Summary
ونحن نقدم دليلا عمليا لتقديم استشفاف
Abstract
ويتم تنظيم الدوائر العصبية في الخرائط الطوبوغرافية وظيفية. من أجل تصور مجمع الدوائر العمارة وضعنا نهجا لموثوق تسمية الزخرفة العالمية للتوقعات طبوغرافية متعددة. المخيخ هو نموذج مثالي لدراسة الترتيب المنظم للدوائر العصبية. على سبيل المثال ، فقد أثبتت منظمة compartmental من ألياف المطحلب السبيل النخاعي ليكون نظاما لا غنى عنه لدراسة المطحلب الزخرفة الألياف. نحن أظهرت مؤخرا والتي يمكن استخدامها القمح الجرثومية راصة (WGA) مترافق لاليكسا 555 و 488 لتعقب السبيل النخاعي التوقعات الألياف المطحلب في البلدان النامية والفئران الكبار (وآخرون Reeber. 2011). تم العثور على ثلاث خصائص رئيسية تجعل WGA - أدوات اليكسا استشفاف مرغوب فيه لوصفها التوقعات العصبية. الأولى ، هي fluorophores اليكسا مكثفة لمعانها ويسمح للتصوير wholemount مباشرة بعد البحث عن المفقودين. الثانية ، WGA - اليكسا استشفاف تسمية مسار كامل لتطوير والعصبية projectio الكبارنانوثانية. وتنقل بسرعة الثالثة ، WGA - اليكسا استشفاف في الاتجاهين الوراء وتقدمي. هنا ، نحن تصف بالتفصيل كيفية تحضير الأدوات اللازمة استشفاف وغيرها ، وكيفية إجراء عملية جراحية لتعقب السبيل النخاعي وأفضل السبل لتتبع صورة التوقعات في ثلاثة أبعاد. باختصار ، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة البحث عن المفقودين التي ستكون مفيدة للفك رموز التنظيم والاتصال من الخرائط الفنية ليس فقط في المخيخ ولكن أيضا في القشرة ، الدماغ ، والحبل الشوكي.
Protocol
1. تقديم استشفاف في الجسم الحي باستخدام الجراحة المعقمة (الأقسام 1،1-1،16)
في جميع أنحاء الإجراء فإننا ننصح أن يتم استخدام معيار التقنيات الجراحية المعقمة. وهذا يشمل استخدام قفازات معقمة ، وثوب ، وقناع. وينبغي إما أن تكون أدوات تعقيمها قبل استخدامها أو تنظيفها بالماء ثم الايثانول. أثناء الجراحة ، وخصوصا بين الحيوانات ، وأجزاء الأنسجة النظيفة قبالة الأدوات والصكوك تعقيم جاف مع حبة تعقيم الساخن (250 Steri القط # 18000-45 ، أدوات العلوم الجميلة). بالإضافة إلى ذلك ، فمن الأهمية بمكان أن تقوم بتنظيم مجال عملك بحيث يكون لديك مناطق محددة لإعداد الحيوانية (حلق الخ) ، والجراحة ، واسترداد منطقة حيث يمكن رصدها بسهولة على الحيوان ، حرارة ، ومزودة المسكنات حسب الحاجة. المفتاح لعملية جراحية ناجحة هو البقاء على قيد الحياة للحد من خطر الإصابة والحفاظ على العدوانية استراتيجية الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية. يرجى الرجوع إلى الجدول حيث يمكنك زعنفةد جميع ما يلزم من معدات والكواشف لهذا البروتوكول.
- تخدير الفئران البالغين مع آفيرتين الطازجة (2،2،2 - ثلاثي بروم إيثانول ، سيغما ، سانت لويس MO ؛ القط # T48402) عن طريق حقنة (IP) داخل الصفاق مع جرعة من وزن الجسم 0.2ml/10grams. المسكنات الأخرى مثل isoflurane أو الكيتامين / زيلازين فعالة بنفس القدر ولكن تأكد من أن المختبر الخاص بك يحتوي على الموافقات المطلوبة المؤسسية والاتحادية قبل الاستخدام. إذا كنت تستخدم الجراء (P0 -- P10) يمكنك تخدير لهم على الثلج المجروش لمدة 10-15 دقيقة. تأكد من أن كل جلد الجرو ليست على اتصال مباشر مع الجليد (على سبيل المثال ، عن طريق وضعها في أصابع من القفازات المطاطية) ، والماء البارد سوف يؤدي بسرعة إلى مستوى قاتلة من انخفاض حرارة الجسم. تأكد من أن الحيوان تحت التخدير عادي مقبول من قبل تنفيذ قرصة أخمص القدمين أو الأصابع مع ملقط لالكفوف الحيوانات الخلفيتين. إذا كان هناك منعكس دواسة ، انتظر حتى الحيوانات لا تستجيب لهذا التحفيز كمؤشر أعمقعادي من التخدير.
- بمجرد تخدير الحيوان هو تماما مع وضع الجانب الظهري حتى على شاش معقم مع رئيسها تواجه بعيدا عنك وذيله يواجه نحو لكم. حلق الشعر الفراء مع كليبرز من أجل إعطاء نفسك حقل واضحة الجراحية التي اسعة بما يكفي للوصول إلى الجهاز العصبي المركزي. مسح منطقة حلق مع مجموعتين من مناديل الكحول ، ثم 70 ٪ كحول / betadine ، ونظيفة ثم مرة أخرى مع مناديل الكحول. استخدام داخل لنمط دائري خارج عند تنظيف المنطقة الجراحية. قد اخترت لترسيم بوضوح مجال عملك الجراحية عن طريق قطع ثقب صغير في شاش معقم ووضعه على افتتاح موقعك الجراحية حلق ونظيفة. وإن كان من الممكن الحفاظ على الميدان الجراحية المعقمة تكون خادعة عندما تعمل على الحيوانات الصغيرة ، وبذلك سوف يساعد على التقليل من خطر العدوى.
- رفع الجلد باستخدام ملقط وجعل شق بالمقص في خط الوسط مباشرة فوق أقل ص الصدري العلوي القطنيegion. يمكن التعرف على خفض الصدري المنطقة العلوية المنطقة القطنية بواسطة تشغيل إصبعك على طول فقرات ليشعر لحدبة في العمود الفقري (الشكل 1).
- قطع اللفافة والعضلات الشوكي سطحية. إذا لزم الأمر ، ووقف أي نزيف من قبل كيها الأوعية الدموية (أدوات العلوم الجميلة ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ؛ القط # 18000-00). في الجراء ، وتطبيق ضغط لطيف حول شق مع مسحات القطن كافية لوقف النزيف.
- إجراء استئصال الصفيحه الظهرية بإزالة العمليات الشائكة واحد أو اثنين من قطاعات أقل الصدري -- الحبل الشوكي القطني العلوي بعد قطع الصفيحة على جانبي العمود الفقري في منتصف الطريق ، العمود المفصلي بين عملية وعملية الظهرية الشوكية (الشكل 2) . يجب الحرص على عدم تلف النخاع الشوكي مع المقص الخاص وإزالة دائما شظايا العظام الصغيرة لأنها يمكن أن الممزقة في الحبل الشوكي. علما بأن ليس في العمود الفقري في وقت مبكر بعد الولادة الجراء المتحجرة تماما ، مما يعني أن العظام هي جدايمكن قطع ناعمة وبسهولة بالغة. لذا ، يجب الحرص على عدم قطع عميق جدا كما قد يؤدي إلى تلف في النخاع الشوكي.
- إذا كنت تفضل عدم إجراء استئصال الصفيحة الفقرية الظهرية في فئران بالغة ، وجدنا أنه يمكنك قطع الأنسجة اللينة بين شرائح الفقري للكشف عن منطقة صغيرة من الحبل الشوكي دون أي قطع العظام. على الرغم من كل الأساليب والطرق الفعالة للدخول في النخاع الشوكي ، ويمكن تجنب استئصال الصفيحه الظهرية ضمان أن يبقى الحبل الشوكي التالفة.
- ملء الزجاج الكهربائي وسحبت (البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية ؛ القط # 300056 ، جهاز هارفارد ، Holliston ، MA ؛ زجاج مزدوج المرحلة Micropipette بولير من طراز 001 - Narishige PC - 10) مع التتبع باستخدام حقنة ميكرومتر (0.2mL ؛ Gilmont آلات القط # GS - 1100) أو ما يعادل جهاز التسليم.
- تشديد microelectrode الزجاج في مكانه على micromanipulator وإدراج القطب 0.1 - 0.5mm الى المنطقة السفلى الصدري القطني العلوي من الحبل الشوكي في منتصف الطريق بين أواسطسطر والحافة الجانبية للنخاع الشوكي. ويمكن عقد هذا الحيوان في جهاز التجسيمي لتحديد دقيق لمواضع الحقن والحيوان لتحقيق الاستقرار (صغير الحيوان الصك النموذجي التجسيمي 940 ألف والقطب النموذجي مناور 960 من الأجهزة Kopf). بدلا من ذلك ، إذا كان يمكن تكييف النظام الخاص مخدر لتحقيق طائرة ثابتة دون تحركات كبيرة بسبب التنفس العميق ، وتسجيل الحيوانات برفق إلى أسفل تكفي.
- ضغط حقن في الحبل الشوكي أكثر من 3-5 دقائق تقريبا 0.5μl حل 2 ٪ من WGA - اليكسا 488 (القمح الجرثومية راصة ، اليكسا فلور 488 المتقارن ؛ القط # W11261 ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، WGA - 555 اليكسا (القمح الجرثومية راصة ، اليكسا فلور 555 المتقارن ؛ القط # W32464 ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، WGA - اليكسا 350 (القمح الجرثومية راصة ، اليكسا فلور 350 المتقارن ؛ القط # W11263 ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، WGA - HRP (القمح الجرثومية بيروكسيداز الفجل راصة ؛ سيغما ، وسانت لويس ، MO القط # L7017) أو 0.5μl 10 ٪BDA (biotinylated ديكستران أمين ؛ القط # D1956 ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS ، سيغما ، وسانت لويس ، MO ؛ القط # P4417). ضخ هذه الكميات من استشفاف النتائج في وضع العلامات على عدد كبير من الألياف. أصغر وحدات التخزين يجب أن يتم حقنها لاستهداف أصغر نواة (أو مناطق فرعية من النوى الفردية) ولكل محقق أن تحدد تجريبيا حجم مثالي لتسليم. وينبغي النظر في الرحلان الشاردي للتسليم نانولتر دقيقة لحقن دقيقة. نحن عادة تكملة جميع الحلول التتبع السريع مع الأخضر 0.5 ٪ (سيغما ، وسانت لويس ، MO ؛ القط # F7252) لتصور بقعة الحقن أثناء الجراحة.
- نضيف 1μl من زيت الذرة (سيغما ، وسانت لويس ، MO ؛ القط # C8267) إلى كل من حل 10μl BDA قبل الحقن لمنع الخليط من الالتصاق على جدران ماصات انسحبت. إذا كان لديك مشكلة في إخراج التتبع من ماصة ، يتراجع ببطء غيض لخلق جيب صغير في النسيج ثم حاول مرة أخرى عن طريق الحقن.ليس من غير المألوف بالنسبة للطرف microelectrode لتسد. في معظم الحالات الجيب يساعد أيضا إنشاء خزان من الخلايا العصبية المحيطة التي يمكن أن تمتص في التتبع. تذكر دائما أن إخراج التتبع ببطء لتجنب تلف الأنسجة الضخمة في محيط إبرة الخاص.
- إغلاق الجلد بلطف مع مقاطع الجرح والأنسجة الغراء. بدلا من ذلك ، يمكنك استخدام الغرز لإغلاق الجرح.
- مع ملاحظة أن الممارسة العملية الجراحية ، على الأقل حتى هذه النقطة ، يمكن أن تكتمل في أقل من 20 دقيقة.
- وضع الحيوان في غرفة الإنعاش (Vetcare غرفة طراز 9.16.0 القط # 340508 من جهاز هارفارد) على لوحة التسخين (التدفئة القط الوسادة. # 341241 جهاز من جامعة هارفارد) لتجنب انخفاض حرارة الجسم وتسريع الانتعاش. بدلا من ذلك ، يمكنك استخدام واحدة من العديد من يجعل ونماذج من غرف التدفئة. رصد معدل التنفس والتحقق من دلائل على أن هذا الحيوان هو محاولة للتحرك. معظم الحيوانات وعادة ما تكون استجابة في غضون 10-15 دقيقة بعد الجراحة.
- وتنقل بسرعة WGA - اليكسا 555 ، WGA - اليكسا 488 ، وWGA HRP في الخلايا العصبية ، ونحن قد وجدت أن في كل الفئران في وقت مبكر بعد الولادة والبالغين المتقارن اليكسا استشفاف مساحات بقوة تسمية الألياف طويلة في غضون 24 ساعة (Reeber وآخرون 2011) . كما WGA - 350 اليكسا نقلها بسرعة على الرغم من أن مقارنة مع غيرها من الأصباغ اليكسا صورتها تعتمد بشكل كبير على نوعية وحساسية من مجموعات التصفية (لا تظهر البيانات ؛ Reeber وآخرون 2011) BDA عادة ما يتطلب أوقات أطول بقاء لتتبع بشكل كامل التوقعات العصبية ، وبالتالي لرسم خرائط كاملة من التوقعات السبيل النخاعي الحيوانات سيكون من الضروري التضحية بعد حوالي 11 يوما.
2. اكتشاف ألياف المطحلب تتبع anterogradely
- بعد فترات بقاء كل منها تخدير الفئران مع AVERTIN (أو مخدر المفضل لديك).
- مرة واحدة لا توجد ردود الفعل يجب أن يتم مسح الدم عبر القلب perfusing مع PBS 0.1M (pH7.2). ثم ، إصلاح الأنسجة التي perfusing الحيوان مع بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني. بالإضافة إلى المناطق التي سيتم تحليلها ، فمن الضروري دائما للحصول على نسيج من موقع الحقن لتحليل استعادي كبير لكيفية الحقن كان ، مؤشرا على مدى الضرر الناجم عن الأنسجة القطب ، وتحديد العلامات الممكنة في الألياف المرور (الشكل 3 ، وانظر Mesulam ، 1982 ؛. Reeber آخرون 2011).
- POSTFIX في غرفة واحدةاهلية ت من الفئران perfused عن 24-48 ساعة في PFA 4 ٪ ثم cryoprotect لهم في حلول السكروز مخزنة المخفف في برنامج تلفزيوني (15 ٪ لساعات 2 ~ أو حتى البواليع الأنسجة إلى أسفل الحاوية ومن ثم 30 ٪ بين عشية وضحاها أو حتى الأنسجة البواليع). ثم تتم إزالة أنسجة من السكروز ، ومست بلطف الجاف مع مناشف ورقية ثم ومنغمسين في قالب الأنسجة التي تحتوي أكتوبر (درجة الحرارة المثلى للقطع ؛ ساكورا Finetech الولايات المتحدة الأمريكية المؤتمر الوطني العراقي ، CA). ثم يتم تجميد الأنسجة باستخدام المجمد -80 درجة مئوية وتخزينها في نفس درجة الحرارة حتى إلى قطع جاهزة لها.
- وfluorophores اليكسا مرئية مباشرة بعد وضع العلامات ولا تتطلب تلطيخ إضافية. لذلك ، يمكن أن تقطع بعد نضح النسيج WGA - اليكسا تتبعها والتي شنت من أجل التصوير أو تصويرها مباشرة في PFA 4 ٪ تمهيدا wholemount. وجدنا أن التصوير في الأنسجة 4 ٪ PFA أعطى أفضل معامل الانكسار للتصوير تضاريس التوقعات تتبع في wholemounts. لأبواب ، وقطع سميكة المسلسل كورون 40μmالمقاطع القاعدة على ناظم البرد وجمع بأنها حرة عائمة المقاطع في برنامج تلفزيوني. نظرا لسمية PFA ، وضمان أن يلبس قناع an المناسبة أثناء الارواء والتصوير ، وإبقاء منطقة جيدة التهوية ، وعندما لا تكون قيد الاستعمال العودة فورا عن أي PFA أو أنسجة PFA الثابتة في حاويات مختومة. وهو مثالي إذا كان موجودا في المجهر الخاص مغطى الوجه الدخان مناسبة.
- ويمكن كشف ألياف WGA - HRP صفت به tetramethylbenzidine (TMB) باعتبارها مولد اللون. نحن لن تصف البروتوكول تلطيخ HRP هنا منذ سبق وصفها بالتفصيل (فوغل وPrittie 1994 ؛. Sillitoe وآخرون 2010)
- BDA للألياف النسيج المسمى احتضان المقاطع التعويم الحر لمدة 2 ساعة في Streptavidin - CY3 (الفئة # 434315 ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) أو Streptavidin اليكسا - 488 أو 555 فلور (الفئة # S11223 ل488 و القط # S21381 لل 555 ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، في برنامج تلفزيوني ويغسل ثم جبل مع GEL - الفلوري. لDAB والمقاطع بين عشية وضحاها في احتضان الأنسجة العازلة رد فعل المؤسسة (الفئة # PK - 4000 ، والخامسector المختبرات ، وشركة بورلنجام ، كاليفورنيا) ، وشطف 3 مرات في برنامج تلفزيوني وبعد ذلك رد فعل لمدة 5-10 دقائق في DAB (0.5mg/ml ، مختبرات شركة ناقلات ، بورلنجام ، كاليفورنيا) تستكمل مع 10μl 30 ٪ H 2 O 2 لكل حل DAB 50ml.
3. المناعية
- وقد أجريت خارج المناعية كما هو موضح سابقا (Sillitoe وآخرون 2008). لفترة وجيزة ، في احتضان أقسام الأنسجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 0.1M NGS 10 ٪ (م و ع ؛ سيغما ، سانت لويس MO) ، 0.1 ٪ توين - 20 والأجسام المضادة الأولية (انظر أدناه) عن 16-18 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل أقسام الأنسجة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني واحتضان ثم لهم في الأضداد الثانوية (انظر أدناه) لمدة أقصاها 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. شطف الأنسجة وتكشف مرة أخرى تفاعلية مناعية على النحو المبين أدناه.
- لتحديد العلاقة بين الخلايا والألياف بركينيي المطحلب اشتركنا في المسمى الحرة العائمة أقسام الأنسجة باستخدام الأساليب التقليدية لتلطيخ مزدوجة. استخدمنا WGA - 555 اليكساللبحث عن المفقودين واليكسا 488 حمار مترافق المضادة للأضداد الفأر الثانوية (Invitrogen / المسابر الجزيئية ، وشركة كارلسباد ، كاليفورنيا) للكشف عن ZebrinII (1:250 ؛ هدية عينية من الدكتور ريتشارد هوكس ، جامعة كالجاري ، كالجاري ، كندا). ZebrinII هو الأضداد وحيدة النسيلة الفأر ، وكان يستخدم مباشرة من قضى ورم هجين مستنبت. استخدمت fluorophore الأجسام المضادة الثانوية مترافق في التخفيف من 1:1500. وشنت بعد تلوين الأنسجة المقاطع على الشرائح الزجاجية واتهم coverslipped ثم مع GEL - الفلوري في تريس العازلة (الكترون العلوم الميكروسكوب ، هاتفيلد ، والسلطة الفلسطينية) أو مع تصاعد Vectashield hardset المتوسطة مع دابي (الفئة # H - 1200 ، المتجهات مختبرات ، بورلنجام ، كاليفورنيا) للون التصوير الثلاثي مضان.
- نحن اختبار خصوصية الأجسام المضادة الثانوية من خلال تجهيز الفروع الأنسجة في غياب الأجسام المضادة الأولية. تم الكشف عن عدم وجود إشارة في تجارب مثل هذه السيطرة ، مشيرا الى ان تلطيخ لاحظنا لم يكن بسبب اشارات غير محدد من اله اليكسا ، مترافق الأضداد (لا تظهر البيانات).
4. المجهري وتحليل البيانات
- نحن التقاط photomicrographs من المقاطع باستخدام الأنسجة لايكا DFC360 FX (مضان) وDFC490 (DAB ، وكان رد فعل TMB أقسام الأنسجة) كاميرات مثبتة على مجهر DM5500 ايكا.
- علينا اكتساب وتحليل الصور والمقاطع باستخدام الأنسجة لايكا ايكا التطبيق Suite وتطبيق البرامج حزم FX جناح.
- يتم التقاطها من Photomicrographs wholemounts باستخدام كاميرا لايكا FX DFC3000 شنت على stereomicroscope ايكا ايكا FA MZ16 تشغيل تطبيقات البرمجيات FX جناح.
- تم تجهيز كل من المجاهر لدينا مع CY3 ايكا (طراز # 11600231) وFITC (طراز # 11513880) مرشحات ، وDM5500 مع A4 إضافية دابي / الأشعة فوق البنفسجية مرشح (نموذج # 11504162).
- يتم الحصول على الصور بعد الأمثل لتحت / التعرض المفرط كما هو محدد باستخدام برنامج لايكا. نحن استيراد جميع البيانات الخام إلى أدوبي فوتوشوب CS4 ، وإذا ث اللازمةه تصحيح الحقل بأكمله من كل صورة لوالحدة النقيض من ذلك ، أو مستويات السطوع فقط. ويمكن استخدام برامج تحرير الصور الأخرى كما المفضل.
- كانت ترسم الخطط المعروضة هنا في Adobe Illustrator CS4.
- وكانت واليكسا 555 CY3 الخلايا العصبية الملون ، والتي يتم الكشف عنها بالحمرة باستخدام مرشحات لدينا الزائفة ، أرجواني اللون في الصور المعروضة في جميع أنحاء المخطوطة.
الحيوانات
أجريت جميع الدراسات الحيوانية في إطار بروتوكول الحيوان IACUC الموافقة عليه وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية في كلية ألبرت اينشتاين للطب. وقد حافظت الذكور والإناث outbred السويسرية وبستر (Taconic ، ألباني ، نيويورك) أو C57BL6J الفطرية (JAX ، بار هاربور ، الشرق الأوسط) في الفئران لدينا مستعمرة واستخدامها في كل الدراسات. واعتبر ظهر اليوم تم الكشف عن المكونات المهبلية اليوم الجنينية 0.5.
5. ممثل النتائج :
afferents السبيل النخاعي في إنهاء parasagittal العصابات في المخيخ (الشكل 3 ؛ Voogd وآخرون 1969 ؛. Grishkat وEisenman 1995 ؛ فوغل وPrittie 1994 ؛ فيغ وآخرون 2005 ؛ وتطبيقات هوكس عام 2009 ؛ Sillitoe وآخرون 2010 ؛. Reeber وآخرون 2011). نحن حقن WGA - اليكسا استشفاف في أقل الحبل الشوكي الصدري العلوية القطنية لإثبات : 1) التي يمكن أن تستخدم هذه التسمية لاستشفاف باستمرار مجموعات فرعية محددة من المحطات في المخيخ (الشكل 3 ؛ Reeber وآخرون 2011) ، 2). أن WGA - اليكسا استشفاف مشرقة بشكل مكثف ، ويمكن استخدامها لتصور النمط العام لتضاريس الألياف المطحلب في مخيخات كامل (الشكل 3 ؛. Reeber وآخرون 2011) ، 3) التي يمكن استخدامها WGA - اليكسا 488 و 555 في تركيبة لتتبع مسارات متعددة في نفس الحيوان (الشكل 4) ، و 4) أن WGA - اليكسا استشفاف متوافقة مع تلطيخ المناعى (الشكل 5). في الأعمال الأخيرة أظهرت لنا أن WGA - اليكسا تسمية المحطات استشفاف في المخيخ في أقرب وقت 6 ساعات بعد تسليم التتبع في الحبل الشوكي ويتم اختيار ممتاز لتتبع architectur(ه) من مسارات النامية (Reeber وآخرون ، 2011).
الشكل 1. إعداد المعدات اللازمة لتقديم استشفاف في الجسم الحي. A. يمكن تحديد صورة منطقتنا الجراحية. باء السفلي والعلوي الصدري المنطقة القطنية بواسطة تشغيل أصابعك على طول فقرات ليشعر لحدبة في العمود الفقري. ينبغي أن يقوم على استئصال الصفيحه ظهري تقريبا في منتصف "سنام" ، والتي دلت على السهم الأصفر.
الشكل 2 توضيحات من انخفاض الصدر --... الجزء العلوي الفقري القطني قبل وبعد استئصال الصفيحه الظهرية تخطيطي ألف قطعة an الفقري سليمة من الخشب في المنطقة السفلى الصدري العلوي من العمود الفقري الماوس ألف باء dorsaيتم تنفيذ ل الثقب عن طريق إزالة العمليات الشائكة واحد أو اثنين من قطاعات الفقري ، وبعد قطع منتصف الطريق بين عملية الصفيحة المفصلية وعملية الظهرية الشوكية.
الشكل 3. WGA - اليكسا استشفاف مشرقة بشكل مكثف ، ويمكن استخدامها لتصور وارد في قرار إسقاط التضاريس العالية. أ التخطيطي يوضح منشأ وإنهاء WGA - 555 اليكسا الخلايا العصبية المسماة السبيل النخاعي. باء صورة من موقع الحقن بعد القاء WGA - اليكسا 555 الى المنطقة السفلى الصدري القطني العلوي من النخاع الشوكي للبالغين. جيم صورة Wholemount لل الفصيصات الأمامية بعد حقن WGA - اليكسا 555 الى المنطقة السفلى الصدري القطني العلوي من الحبل الشوكي. D. WGA - 555 تقدمي اليكسا تتبع الجهاز السبيل النخاعي يكشف عن عصابات من الألياف المطحلب كما رأينا على التعاونرونالد الأنسجة المقطع. يتم تعريف فصيصات بواسطة الأرقام والأعداد الرومانية تسمية نطاقات الألياف المطحلب على جانبي خط الوسط (وهذا ينطبق على جميع الصور). أشرطة النطاق : B ، C 500 ميكرون ، 500 ميكرون D ، و 200 ميكرون.
الشكل 4. WGA - اليكسا استشفاف وفعالة لوضع العلامات العصبية مسارات متعددة في نفس الحيوان. ألف Wholemount التخطيطي للمخيخ الماوس تلخص النمط العام لفرق السبيل النخاعي الألياف المطحلب. تم حقن WGA - اليكسا 555 في الجانب الأيمن من النخاع الشوكي القطني وWGA - اليكسا 488 في الجزء نفسه على الجانب الأيسر. باء كما رأينا في القسم الأنسجة الاكليلية قطع طريق فصيصات الخلفي ، كان كل من استشفاف WGA - اليكسا نقلها إلى المخيخ وصفت بنجاح فرعية متميزة من محطات (انظر أيضا Reeber آخرون 2011). المختصرات : الخلدcular طبقة (مل) ؛ بركينيي طبقة الخلايا (PCL) ، الطبقة الحبيبية الخلية (GCL) ؛ المادة البيضاء (وات). أشرطة النطاق : B ، 100 ميكرون.
ويمكن استخدام الرقم 5. WGA - اليكسا استشفاف في تركيبة مع المناعية والأنسجة لوصفها الثلاثي من الخلايا العصبية والتوقعات. وتودع ألف WGA - 555 في اليكسا محطات الألياف المطحلب الثالث الفصيص. باء ZebrinII تلطيخ يكشف عن مجموعة من خطوط الخلية بركينيي الثالث الفصيص. جيم تلوين دابي من نوى الخلايا العصبية والدبقية. D. مدموجة صورة لوحات A ، B وتظهر العلامات C الثلاثي العصابات وارد ، والمشارب بركينيي الخلية ، والتهندس الخلوي العام. EH. الصور عالية التكبير من المناطق محاصر هو موضح في لوحات ميلادي. يتم ترقيم المشارب بركينيي خلية كما هو موضح سابقا (مراجعةفي (تطبيقات وهوكس 2009)). المختصرات : الطبقة الجزيئية (مل) ؛ بركينيي طبقة الخلايا (PCL) ، الطبقة الحبيبية الخلية (GCL). أشرطة النطاق : D ، 500 ميكرون (لميلان) ؛ H ، 500 ميكرون (لمصر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وصفت لنا التفاصيل الجراحية والتقنية اللازمة لنجاح البحث عن المفقودين وتغصن محواري به رواية الفلورسنت النهج القائم على التوقعات بسرعة لوضع العلامات العصبية في الفئران النامية والكبار. WGA ، باستخدام اليكسا نظهر كيف يمكن استخدام استشفاف وعلامات لتحليل طوبوغرافيا الدوائر منقوشة بدقة عالية وخلال ثلاثة أبعاد.
استشفاف الكثير من البحث عن المفقودين متاحة للدوائر العصبية بما في ذلك السم باء الكوليرا الوحيدات ، Biocytin ، Neurobiotin ، leucoagglutinin Phaseolus الشائع (فال) ، fluororuby ، وfluoremerald fluorogold. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت مؤخرا على استشفاف الوراثية والفيروسية التي ترتبط الخلايا العصبية الطوبوغرافي فرعية متميزة جزيئيا إلى أهدافهم بدقة كبيرة. لاحظ أنه على الرغم من نقل بعض استشفاف العصبية في الغالب في اتجاه إما تقدمي أو رجعي (على سبيل المثال 10000 ميجاوات مقابل BDA ميجاوات 3000) ، غالبا ما تنقل الجزيئات التتبع في كل منالاتجاهات. في دراستنا ، ونحن نقدم WGA - اليكسا استشفاف تستند كأدوات تشريحي عصبي موثوقة لتحليل أنماط الإسقاط الطبوغرافية. نظهر أن WGA - اليكسا تتفلور الزاهية ، ويتم نقل بسرعة ، ومرنة بما فيه الكفاية لتكون مقترنة مع علامات المناعى بما فيها تلك المتعلقة المقصورات السهمي المخيخ (الشكل 3).
لقد تم العثور على العديد من القيود على استخدام WGA - اليكسا بالمقارنة مع غيرها من استشفاف تشريحي عصبي المتاحة. على النقيض من بنك دلتا آسيا (وو وآخرون 1999) ، وأظهرنا في وقت سابق ان WGA - اليكسا (وWGA - HRP) لا تكشف عن كامل التشكل من النهايات الطرفية المعقدة (Reeber وآخرون 2011). ومع ذلك ، قمنا بتحسين قيمة المعلومات المكتسبة من التشريحية المحطات التي تتبع الاقتران WGA - اليكسا تتبع مع تلطيخ المناعى للنقل الغلوتامات الحويصلي 2 (VGLUT2) والكوكايين والأمفيتامين الببتيد نص ينظم (سلة) المناعية (Reeber وآخرون 2011 ؛. Reeber وSillitoe ، 2011). والقصور الأخرى WGA - اليكسا هو أن يتحلل بسرعة نسبيا إشارة على أقسام الأنسجة ، وعلى الرغم من كونها تقام في وسائل الإعلام التي تحمي إشارة الفلورسنت. ولذلك ، فإننا عادة صورة النسيج مباشرة بعد القطع ، وعلى الرغم من التصوير داخل 2 يوما من القطع لا يزال يسمح للألياف وصفت ومحطات التقط بنجاح. هناك ميل للإشارة WGA - اليكسا لانقاص وكثافة خلال immunostaining من المقاطع الأنسجة. ويمكن استخدام عدد أقل من يغسل وأقصر خلال تلطيخ تقليل هذه المشكلة. توصية أخرى هي دائما لتركيب وصورة واحدة مجموعة من المقاطع الأنسجة تعود في اليوم من قطع لمجموعة مرجعية للمقارنة مع الأجزاء المجاورة التي سيتم تجهيزها لالمناعية. في أيدينا أكتوبر (الأنسجة تيك ، ساكورا Finetek ، تورانس ، كاليفورنيا) جزءا لا يتجزأ من كتل الأنسجة الاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية بعد يمكن تخزينها ونضح cryoprotection لفترات طويلة من الزمن دون أي خسارة في كثافة التتبع.
لدينا approaويمكن تتبع الفصل من ألياف تتكيف بسهولة لتتبع المسارات العصبية في الخرائط القشرية ، الدماغ ، والعمود الفقري. نحن نبحث حاليا إمكانية استخدام WGA - اليكسا لاستشفاف التصوير في الجسم الحي من تشكيل الدائرة في الحيوانات المعدلة وراثيا ولدراسة ديناميات تشكيل الدائرة بعد الآفات المسالك انتقائية والتلاعب الدوائية. منذ النقل السريع للWGA - اليكسا استشفاف يسمح على المدى القصير تحليل نهجنا لديه القدرة على الكشف عن التغيرات الديناميكية التي تحدث خلال اللدونة الهيكلية للدوائر الطوبوغرافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المحقق الجديد بدء الأموال من كلية ألبرت اينشتاين للطب في جامعة يشيفا في RVS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | Cat. # 18000-00 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | Cat. # 300056 | |
| Dual stage Glass Micropipette Puller | Narishige International | Model 001-PC-10 | |
| Micrometer syringe | Gilmont Instruments | Cat. # GS-1100 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | Model 940-A | |
| Electrode Manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | |
| Vetcare chamber | Harvard Apparatus | Cat. # 340508 | |
| Heating Pad | Harvard Apparatus | Cat. # 341241 | |
| Leica DFC360 FX camera | Leica Microsystems | DFC360 FX | |
| Leica DFC490 camera | Leica Microsystems | DFC490 | |
| Leica DM5500 microscope | Leica Microsystems | DM5500 | |
| Leica DFC3000 FX camera | Leica Microsystems | DFC3000 FX | |
| Leica MZ16 FA microscope | Leica Microsystems | MZ16 FA | |
| CY3 Filter | Leica Microsystems | Model # 11600231 | |
| FITC Filter | Leica Microsystems | Model # 11513880 | |
| A4 DAPI/UV filter | Leica Microsystems | Model # 11504162 | |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Cat. #W11261 | |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | Cat. #W32464 |
References
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
- Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. , Wiley. New York. (1982).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. , (2011).
- Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
- Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
- Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
- Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
- Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
- Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).
