Summary
우리는 제공 추적기에 대한 실질적인 가이드를 제공합니다
Abstract
신경 회로는 기능 지형지도로 구성되어 있습니다. 복잡한 회로 아키텍처를 시각화하기 위해 우리는 여러 지형 예측의 글로벌 patterning을 안정적으로 라벨 접근 방식을 개발했습니다. 소뇌는 신경 회로의 질서 배열을 연구하는 이상적인 모델입니다. 예를 들어, spinocerebellar 이끼 낀 섬유의 compartmental 조직은 이끼 낀 섬유 patterning을 연구를위한 필수적인 시스템으로 입증되었습니다. 우리는 최근 그 알렉사 555 및 488에 복합 밀 배아 agglutinin (WGA)이 개발하고 성인 마우스에 spinocerebellar 이끼 낀 섬유 계획을 추적 사용할 수 있습니다 보여주었다 (Reeber 외. 2011)를. 우리는 신경 전망을 라벨에 대한 WGA - 알렉사 추적하는 바람직한 도구를 만드는 세 가지 주요 속성을 발견했습니다. 첫째, 알렉사의 fluorophores은 집중하고 자신의 밝기를 직접 추적 후 wholemount 이미징을 허용합니다. 둘째, WGA - 알렉사 추적기 개발과 성인 신경 projectio의 전체 궤도 레이블을NS. 셋째, WGA - 알렉사으로 추적은 빠르게 역행하고 anterograde 두 방향으로 수송됩니다. 여기, 우리는 추적기와 기타 필요한 도구, spinocerebellar 추적에 대한 수술을 수행하는 방법과 최상의 방법을 3 차원에 투영 이미지를 추적하기 위해 준비하는 방법을 자세히 설명합니다. 요약에서, 우리는뿐만 아니라 소뇌에서뿐만 아니라 대뇌 피질, brainstem 및 척수의 기능지도의 조직과 연결성을 파악하는 데 유용할 수있는 단계별로 추적 프로토콜을 제공합니다.
Protocol
1. 멸균 수술을 이용하여 생체내에 추적기를 제공하는 (제 1.1-1.16)
절차 전반에 걸쳐 우리는 표준 불임 수술 기법을 사용하시는 것이 좋습니다. 이것은 멸균 장갑, 가운, 그리고 안면을 사용하여 포함됩니다. 도구는 역시 사용하기 전에 autoclaved하거나 물 그리고 에탄올과 철저히 청소해야합니다. 수술하는 동안, 특히 사이에 동물, 뜨거운 구슬 살균기 (Steri 250 고양이. # 18000-45, 파인 과학 도구)와 도구와 건조 소독 악기 닦아 조직 파편. 또한, 그것은 당신이 동물 준비 (면도기 등), 수술, 그리고 동물이 쉽게 모니터링 따뜻하게하고, 필요에 따라 진통제와 함께 제공되는 수있는 복구 영역 지정 구역을 가지고 당신의 작업 공간 등의 구성하는 것이 중요합니다. 성공적인 생존 수술의 핵심은 감염의 위험을 줄이고 적극적인 사후 수술 치료 전략을 유지하는 것입니다. 당신은 지느러미 수있는 표를 참조하시기 바랍니다이 프로토콜에 대한 D는 필요한 모든 장비 및 시약.
- 0.2ml/10grams의 체중의 투여와 함께 intraperitoneal (IP) 주입을 통해, 신선한 Avertin (CAT # T48402. 2,2,2 - Tribromoethanol, 시그마, 세인트 루이스, 미주리 주)와 성인 생쥐를 마취. 이러한 isoflurane이나 xylazine / 케타민을 같은 다른 anesthetics 똑같이 효과적입니다하지만 실험실 사용하기 전에 필요한 기관 및 연방 승인을 가지고 있는지 확인합니다. 당신은 새끼를 (P0 - P10)을 사용하는 경우 10~15분위한 얼음 조각으로 그들을 마취 수 있습니다. 찬물 빨리 저체온증의 치명적인 수준을 유발하므로 각 강아지의 피부가 얼음 (예를 들어, 라텍스 장갑의 손가락에 그들을 배치)에 직접 접촉되지 않도록. 동물이 동물의 뒷다리 갈퀴에 포셉 또는 손가락으로 발가락 핀치를 수행하여 마취의 허용 일반 아래에 있는지 확인합니다. 페달 반사가있다면 동물이 깊이의 표시로 자극에 응답 때까지 기다려마취의 일반.
- 일단 동물이 완전히 anesthetized는 그것의 머리가 떨어져 당신과 당신쪽으로 향하고 꼬리쪽으로 향하게와 함께 멸균 거즈 패드에의 지느러미 면을하다. 자신에게 중추 신경계에 액세스할 수있을만큼 넓다 확실한 수술 필드를 제공하기 위해 헤어 가위로 털 면도. 알코올 잎사귀 두 세트, 다음 70 % 알코올 / betadine로 면도 영역을 닦고, 그리고 알코올 잎사귀와 함께 한 번 더 닦아주십시오. 외과 영역을 청소하면 외부 원형 패턴으로 내부를 사용합니다. 당신은 명확하게 멸균 거즈 패드에 작은 구멍을 절단하고 깨끗한 면도 외과 사이트를 통해 오프닝을 삽입하여 수술 필드를 한계를 정하다하도록 선택할 수 있습니다. 멸균 수술 필드를 유지하는 것은 이렇게, 작은 동물에서 운영하는 것은 감염의 위험을 줄이려면 도움이 될 것입 때 까다로운 수 있지만.
- 집게를 사용하여 피부를 리프트 직접 낮은 흉부 - 상위 요추 R 위의 중간선에서 가위로 절개하다egion. 낮은 흉부 지역 상위 요추는 척추 열 (그림 1)에서 고비에 대한 느낌을 척추를 따라 손가락을 실행하여 확인할 수 있습니다.
- 근막과 표면 척추 근육을 잘라. 필요한 경우, 혈관을 (.; 고양이 # 18000-00 파인 과학 도구, 포스터 시티, CA) cauterizing하여 출혈을 중지합니다. 새끼에서 면봉으로 절개 주위에 부드러운 압력을 적용하는 것은 출혈을 멈추게하기 충분하다.
- (그림 2) 관절 과정과 지느러미 spinous 과정 사이의 척추 열 중간의 양쪽에있는 얇은 판을 절단 후 상부 요추 척수 - 흉부 낮은 중 하나 또는 두 개의 세그먼트의 spinous 프로세스를 제거하여 지느러미 laminectomy을 수행 . 당신의 가위로 척수 손상을들이 척수를 괴롭히다 수 있으므로 항상 작은 뼈 조각을 제거하지 않도록주의하십시오. 초기 출생 후의 새끼에서 척추 열의가 완전히 ossified하지 않습니다, 이것은 뼈가 매우 것을 의미부드럽고 아주 쉽게자를 수 있습니다. 따라서 척수 손상을 수 있으므로 심하게하지 않도록주의하십시오.
- 당신이 성인 생쥐에서 지느러미 laminectomy을 수행하지 않도록 설정하는 경우, 우리는 당신이 어떤 뼈를 절단하지 않고 척수의 작은 영역을 노출 척추 세그먼트 사이의 부드러운 조직을자를 수있는 것으로 나타났습니다. 두 가지 방법이 척수에 항목의 효과적 노선 있지만, 지느러미 laminectomy을 피하는 것은 척수가 손상 유지할 수 있습니다.
- Gilmont 인스 트루먼 트의 고양이, 마이크로 미터 주사기를 사용하여 추적 (0.2mL와 (과 Narishige 모델 001 - PC - 10에서 듀얼 스테이지 유리 Micropipette 풀러,, 고양이 # 300056, 하버드 장치, Holliston, MA. Borosilicate 유리 모세관) 뽑아 유리 전극을 작성 . # GS - 1100) 또는 동급 전달 장치.
- micromanipulator에 장소에 유리 microelectrode를 조여하고 중간 중간 사이에 척수의 하단 흉부 - 상위 요추에 전극 0.1 - 0.5mm를 삽입라인과 척수의 측면 가장자리. 동물은 사출 loci의 정확한 식별 stereotaxic 장치와 동물 (작은 동물 Stereotaxic 악기 모델을 940 - A와 Kopf 계측에서 전극 속이는 사람 모델 960) 안정화 개최 수 있습니다. 또는 귀하의 마취 정권이 부드럽게 아래 동물을 녹화, 깊은 호흡으로 인해 상당한 움직임없이 안정적인 비행기를 달성하기위한 맞춤이있다면 충분합니다.
- , WGA - 알렉사 555, WGA - 알렉사 488 (. 고양이 # W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA 밀 배아 agglutinin, 알렉사 형석 488 공액)의 2 % 용액의 약 0.5μl 3-5분를 통해 척수로 주입 압력 (밀 배아 agglutinin, 알렉사 형석 555 공액;. 캣 # W32464, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA - 알렉사 350 (밀 배아 agglutinin, 알렉사 형석 350 공액;. 캣 # W11263, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA - HRP (밀 배아 agglutinin 양고추냉이 퍼옥시데이즈, 시그마, 세인트 루이스, 미주리 고양이 # L7017) 또는 10 %의 0.5μlBDA는 (dextran 아민을 biotinylated;. 캣 # D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) 인산의 염분을 (; 시그마, 세인트 루이스, 미주리, 고양이 # P4417 PBS) 버퍼. 섬유의 큰 숫자를 라벨에 추적기 결과 이러한 볼륨을 주입. 작은 볼륨 작은 핵 (또는 개별 핵의 하위 지역) 및 각 조사는 경험적으로 제공하는 이상적인 볼륨을 결정한다를 타겟팅하는 주입해야합니다. Iontophoresis는 정확한 주사에 대한 정확한 nanoliter 배달 고려되어야합니다. 수술 중에 분사 자리를 시각화하기 위해, 우리는 일반적으로 0.5 % 빠른 그린 (CAT # F7252 시그마, 세인트 루이스, 미주리) 모든 추적 솔루션을 보완.
- 뽑아 pipettes의 벽에 고집에서 혼합을 방지하기 위해 주입하기 전에 BDA 솔루션의 모든 10μl에, 우리는 (CAT # C8267 시그마, 세인트 루이스, 미주리) 옥수수 기름 1μl를 추가합니다. 당신이 피펫 밖으로 꺼내기 문제 추적기이있는 경우, 천천히 다시 주입 시도 후 조직에 작은 주머니를 만드는 팁을 철회.그것은 덩어리로 microelectrode 팁에 대한 드문되지 않습니다. 대부분의 경우에는 포켓도 주변의 뉴런이 추적기를 흡수 할 수있는 저수지를 만들 수 있습니다. 항상 바늘 부근에 대규모 조직의 손상을 피하기 위해 천천히 추적기를 꺼낼 것을 잊지 마십시오.
- 상처 클립 및 조직 접착제로 피부를 부드럽게 닫습니다. 또는, 당신은 상처를 닫습니다 봉합을 사용할 수 있습니다.
- 연습 수술과 함께, 적어도,이 시점까지 20 분 이내에 완료할 수 있습니다.
- 복구 최대 저체온증과 속도를 방지하기 위해 가열 패드 (난방 패드 고양이. # 341241 하버드 장치에서)에서 (하버드 장치에서 Vetcare 챔버 모델 9.16.0 고양이. # 340508) 복구 챔버에있는 동물을 놓습니다. 또는 가열 챔버의 여러 차종과 모델 중 하나를 사용할 수 있습니다. 호흡 률을 모니터하고 동물이 이동하는 시도하는 징후를 확인하십시오. 대부분의 동물은 10~15분 수술 시간 이내 반응하고 있습니다.
- WGA - 알렉사 555, WGA - 알렉사 488 및 WGA - HRP는 급속하게 뉴런에 수송하고 우리가 모두 초기 출생 후의 성인 생쥐의 알렉사 활용 추적기 24 시간 이내에 견고하게 라벨 긴 섬유 책자 (Reeber 외. 2011)를 발견 . 그 가시는 필터 세트의 품질과 감성에 크게 의존하는 다른 알렉사의 염료에 비해 비록 WGA - 알렉사 350도 신속하게 수송합니다 (데이터가 표시되지;. Reeber 외 2011)이 BDA는 일반적으로 긴 생존 시간은 완전히 동물들이 약 11 일 후에 희생해야합니다 spinocerebellar 예측의 전체 매핑에 대한 신경 전망되므로 추적해야합니다.
2. anterogradely 추적 이끼 낀 섬유의 탐지
- 각각의 생존 기간 Avertin (또는 원하는 마취)로 생쥐를 마취 후.
- 일단 혈액 0.1M PBS (pH7.2)로 perfusing하여 심장을 관통 플러시해야 더 반사가 없습니다. 그런 다음, PBS에서 4 % paraformaldehyde (PFA)로 동물을 perfusing하여 조직을 수정. 이 분석 지역 이외에, 항상 사출이 얼마나 큰의 회고 분석, 전극에 의한 조직 손상의 범위 표시를위한 사출 사이트에서 조직을 얻기 위해 필요하며, 섬유 가능 라벨 식별을 위해 통로 (; Mesulam, 1982 참조;. Reeber 외를 2011 그림 3).
- postfix와 BR다음 4퍼센트 PFA에 24-48시간에 대한 perfused 마우스에서 ains 및 PBS (~ 2 시간 또는 다음 조직 컨테이너의 하단에 싱크 30 % 야간까지 또는까지 15%에 희석 버퍼 자당 솔루션에서 그들을 cryoprotect 조직 싱크). 조직은 다음 자당에서 제거, 부드럽게 종이 타올로 건조 dabbed 후 OCT 포함된 조직 금형에 열중 (최적의 절삭 온도, 사쿠라 Finetech 미국 Inc의, CA)가. 그 준비가 절단 될 때까지 조직은 다음 -80 ° C의 냉동고를 사용하여 동결과 같은 온도에 저장됩니다.
- 알렉사의 fluorophores 직접 레이블 후 볼 수 있습니다 추가 얼룩이 필요하지 않습니다. 따라서, 재관류 후 WGA - 알렉사 추적 조직은 컷 수 및 이미징에 대한 장착하거나 직접 wholemount 준비로 4% PFA에 몇 군데. 우리는 4 %의 조직이 PFA는 이미지 wholemounts에서 추적 예측의 지형에 가장 적합한 굴절률 준 영상을 발견했습니다. 섹션 들어, 시리얼 40μm 두께 coron 잘라야외 그라 이오 스탯에 대한 섹션하고 PBS에서 무료 부동 섹션으로 그들을 수집합니다. PFA의 독성 감안, 적절한 안면이 재관류 및 이미징 동안 착용되도록 통풍이 잘 영역을 유지하고, 사용하지 않을 때는 즉시 밀폐 용기 것은 어떤 PFA 또는 PFA - 고정 조직을 반환합니다. 귀하의 현미경이 적합한 퓸 후드에 위치한면 이상적입니다.
- WGA - HRP 분류 섬유 chromogen으로 tetramethylbenzidine (TMB)를 사용하여 발표하실 수 있습니다. 그것이 이전에 (.; Sillitoe 외 2,010 보글과 Prittie 1994)에 자세히 설명이되어 있으므로 여기서는 HRP의 얼룩 프로토콜을 설명하지 않습니다
- BDA에 대한 라벨 섬유 Streptavidin - CY3 2 시간 동안 무료 부동 조직 섹션 (Cat. # 434315, Invitrogen, Carlsbad, CA) 또는 Streptavidin - 알렉사 형석 488 또는 555을 (Cat. 488와 고양이를위한 # S11223 품어. # S21381을위한 555, Invitrogen, Carlsbad, CA)은 플루오로 - 젤로 마운트 후 PBS로 세척합니다. (ABC 반응 버퍼에서 하룻밤 DAB 들어, 품어 조직 섹션 Cat. # PK - 4000, V경 연구소, 주식 회사 Burlingame, CA)는 PBS로 3 번 씻어 후 10μl 30 % H 2 O 2 보충 (0.5mg/ml, 벡터 연구소 주식 회사, Burlingame, CA) DAB의 5-10분에 대한 반응 모든 50ml DAB 솔루션.
3. Immunohistochemistry
- Immunohistochemistry은 (Sillitoe 외. 2008) 이전에 설명한대로 진행되었습니다. , 십대 초반 - 20 0.1 %와 실온에서 16-18시간에 대한 기본 항체 (아래 참조) 간단히, 10 % NGS를 (시그마, 세인트 루이스, 미주리 NGS)가 포함된 0.1M PBS에서 조직 섹션을 품어. 조직 섹션에게 PBS로 세 번 씻어 후 실온에서 2 시간 최대 (아래 참조) 이차 항체에서 그들을 품어. 다시 조직을 씻어 아래 설명된대로 immunoreactivity를 공개.
- 우리는 이중 염색법의 종래의 방법을 사용하여 무료로 부동 조직 섹션을 공동으로 표시 Purkinje 세포와 이끼 낀 섬유 사이의 관계를 확인하려면 다음과 같이하십시오. 우리는 WGA - 알렉사에게 555을 사용추적 및 알렉사 488 복합 당나귀 안티 - 마우스 차 항체 (Invitrogen / 분자 프로브 주식 회사, Carlsbad, CA)에 대한 ZebrinII을 (; 박사 리처드 호크스, 캘거리 대학교, 캘거리, 캐나다의 종류 선물 1:250) 감지합니다. ZebrinII는 마우스 단클론 항체이고 하이 브리 도마 소비 문화 매체에서 직접 사용되었다. 형광단 복합 이차 항체는 1:1500의 희석에 사용되었습니다. 얼룩 후 조직 섹션이 부과 유리 슬라이드에 탑재되었으며 다음 DAPI (와 매체를 장착 트리스 버퍼 (전자 현미경 과학, 하트 필드, PA)에 플루오로 - 젤 또는 Vectashield hardset와 coverslipped Cat. # H - 1200, 벡터 연구소, Burlingame , 트리플 색 형광 이미징을위한 CA).
- 우리는 차 항체의 부재에있는 조직 섹션을 처리하여 이차 항체의 특이성을 테스트했습니다. 신호가 우리가 관찰 얼룩이 일부터 특이 현상이 신호에 의한되지 않았음을 나타냅니다 이러한 제어 실험에서 검출되지 않았습니다E는 알렉사 - 복합 항체 (데이터가 표시되지 않음).
4. 현미경 및 데이터 분석
- 우리는 Leica DFC360 FX (형광)과 DFC490 (DAB와 TMB는 조직 섹션 반응) Leica DM5500 현미경에 장착된 카메라를 사용하여 조직 섹션의 photomicrographs을 캡처합니다.
- 우리는 Leica 애플 리케이션 스위트와 Leica 애플 리케이션 스위트 FX 소프트웨어 패키지를 사용하여 조직 섹션의 이미지를 획득하고 분석할 수 있습니다.
- wholemounts의 Photomicrographs는 Leica 애플 리케이션 스위트 FX 소프트웨어를 실행하는 Leica MZ16 FA의 stereomicroscope에 장착된 Leica DFC3000 FX 카메라를 사용하여 캡처하고 있습니다.
- 우리의 현미경은 모두 Leica CY3 (모델 # 11600231)과 FITC (모델 # 11513880) 필터 및 추가 A4 DAPI / UV 필터 (모델 # 11504162)로 DM5500을 갖추고 있습니다.
- 이미지는 Leica 소프트웨어를 사용하여 결정된 미만 / 이상 노출에 대한 최적화 이후에 취득하고 있습니다. 우리는 어도비 포토샵 CS4에 필요한 w하면 모든 원시 데이터를 가져오려면E 선명도, 밝기, 대비 또는 수준만을위한 각 이미지의 전체 필드를 수정합니다. 다른 사진 편집 소프트웨어가 기본으로 사용할 수 있습니다.
- 여기에 제시 도면은 어도비 일러스트 레이터 CS4에 그려져 있었다.
- 우리의 필터를 사용 빨간색으로 감지 알렉사 555과 CY3 얼룩진 뉴런은, 원고 제출에 걸쳐 이미지의 유사 색 마젠타되었습니다.
동물
모든 동물 연구는 의학의 알버트 아인슈타인 대학에서 기관 지침에 따라 승인된 IACUC 동물의 프로토콜에 따라 수행되었다. 남성과 여성 outbred 스위스 웹스터 (Taconic, 알바니, 뉴욕) 또는 근친 C57BL6J (잭스, 바 하버, ME) 생쥐는 우리의 식민지 유지 및 모든 연구를 위해 사용되었습니다. 질 플러그가 발견되었습니다 당일 정오은 배아 일 0.5 여겨졌다.
5. 대표 결과 :
Spinocerebellar afferents는 parasagi에 종료소뇌에 ttal 밴드 (그림 3; Voogd 외 1969;. Grishkat 및 Eisenman 1995, 보글과 Prittie 1994, 수수료 외 2005;. 애플 리케이션 및 호크스 2009; Sillitoe 외 2010;.. Reeber 외 2011). ) Reeber 외 2011), 2, 이러한 추적기가 지속적으로 소뇌에 단말기의 특정 하위 집합 (그림 3 분류하는 데 사용할 수있는) : 1. 우리가 법의 원칙에 의해 낮은 흉부 - 상위 요추 척수에 WGA - 알렉사 추적기를 주입 WGA - 알렉사으로 추적 달아 밝은하고 전체 cerebella의 이끼 낀 섬유 지형의 전반적인 패턴 (그림 3; Reeber 외 2011). 시각화하는 데 사용할 수있는 WGA - 알렉사 488과 555이 조합에 사용될 수있는, 3) WGA - 알렉사으로 추적이 immunohistochemical 얼룩 (그림 5)와 호환되는 동일한 동물 (그림 4), 4)에서 여러 책자를 추적하십시오. 최근 작업에서 우리는 WGA - 알렉사 추적기 레이블 척수에 추적기 전달 후 6시간 빠르면 소뇌의 터미널 및이 architectur 추적을위한 탁월한 선택입니다 것으로 나타났다개발 경로 (Reeber 외., 2011)의 E.
그림 1. 우리 외과 영역의 이미지. B. 낮은 흉부 - 상위 요추는 척추 열에 고비에 대한 느낌을 척추를 따라 손가락을 실행하여 확인할 수 있습니다 생체내. A에서 추적기를 전달하기위한 장비의 설치. 지느러미 laminectomy는 노란색 화살표로 표시됩니다 "고비"의 중간에 약 수행해야합니다.
그림 2 낮은 흉부의 삽화 -... 마우스 척추 열의 낮은 흉부 - 상위 목재 지역에서 척추 손상 세그먼트의 지느러미 laminectomy 이전과 이후 A. 약도 상부 요추 척추 세그먼트 B. dorsa내 laminectomy는 관절 과정과 지느러미 spinous 과정 사이의 얇은 판의 중간을 절단 후, 하나 또는 두 개의 척추 세그먼트의 spinous 프로세스를 제거하여 수행됩니다.
그림 3. WGA - 알렉사의 추적기 달아 밝은하고 높은 해상도로 수입 성의 프로젝션 지형을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. A.이 도식은 WGA - 알렉사의 기원과 종료 555 레이블 spinocerebellar 뉴런을 보여줍니다. 성인 척수의 하단 흉부 상부 요추에 WGA - 알렉사 555을 제공 후 주사 사이트의 B. 이미지.의 C. Wholemount 이미지 공동 본으로 척수의 하단 흉부 - 상위 요추에 WGA - 알렉사 555의 주사를 다음과 앞쪽에 lobules가. spinocerebellar 요로의 추적 D. WGA - 알렉사 555 anterograde은 이끼 낀 섬유 밴드를 보여ronal 조직 섹션을 참조하십시오. lobules은 중간선 (모든 이미지에 적용)의 양쪽에 로마 숫자와 숫자 레이블 이끼 낀 섬유 밴드에 의해 정의됩니다. 스케일 바 : B, 500 μm의 C, 500 μm의 D, 200 μm의.
그림 4. WGA - 알렉사으로 추적 같은 동물에서 여러 신경 경로를 라벨에 대한 효율적입니다. spinocerebellar 이끼 낀 섬유 밴드의 전반적인 패턴을 요약 마우스 소뇌의 A. Wholemount 약도. WGA - 알렉사 555이 왼쪽에있는 동일한 세그먼트에 요추 척수와 WGA - 알렉사 488의 오른쪽에 주입했다. B.이 이름으로 사후 lobules을 통해 절단 코로나 조직 섹션에서 볼 수 모두 WGA - 알렉사 추적기되었습니다 소뇌로 이송 성공적으로 단말기의 고유 하위 집합을 (또한 Reeber 외를 참조하십시오. 2,011) 표시. 약어 : 두더지cular 층 (ML), Purkinje 세포 층 (PCL), 과립 세포 층 (gcl), 흰색 물질 (WM). 스케일 바 : B, 100 μm의.
그림 5. WGA - 알렉사 추적기는 뉴런과 예측의 트리플 라벨에 대한 immunohistochemistry 및 조직학와 함께 사용할 수 있습니다. A. WGA - 알렉사 555은 lobule III에 이끼 낀 섬유 터미널에 입금됩니다. B. ZebrinII의 얼룩이 lobule III의 Purkinje 세포 줄무늬의 배열을 보여준다.의 연결 및 glial 핵의 C. DAPI의 얼룩은. D.는 패널 A, B의 이미지를 흡수 합병 , 그리고 수입 성의 밴드, Purkinje 세포 줄무늬, 일반 cytoarchitecture의 트리플 라벨링을 보여주는 C. EH. 패널 광고에 표시된 박스 영역의 높은 배율 이미지. 앞에서 설명한 것처럼 Purkinje 세포의 줄무늬는 (검토 번호가 지정되어에서 (애플 리케이션과 호크스 2009 년)). 약어 : 분자 층 (ML), Purkinje 세포 층 (PCL), 과립 세포 층 (gcl). 스케일 바 : D, 500 μm의 (AC 용), H, 500 μm의 (EG)을.
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Discussion
우리는 성공 axonal와 dendrite 신속하게 개발하고 성인 생쥐의 신경 전망을 라벨에 대한 소설 형광 기반의 접근법을 사용 추적에 필요한 수술과 기술 세부 사항을 설명합니다. WGA - 알렉사를 사용하여 우리는 추적기와 마커는 높은 해상도로 패턴 회로 지형을 분석하고 3 차원에 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
대부분의 추적기는 콜레라 독소의 subunit의 B, Biocytin, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHAL), fluororuby, fluoremerald 및 fluorogold를 포함한 회로의 연결을 추적하실 수 있습니다. 또한, 최근 유전자 및 바이러스 기반의 추적기는 molecularly 별개의 연결 집합은 topographically 큰 정밀도와 자신의 목표에 연결되어있는 것을 증명하고있다. 일부 신경 추적기는 주로 중 anterograde 또는 역행 방향 (3000 MW 비교 예 BDA 10,000 MW)에 운반하고 있지만, 추적 분자는 종종 모두에 수송됩니다방향. 우리의 연구에, 우리는 지형 프로젝션 패턴 분석을위한 안정적인 neuroanatomical 도구로 WGA - 알렉사 기반 추적기를 소개합니다. 우리는 WGA - 알렉사가 밝게 fluoresces 신속하게 수송하고, 소뇌 화살 구획 (그림 3)를 포함 immunohistochemical 마커와 결합 수있을만큼 다양한는 것을 보여줍니다.
우리는 다른 가능한 neuroanatomical 추적기에 비해 WGA - 알렉사를 사용하여 여러 한계를 발견했다. BDA (우 외. 1999)와는 달리, 우리는 이전에 WGA - 알렉사 (및 WGA - HRP)가 복잡한 터미널 엔딩 (Reeber 외. 2011)의 전체 형태를 공개하지 않는 것으로 나타났다. . 그러나, 우리는 해부 학적 정보의 가치가 기공을 갖는 글루 탐 산염 수송 2 (VGLUT2)와 코카인과 암페타민 규제 대본 펩타이드 (카트) immunohistochemistry (Reeber 외 2011에 대한 immunohistochemical 얼룩와 WGA - 알렉사 추적을 페어 링하여 추적 터미널에서 얻은 개선; Reeber 그리고 Sillitoe, 2011).WGA - 알렉사의 다른 단점은 신호가 형광 신호를 보호하는 매체에 마운트 임에도 불구하고 조직 섹션에 상대적으로 빠르게 저하되는 것입니다. 절단 2 일 이내에 이미지가 계속 허용하지만 그러므로, 우리가 일반적으로 이미지를 즉시 절단 후 조직은, 라벨 섬유 단말기가 성공적으로 몇 군데있을 수 있습니다. 조직 섹션의 immunostaining 동안 강도를 잃는 WGA - 알렉사 신호 경향이있다. 얼룩 동안 적은와 짧은 세척를 사용하면이 문제를 최소화할 수 있습니다. 또 다른 추천은 항상 immunohistochemistry을 위해 처리됩니다 인접 부분과 비교할로 설정 참조 절단 당일 추적 조직 섹션의 한 세트를 마운트 및 이미지입니다. 재관류와 cryoprotection가 추적 강도의 손실없이 장시간 저장할 수 있습니다 ° C 이후 우리 손에 OCT는 (조직 테크, 사쿠라 Finetek, 토랜스, CA) -80에서 보관 조직 블록을 내장.
우리 approa추적 섬유 채널은 쉽게 피질 brainstem, 그리고 척추 신경 경로의지도를 추적에 맞게 수 있습니다. 현재 유전자 변형 동물과 선택적 요로 병변 및 약리 조작 후 회로 형성의 역학을 연구를위한 회로 형성의 생체내 이미징에 대한 WGA - 알렉사 추적기를 사용하는 가능성을 모색하고 있습니다. WGA - 알렉사 추적기의 급속한 전송 단기 분석을위한 수 있기 때문에 우리의 접근 방식은 지형 회로의 구조 소성하는 동안 발생하는 동적 변경 내용을 공개 가능성이 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 RVS로 시작 자금 예시바 대학 의과 알버트 아인슈타인 대학에서 새로운 조사에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | Cat. # 18000-00 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | Cat. # 300056 | |
| Dual stage Glass Micropipette Puller | Narishige International | Model 001-PC-10 | |
| Micrometer syringe | Gilmont Instruments | Cat. # GS-1100 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | Model 940-A | |
| Electrode Manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | |
| Vetcare chamber | Harvard Apparatus | Cat. # 340508 | |
| Heating Pad | Harvard Apparatus | Cat. # 341241 | |
| Leica DFC360 FX camera | Leica Microsystems | DFC360 FX | |
| Leica DFC490 camera | Leica Microsystems | DFC490 | |
| Leica DM5500 microscope | Leica Microsystems | DM5500 | |
| Leica DFC3000 FX camera | Leica Microsystems | DFC3000 FX | |
| Leica MZ16 FA microscope | Leica Microsystems | MZ16 FA | |
| CY3 Filter | Leica Microsystems | Model # 11600231 | |
| FITC Filter | Leica Microsystems | Model # 11513880 | |
| A4 DAPI/UV filter | Leica Microsystems | Model # 11504162 | |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Cat. #W11261 | |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | Cat. #W32464 |
References
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
- Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. , Wiley. New York. (1982).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. , (2011).
- Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
- Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
- Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
- Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
- Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
- Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).
