukte 1x10 4 celler per brønn for heftende Raw 264,7 og A549 celler og suspensjon Jurkat celler. Avhengig av størrelsen på cellene disse tallene kan justeres. Vi anbefaler å plate tilhenger celler dagen før test for å tillate dem å feste til platen. Nok brønnene bør være forberedt på oksidert og redusert protein påvisning samt for "medium only" ogubehandlet celler som kontroller. Bruk triplicates for alle forhold.
- Unn cellene dine med narkotika for ønsket tid. Her har vi behandlet Jurkat celler og A549 celler for 1t med H 2 O 2 (ved 5 og 2,5 henholdsvis). Raw 264,7 celler ble behandlet med 200ng/ml av LPS i 16 h. I løpet av denne inkubasjonstid, bringe alle dine reagenser til romtemperatur (RT). Gjør alle reagenser ikke mer enn 30 minutter før du utfører testen. Tabellen nedenfor viser volumer av reagenser per brønn. Når det er mulig, er det viktig å fjerne media inneholder reduksjonsmiddel før du fortsetter med testen.
| Tilhenger celler | Suspensjon celler | |||
| Total Glu Lysis | Oksidert Glu Lysis | Total Glu Lysis | Oksidert Glu Lysis | |
| NEM, 25mm | ingen | 0.5μl | ingen | 0.5μl |
| Luciferin-NT | 1 mL | 1 mL | 1 mL | 1 mL |
| Passive Lysis Buffer, 5X | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| Destillert vann | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| Endelig volum per brønn | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- Fjern medium fra brønner med tilhenger celler. Ikke fjern medium i brønner med suspensjon celler.
- Legg redusert glutation Lysereagens eller oksidert glutation Lysereagens til tilsvarende brønner og rist i 5 minutter ved RT.
- Tilsett Luciferin generasjon reagens og incubate for 30 minutter ved RT.
- Tilsett Luciferin deteksjon reagens og inkuberes i 15 minutter ved RT.
- Les bioluminescent signal på integrasjon tid 0,25 til 1 sekund per brønn med plateavleseren luminometer.
| Tilhenger celler | Suspensjon celler | |
| Celle nummer per brønn | 1x10 4 | 1x10 4 |
| Cellesuspensjon per brønn + narkotika | 100 mL, skal fjernes før 3.4 | 25μl, for ikke å bli fjernet |
| Redusert glutation Lysereagens | 50 mL | 25μl |
| Oksidert Glutathione Lysereagens | 50 mL | 25μl |
| Luciferin Generation Reagens | 50 mL | 50 mL |
| Luciferin Detection Reagens | 100 mL | 100 mL |
Fire. Representant Resultater:
Figur 1 Påvisning av ROS bruke karboksy-H2DCFDA fargestoff. Jurkat celler (human leukemi cellelinje) behandlet med H 2 O 2 ble sammenlignet med ikke-behandlede celler. ROS induserer endring av karboksy-H 2 DCFDA at fluoresces grønt som oppdaget av flowcytometri, den fluorescerende topp i H 2 O 2 behandlede cellene skift sammenlignet med toppene i kontrollgruppen (H 2 O 2 behandlede cellene farget med oksidasjon ufølsom fargestoff og ikke -behandlede cellene farget med karboksy-H 2 DCFDA). Resultatene bekrefter tilstedeværelsen av ROS i behandlede celler.
Figur 2 Detection of NO bruke Griess reagenser. RAW 264,7 celler (mus macrophage) ble behandlet med LPS og IL-4. En betydelig økning i NO produksjonen ble oppdaget i behandlede celler sammenlignet med kontrollgruppen ubehandlet celler.
| Cellelinjer | Non-behandlet | Behandlet |
| Raw 264,7 | 13,0 | 8.3 |
| A549 | 21,6 | 10,5 |
| Jurkat | 5.2 | 2.8 |
Tabell 1 Påvisning av ROS mediert oksidasjon av proteiner. RAW 264,7 celler ble behandlet med LPS, Jurkat og A549 (human lungekreft) celler ble behandlet med H 2 O 2. Resultatene er uttrykt som forholdet reduseres (GSH) / oksidert (GSSG) glutation. Lavere forholdstall på glutation (GSH) / (GSSG) ble oppdaget i behandlede celler i forhold tilkontroll ubehandlet celler, avslørte at proteiner var mer oksidert i behandlede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere patologiske situasjoner som inflammatoriske sykdommer, kreft, iskemi / reperfusjon, og også behandlinger som stråling eller kjemoterapi (dvs. cisplatin) induserer ROS overproduksjon. Dermed oppdage og måle ROS nivåer er viktig i mange grunnleggende, pre-kliniske og kliniske studier. Men ROS har svært korte halveringstider og kan være komplisert å oppdage. Her foreslår vi enkle tester som blir rutinemessig brukt og allment akseptert for påvisning av frie radikaler i mammalske celler.
Detection protokoller bruke fargestoffer la eksperimentator bruke ulike allment tilgjengelige metoder (som mikroskopi, flow cytometri, plateavleseren etc ....) Å vurdere tilstedeværelsen av ROS. Flow cytometri og mikroskopi gi informasjon om celleviabilitet og prosent av null, lav og høy ROS produserende celler. Mikroskopi gir også informasjon om effekten av ROS på celle morfologi og celle adhesjon. Detection bruker plate readers gjør det meste kvantitativ informasjon. NO påvisning av Griess er kvantitativ, men gir ikke noen informasjon om formen eller vedheft av cellene studert. NO deteksjon er relativt enkelt i mus celler. Imidlertid lavere mengder NO finnes i humane prøver, er det derfor viktig å være enda mer forsiktig på hvert trinn i deteksjon prosedyren og å inkludere kontroller. Påvisning av protein oksidering undersøker den samlede effekten av alle ROS produsert av studeres cellene, her intensiteten på signalet innhentet representerer mengden ROS produsert. Påvisning av H 2 O 2 effekter er trickier som det er svært raskt elimineres ved katalase. Den GSH-GSSG-Glo analysen har evnen til å oppdage GSSG direkte, denne analysen minimere problemene oksidering fordi det utføres direkte på prøvene uten utvinning, og med færre celler. For å forbedre GSH / GSSG opplesninger, HBSS løsning eller glutation-frie medier (som DMEM) bør foretrekkes;arbeider med serum frie medier vil ytterligere forbedre lesing. Det er viktig å huske på at flere faktorer, inkludert innholdet i cellene (vevet type, normal versus patologisk vev), den confluency av monolayer cellekultur, aktivering og stress status, alder (antall passasjer), samt som spredning rate av cellene dine vil ha en effekt på produksjonen av ROS.
Mest reagenser brukt til ROS deteksjon er utsatt for lys, oksygen, og temperaturendringer, det er derfor avgjørende at eksperimentator bruker spesiell omsorg for lagring og bruk av alle reagenser og prøver å bli testet, og utføre arbeidet raskt.
Hvert eksperiment ved hjelp av fargestoffer bør omfatte skikkelig kontroller som ubehandlet (ikke legemiddel), losses (ingen fargestoff), lastet ubehandlet, og losses behandlet celler som kontroller for ROS produksjon / deteksjon. Bruker medium uten fenol rødt vil redusere interferens med fluorescerende fargestoffer (dvs. carboxYH 2 DCFDA, CM-H 2 DCFDA). Før du starter disse eksperimentene, er det viktig å sjekke den naturlige fluorescens av narkotika / behandling og av ubehandlet celler til å tilpasse seg denne protokollen. Laster cellene dine med fluorescerende fargestoff bør gjøres før eller etter behandlinger avhengig av varighet (minutter / timer versus flere dager) og type behandling (medikamenter, iskemi / reperfusjon, mekanisk stress) som vil bli brukt til cellene. Konsentrasjonen av fargestoff som kreves for å oppdage ROS kan variere avhengig av celletype og på aktivering status av cellene. Vårt råd er å starte med fargestoff konsentrasjoner av 10μM og 100μM, sjekk for giftighet og effekt av flekker, og deretter redusere konsentrasjonen å bestemme den beste dosen for å bruke for eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi fikk støtte fra Promega for denne publikasjonen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (CA142664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | control |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Nitrite standard | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | To quantify oxidized, reduced or oxidized/reduced glutathione |
References
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
- Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
- Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
- Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
- Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
- Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
- Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).
