Summary
Questo video mostra tre tipi di analisi morfometrica della retina, che comprendono la misurazione dello spessore interno strato nucleare, quantificare il numero delle cellule gangliari retiniche (RGC) e misurando le dimensioni delle RGC. La tecnica in grado di offrire una piattaforma semplice, ma scientifico per le analisi morfometriche.
Abstract
Analisi morfometriche delle sezioni retiniche sono stati utilizzati in esame malattie retiniche. Per esempio, cellule neuronali sono stati significativamente perduto nello strato di cellule del ganglio retinico (RGCL) in modelli di ratto con N-metil-D-aspartato (NMDA)-indotta eccitotossicità 1, retinica ischemia-riperfusione 2 e 3 glaucoma. Riduzione della INL e strato interno plessiforme (IPL) spessori sono stati invertiti con il trattamento citicolina negli occhi dei ratti sottoposti a cainico acido-mediata eccitotossicità glutammato 4. Alterazione della densità e le dimensioni RGC soma è stata osservata con trattamenti farmacologici diversi gli occhi con pressione intraoculare elevata 3,5,6. Pertanto, con metodi oggettivi di analisi dei morphometries della retina possono essere di grande importanza nella valutazione delle patologie retiniche e l'efficacia di strategie terapeutiche.
La struttura della retina è multi-strati e diversi tipi di neuroni exist nella retina. I parametri morfometrici della retina come il numero di cellule, la dimensione della cella e spessore degli strati differenti sono più complesso rispetto al sistema di coltura cellulare. All'inizio, questi parametri possono essere rilevati utilizzando altri software commerciali imaging. I valori sono normalmente di valore relativo, e cambiando il valore preciso può essere necessario ulteriore calcolo accurato. Inoltre, l'analisi della dimensione e la morfologia cellulare può non essere corretta e sufficientemente sensibile per l'analisi statistica, soprattutto nel modello glaucoma cronico. Le misure utilizzate in questo protocollo fornito un modo più preciso e veloce. E la lunghezza assoluta della linea e le dimensioni della cella può essere segnalato direttamente e facilmente essere copiati ad altri file. Ad esempio, abbiamo tracciato il margine dei nuclei più interna ed esterna nel INL formando una linea quindi utilizzando il software per disegnare un angolo di 90 gradi per misurare lo spessore. Pur senza l'aiuto del software, la linea obliqua e forse l'evoluzione dello spessore della retina puònon essere ripetibile tra gli osservatori individuali. Inoltre, il numero e la densità di RGC può anche essere quantificato. Questo protocollo diminuisce con successo la variabilità in quantificazione caratteristiche della retina, aumenta la sensibilità nel rilevare modifiche minime.
Questo video dimostra tre tipi di analisi morfometriche delle sezioni retiniche. Essi comprendono misurare lo spessore INL, quantificare il numero di RGC e misurando le dimensioni delle RGC in valore assoluto. Queste tre analisi vengono effettuate con Investigator Stereo (MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.). La tecnica in grado di offrire una piattaforma semplice, ma scientifico per le analisi morfometriche.
Protocol
1. Tools
Microscopio, Nikon
Investigator Stereo, MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.
2. Preparazione
- Prima di lavorare su qualsiasi analisi morfometrica, ogni campione è sezionato retina a 4 micron di spessore e subisce la colorazione H & E.
- La sezione retina è suddivisa in regioni 4 - superiore regione periferica, la regione centrale superiore, la regione periferica inferiore, e la regione centrale inferiore.
- Dopo aver definito le regioni, l'immagine di ogni regione viene acquisito ad ingrandimenti 10x40 sotto il microscopio luminoso raggio di Nikon.
- Ora, siamo pronti ad analizzare morfometria della retina.
3. Misurare lo spessore INL
- Quattro misurazioni dello spessore INL in ciascuna regione sono stati misurati. Quattro le linee saranno disegnate perpendicolarmente dalla linea di base contorno al confine esterno della INL.
- Aprire il software chiamato Investigator Stereo e scegliere la lente 40x dalla barra degli strumenti principale.
- Selezionare "Apri immagine" sotto il "File" tab. Scegli l'immagine di una regione desiderata della retina che si desidera analizzare.
- Scegliere il tipo di linea di contorno dalla casella di riepilogo a discesa della barra degli strumenti principale e premere il tasto "Move Auto" pulsante.
- Tasto destro del mouse nella finestra di rintracciare e selezionare "Semplice Click Tracing".
- Tracciare la linea di contorno lungo il bordo interno della INL.
- Quando il disegno è fatto, tasto destro del mouse nella finestra di rintracciare e scegliere "Contour Open End".
- Selezionare un marker la barra degli strumenti marcatore e aggiungere marcatori nei punti di giunzione.
- Dopo aver aggiunto tutti i marcatori, deselezionare l'icona nella barra degli strumenti marker Marker.
- Posizionare un cursore al centro di uno dei marcatori.
- Selezionare "QuickMisurare l'angolo "nella scheda" Strumenti ".
- Tasto destro del mouse nella finestra di tracciare e deselezionare l'opzione "continua".
- Misurare un angolo facendo clic al centro di un marcatore, che è adiacente al marker selezionato per una estremità del segmento di linea.
- Quindi, spostare il mouse verso il centro del marcatore in questione e cliccate di nuovo.
- Estendere la linea di elastico al bordo esterno della INL.
- Regolare l'angolo fino a 90 ° è stata raggiunta.
- Sinistra click nella posizione desiderata. Una finestra di dialogo che mostra una misurazione dell'angolo si aprirà subito dopo lo scatto.
- Premere il tastoTasto "Enter", mentre tenendo premuto il mouse ancora.
- Fai clic sinistro della finestra di analisi in modo che una linea viene disegnata da un capo alla nuova fine selezionato.
- Tasto destro del mouse nella finestra di rintracciare e scegliere "Contour Open End".
- Disegnare le altre linee in posizioni differenti esattamente nello stesso modo descritto prima.
- Dopo aver tracciato tutte le linee, selezionare la modalità di modifica e rinominare i 4 segmenti di linea di conseguenza.
- Quattro le misure possono essere ottenuta premendo il tasto "Measurement Contour" pulsante.
- Selezionare queste 4 misure e incollarli in un foglio di calcolo facendo clic su "Copy to Clipboard".
- Selezionare "Salva con nome" sotto "File" tab. I dati di tracciamento possono essere salvati come file di dati.
- Selezionare "Apri immagine" sotto il "File" tab. Scegli l'immagine di una regione desiderata della retina che si desidera analizzare.
- Scegliere il tipo di linea di contorno dalla casella di riepilogo a discesa della barra degli strumenti principale.
- Tracciare una linea di contorno lungo il confine dello strato delle fibre nervose (NFL).
- Terminare il tracciato con la "Contour End Open" opzione.
- A ciascuna estremità, aggiungere un marcatore sulla punta della linea e un altro in corrispondenza della posizione vicino alla punta.
- Deselezionate l'icona alla barra degli strumenti marker marcatore.
- Posizionare un cursore al centro dei marcatori alla punta.
- Selezionare "Angle rapida Misura" sotto "Strumenti" nella scheda.
- Tasto destro del mouse nella finestra di tracciare e deselezionare l'opzione "continua".
- Utilizzare le linee di gomma banda e misurare un angolo di 90 °.
- Premere il tasto "Invio", dopo una finestra di dialogo è spuntato.
- Tasto sinistro tegli tracciando finestra in modo che una nuova linea può essere esteso perpendicolarmente dalla punta.
- Tracciare un'altra linea nuova esattamente nello stesso modo in un'altra estremità.
- Due confini sono creati all'interno della quale il numero di RGC viene contato.
- Scegli un confine come linea di esclusione che i tocchi di cella non viene conteggiato.
- Selezionare un tipo di marcatore e allegare uno per ogni cella dal vivo.
- Selezionare un altro tipo di marcatore per le cellule morte.
- Il numero di ciascun tipo di marker posizionati verrà visualizzato insieme l'icona marcatore conseguenza alla barra marcatore.
- Selezionare la modalità Editing e prendete la linea di base del profilo. Tasto destro del mouse nella finestra di tracciare e rinominare la linea.
- La lunghezza della linea di base contorno può essere ottenuta premendo "Measurement Contour" pulsante.
- Il numero delle cellule possono quindi essere espresso per mm di lunghezza.
- Selezionare "Salva con nome" sotto "File" tab. Ilrintracciamento e ai dati dei marcatori possono essere salvati come file di dati.
5. Misurare le dimensioni della cella di una cella RGC
- Selezionare "Apri immagine" sotto il "File" tab. Scegli l'immagine di una regione desiderata della retina che si desidera analizzare.
- Zoom in una cella dal vivo e scegliere il tipo di linea di contorno dalla casella di riepilogo a discesa della barra degli strumenti principale.
- Disegnare una linea di contorno lungo la circonferenza della cella.
- Verso la fine, tasto destro del mouse la finestra di rintracciare e selezionare "contorno vicino End".
- L'area della cella verrà visualizzato sotto la voce di Area nella finestra di dialogo di misurazione Contour.
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Discussion
1. Come ottenere una misurazione più accurata dello spessore?
È possibile ingrandire l'immagine facendo clic su "Zoom in" e il pulsante sinistro del mouse nella finestra di tracciamento. Il bordo INL può essere visto chiaramente. Se la punta della linea non è al bordo esterno della INL, siamo in grado di regolare la linea sotto la modalità Editing. Dopo aver scelto la linea interessata, tasto destro del mouse la finestra di rintracciare e selezionare "Inserisci Point in Contour Selected". Un punto può essere aggiunto al bordo esterno, mentre il punto di aggiunta dovrebbe essere lungo la stessa linea. Quindi, è necessario eliminare il punto originale e una linea con una lunghezza più accurata può essere ottenuto.
2. Come per mantenere 90 ° della linea elastico?
Dopo una finestra di dialogo che mostra il grado è fuoriuscito, è necessario tenere il mouse sempre tenendo premuto il tasto "Enter". Poi, ha lasciato fare clic sulla finestra in modo da tracciare una nuova linea si possono trarre.
3. Come le cellule vive e c mortiells aspetto?
Le celle in una forma approssimativamente rotonda con citoplasma e nucleo chiaramente osservato sono considerati RGC vivi. Tali celle relativamente piccole e condensato sono considerati come cellule morte.
4. Tali campioni sono stati sottoposti retina colorazione H & E nel protocollo corrente. E 'possibile misurare il campione retina con colorazione fluorescente?
Sì. Sebbene protocollo corrente è in EE colorazione sezioni retiniche, il campione retinica con colorazione fluorescente può anche essere misurare nello stesso modo. Ad esempio, come mostrato nella Figura 1 usando colorazione DAPI, tutti i nuclei sarà macchiata e visualizzato in colore blu sotto un filtro 405 nm. I nuclei nello strato di cellule del ganglio retinico (RGCL), strato interno nucleare (INL) e strato nucleare esterno (ONL) può essere visto. Poi lo spessore degli strati differenti può essere rilevata in modo simile dimostrata in questo video.
Figura 1.
Circa le dimensioni dei diversi segnali colorati fluorescenti, il nostro gruppo ha pubblicato un documento di circa circa le dimensioni di neuroni nel RGCL in un topo modello di glaucoma (Luo et al, 2009).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro sulla ricerca di occhio in questo laboratorio è sostenuto da American Health Foundation Assistant, Azalea (1972) fondo di dotazione, e il Fondo Progetto HKU Small (20097176185).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
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- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
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