Summary
このビデオでは、内顆粒層の厚さ、網膜神経節細胞（RGC）の数を定量化し、RGCのサイズを測定する測定含まれる網膜の形態学的分析、3つのタイプを示しています。技術は、形態学的解析のためのシンプルでありながら科学的なプラットフォームを提供することができます。
Abstract
網膜切片の形態学的分析は、網膜疾患を調べるに使用されている。例については、神経細胞が大幅にN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）誘発性興奮1、網膜虚血再灌流障害2、緑内障3ラットモデルの網膜神経節細胞層（RGCL）で失われた。 INLおよび内網状層の減少（IPL）は、カイニン酸介在型グルタミン酸興奮毒性4に受けたラットの目にシチコリン治療と逆転した厚さ。 RGC密度とソーマのサイズの変化は、眼圧上昇3,5,6の目に別の薬物治療で観察した。したがって、網膜morphometriesを分析する客観的方法を持つことは、網膜の病態と治療戦略の有効性を評価する上で大きな意義であるかもしれない。
網膜の構造は、マルチレイヤーとニューロンEXIいくつかの異なる種類です。網膜の聖。そのような細胞数、細胞の大きさと異なった層の厚さとして、網膜の形態学的パラメータは、細胞培養系よりも複雑です。早い段階で、これらのパラメータは他の市販のイメージングソフトウェアを使用して検出することができます。値は相対値で、通常であり、正確な値に変更すると、さらに正確な計算が必要な場合があります。また、セルサイズと形態のトレースは、特に慢性緑内障モデルでは、正確な統計分析のための十分な感度ではありません。このプロトコルで使用されている測定値は、より正確かつ簡単な方法を提供しました。セルの行とサイズの絶対的な長さは、直接他のファイルにコピーすることが簡単に報告することができます。たとえば、我々は、INLの内側と外側の最も核のマージンを追跡して、厚さを測定するために90度の角度を描画するソフトウェアを使用してラインを形成した。ソフトウェアの助けを借りずに、多分斜線と網膜の厚さの変化がしれませんが個々のオブザーバーの間で再現性がありません。さらに、RGCの数と密度も定量することができる。このプロトコルは、成功すると、網膜の機能を定量の変動を減少させる最小限の変更を検出する感度を向上させます。
このビデオでは、網膜切片の形態学的分析の3種類のデモンストレーションを行います。彼らは、RGCの数を定量化し、絶対値でRGCのサイズを測定し、INLの厚さを測定しています。これらの3つの解析は、ステレオ調査官（ - MicroBrightField株式会社MBFバイオサイエンス）を用いて行われています。技術は、形態学的解析のためのシンプルでありながら科学的なプラットフォームを提供することができます。
Protocol
1。ツール
顕微鏡、ニコン
ステレオ調査官、MBFバイオサイエンス - MicroBrightField株式会社
2。準備
- 任意の形態学的分析の作業を行う前に、それぞれの網膜サンプルは、4ミクロンの厚さで切片であり、H＆E染色を受ける。
- 上部の周辺領域、上部の中央部、下側の周辺領域と、下部中央の領域 - 網膜セクションは4つの領域に分割されています。
- 領域を定義した後、各領域の画像は、ニコンの明るい光顕微鏡下で10X40倍率で取得されます。
- 今、私たちは、網膜の形態計測分析を行うことができます。
3。 INLの厚さを測定
- 各地域のINLの厚さの4つの測定値を測定した。 4行は、INLの外側の境界に輪郭のベースラインから垂直に描画されます。
- ステレオ捜査官と呼ばれるソフトウェアを開き、メインツールバーから40倍レンズを選択します。
- タブの "ファイル"の下の "画像を開く"を選択します。あなたが分析したいことが望ま網膜領域の画像を選択します。
- メインツールバーのドロップダウンリストボックスから、輪郭線の種類を選択し、 "自動移動"ボタンを押してください。
- 右のトレースウィンドウ内をクリックし、 "単純なクリックしてトレース"を選択してください。
- INLの内側の境界に沿って輪郭線を描画します。
- 描画が完了したら、右側のトレースウィンドウ内をクリックし、 "終了オープン輪郭"を選択します。
- マーカーツールバーでマーカーを選択して、接合点にマーカーを追加します。
- すべてのマーカーを追加した後、マーカーツールバーでマーカーのアイコンを選択解除します。
- マーカーの1つの中心にカーソルを置きます。
- "クイックを選択します。ツール ""タブの下で、 "角度を測定します。
- 右のトレースウィンドウ内をクリックし、 "連続"オプションの選択を解除します。
- 最初の行セグメントの終点のために選択マーカーに隣接しているマーカーの中心にクリックして、角度を測定します。
- その後、当該マーカーの中央にマウスを移動し、再度クリックします。
- INLの外側の境界線にゴムバンド線を拡張します。
- 90°に達するまでの角度を調整します。
- 任意の位置で左クリックします。角度測定を示すダイアログボックスが右クリックした後にポップアップ表示されます。
- 押すまだマウスを押しながら "Enter"キーを。
- ラインが1つの端から新たに選択最後に描画されるように、トレースウィンドウを左クリックしてください。
- 右のトレースウィンドウ内をクリックし、 "終了オープン輪郭"を選択します。
- 前述のようにまったく同じ方法で異なる位置で他の線を描画します。
- すべての行を描画した後、編集モードを選択し、それに応じて4ラインセグメントの名前を変更します。
- 4つの測定は、 "輪郭測定"ボタンを押すことによって得ることができます。
- これらの4つの測定値を選択し、 "クリップボードにコピー"をクリックしてスプレッドシートに貼り付けることができます。
- 選択したタブの "ファイル"の下に "名前を付けて保存"。トレースデータは、データファイルとして保存することができます。
- タブの "ファイル"の下の "画像を開く"を選択します。あなたが分析したいことが望ま網膜領域の画像を選択します。
- メインツールバーのドロップダウンリストボックスから、輪郭線の種類を選択します。
- 神経線維層（NFL）の境界に沿って輪郭線を描画します。
- オプションの "Endオープン輪郭"でトレースを終了します。
- それぞれの終わりに、1行の先端にマーカーと先端に近い位置で別のを追加します。
- マーカーツールバーのマーカーアイコンを選択解除します。
- 先端のマーカーの中心にカーソルを置きます。
- タブの "ツール"の下にある "クイック測定角度"を選択します。
- 右のトレースウィンドウ内をクリックし、 "連続"オプションの選択を解除します。
- ゴムバンド線を調整し、90°の角度を測定します。
- ダイアログボックスがポップアップされた後、 "Enter"キーを押します。
- 左クリックトン彼は、新しい行が垂直に先端から延長することができるようにウィンドウをトレースします。
- もう終わりにまったく同じ方法で別の新しい線を引く。
- 2つの境界は、RGCの数がカウントされている内に作成されます。
- セルタッチがカウントされません除外ラインとして1つの境界線を選択してください。
- マーカーのいずれかのタイプを選択し、各ライブセルに1を添付してください。
- 死んだ細胞のマーカーの別のタイプを選択します。
- に設定されたマーカーの種類ごとの数は、マーカーのツールバーに応じてマーカーアイコンの横に表示されます。
- 編集モードを選択し、輪郭のベースラインを拾う。右のトレースウィンドウ内をクリックし、行の名前を変更します。
- コンターラインの長さは、 "輪郭測定"ボタンを押すことによって得ることができます。
- 細胞の数は、長さのmm当たり表現することができます。
- 選択したタブの "ファイル"の下に "名前を付けて保存"。ザトレースとマーカデータは、データファイルとして保存することができます。
5。 RGCセルのセルサイズを測定する
- タブの "ファイル"の下の "画像を開く"を選択します。あなたが分析したいことが望ま網膜領域の画像を選択します。
- 生細胞でのズームとメインツールバーのドロップダウンリストボックスから、輪郭線の種類を選択します。
- セルの円周に沿って輪郭線を描画します。
- 約終了時には、右のトレースウィンドウをクリックすると "Endに近い輪郭"を選択してください。
- セルの面積は輪郭測定]ダイアログボックスでエリアの項目の下に表示されます。
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Discussion
1。より正確な厚さの測定値を得る方法は？
あなたは、トレースウィンドウ内のボタンと左クリック "ズーム"をクリックして画像を拡大することができます。 INL境界線がはっきりと見ることができます。ラインの先端がINLの外側の境界でない場合は、我々は、編集モードで行を調整することができます。関係線を選んだ後、右のトレースウィンドウをクリックして "選択した輪郭で挿入ポイント"を選択します。追加された点は、同じラインに沿っている必要がありますがポイントは、外側の境界線で追加することができます。その後、元のポイントを削除する必要がありますとより正確な長さのラインを得ることができます。
2。ゴムバンド線の90°を維持するには？
度を示すダイアログボックスがポップアップ表示されたら、 "Enter"キーを押しながら、まだマウスを保持する必要があります。その後、新しい行を描画することができるように、トレースウィンドウを左クリックしてください。
3。どのように生きている細胞と死んだCを行うellsは次のように？
明瞭に観察細胞質と核とほぼ円形で、これらの細胞は、ライブのRGCとみなされます。それらの比較的小さいと凝縮した細胞は死細胞と見なされます。
4。これらの網膜サンプルは、現在のプロトコルではH＆E染色を施しました。それは、蛍光染色で網膜のサンプルを測定することは可能ですか？
はい。現在のプロトコルは、H＆E染色網膜切片にあるが、蛍光染色した網膜のサンプルも同じように測定することができます。 DAPI染色を用いて図1に示すように、たとえば、すべての核は、フィルタ405 nmの下の色で染色し、可視化青になります。網膜神経節細胞層（RGCL）、内顆粒層（INL）と外核層（ONL）の核を見ることができます。その後、別の層の厚さはこのビデオで示され、同様の方法で検出することができます。
図1。
異なる染色された蛍光シグナルの大きさについて、当社グループは、ラット緑内障モデル（Luoら、2009）でRGCLのニューロンほどの大きさに関する論文を発表しました。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究室で目の研究の仕事はアメリカの健康アシスタント財団、ツツジ（1972）基本財産基金、およびHKU小規模プロジェクト基金（20097176185）でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Investigator | MicroBright Field | ||
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 |
References
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