Summary
Adult-geboren Neuronen exprimiert ChR2 kann in Scheiben elektrophysiologischen Vorbereitungen manipuliert werden, um ihren Beitrag zur Funktion des olfaktorischen neuronale Schaltkreise zu untersuchen.
Abstract
Standard-Scheibe Elektrophysiologie konnten die Forscher einzelnen Komponenten des neuronalen Schaltkreisen durch die Aufnahme elektrischen Reaktionen der einzelnen Zellen in Reaktion auf elektrische oder pharmakologische Manipulationen 1,2 Sonde. Mit der Erfindung von Methoden zur optischen Kontrolle genetisch gezielt Neuronen (Optogenetik), Forscher haben nun ein beispielloses Maß an Kontrolle über bestimmte Gruppen von Neuronen in der Standard-Scheibe Vorbereitung. Insbesondere erlaubt lichtempfindliche Channelrhodopsin-2 (ChR2) Forscher Neuronen mit Licht 3,4 aktivieren. Durch die Kombination sorgfältige Kalibrierung des LED-basierte Photostimulation von ChR2 mit Standard-Scheibe Elektrophysiologie, sind wir in der Lage, mit mehr Details Sonde die Rolle der Erwachsenen-geboren Interneuronen im Riechkolben, die erste zentrale Relais des olfaktorischen Systems. Mit viralen Ausdruck ChR2-YFP speziell im Erwachsenenalter geboren Neuronen, können wir selektiv steuern, junge Erwachsene geboren Neuronen in einem Milieu älter eind reifen Neuronen. Unsere optische Kontrolle benutzt eine einfache und kostengünstige LED-System, und wir zeigen, wie dieses System kalibriert werden, um zu verstehen, wie viel Licht benötigt wird, zu evozieren spiking Aktivität in einzelnen Neuronen werden. Somit können kurze Blitze aus blauem Licht fernsteuern das Feuern Muster von ChR2-transduzierten neugeborenen Zellen.
Protocol
1. Optical Calibration: Mess-LED Power
- Bringen Sie ein LED-Array in einen Kühlkörper aktiv durch einen Lüfter aus und bringen diese LED / Kühlkörper aparatus eine Kollimationslinse gekühlt.
- Ersetzen Sie die Lampe in Hellfeld-Beleuchtung mit LED / Kühlkörper / Lüfter / Linsenapparat verwendet. Dieses Gerät muss sorgfältig positioniert werden, so dass die gebündelte LED-Strahl entlang einer geraden optischen Weg der Kondensorlinse Reisen. Sicherstellen, dass die Kühlkörper / Lüfter korrekt an das System der gemeinsamen geerdet.
- Fahren Sie die LED-Array mit einer Stromversorgung, die schnell und Platz Stromimpulse geben kann. Dieses Netzteil kann durch eine 5V TTL-Puls aus einem Impulsgeber gesteuert werden.
- Zentrum der gebündelten Strahl entlang der Lichtweg zwischen der Leuchtfeldblende und die Kondensorlinse definiert. Im Idealfall wird der LED-Strahl leicht überfüllen vollständig geöffnet Feldblende. Typischerweise wird ein enger kollimiert LED Balken füllen diese Öffnung weniger, und wird mor produzierene Macht auf Kosten der Einheitlichkeit. In unserer Einrichtung haben wir mehr Licht Einheitlichkeit, indem Sie eine Sammellinse, dass eine leicht erweiterte Bild des LED-Arrays an seinem konjugierten Ebene an der consenser Membran projiziert.
- Erzielen Kohler Beleuchtung durch die Fokussierung des Kondensators, so dass das Bild der Leuchtfeldblende (das Zwerchfell am nächsten an der Lichtquelle) auf der Scheibe Kammer (Abb. 1) ausgerichtet ist. Eine dünne Gewebe der Linse Papier kann als Projektionsfläche zu handeln, um das fokussierte Bild der Leuchtfeldblende in anderen Tiefen zu visualisieren.
- Drill einer Reihe von Nadelstichen von bekanntem Durchmesser in einem undurchsichtigen Material. Legen Sie eine dieser kleinen Nadelstiche über den Sensor einer optischen Leistung Meter. Setzen Sie den Leistungsmesser auf dem Objekttisch und Zentrum der Macht Meter über dem scharfes Bild der Leuchtfeldblende durch einfaches Verschieben Sie das Power Meter, bis es ein Maximum Lesen gibt. Bringen Sie den Leistungsmesser in dieser Position.
- Vollständig geöffnet Öffnungen (aperature Membran undLeuchtfeldblende). Systematisch bewegen Sie den beigefügten Scheibe Kammer / Leistungsmesser relativ zur optischen Lichtweg und berechnen Sie die Einheitlichkeit der optischen Leistung innerhalb der ausgeleuchteten Fläche. Erstellen Sie die Einheitlichkeit Grundstück für Ihr System. Wenn das Mikroskop richtig Setup mit Kohler-Beleuchtung an der Zielsetzung der Fokus zentriert, sollten maximale Leistung direkt unter das Ziel sein, und Regionen außerhalb dieser Schwerpunkt sollte nun eine bekannte Menge an Energie entsprechend der Einheitlichkeit Grundstück.
- Für jede Größe Lochkamera bauen eine Standardkurve der optischen Leistung vs Pinhole Oberfläche. Durch die Anpassung der Eingangsstrom auf das LED-Array, produzieren diese Kurve mit mehreren Leistungsstufen und aus jeder Kurve berechnen die Leistung pro mm2. Wenn die LED-Array ist für das Patchen Optik verwendet werden, stellen Sie sicher, um optische Elemente, die für das Patchen (Kondensatoren, Pinholes und Filter) einzuführen, zu wissen, wie viel Licht unter das Patchen Beleuchtung übertragen wird.
- Das Umlegen des LeistungsmesserGesicht dem Ziel, die Berechnung der Beleuchtungsstärke bei 470nm, wenn das Quecksilber Lampe eingeschaltet ist.
- Fügen Sie eine Live-Scheibe in die Kammer, und erstellen Sie Standard-Kurven, um die Lichtleistung durch die Streuung Hirngewebe übertragen zu bestimmen.
2. Slicing Verfahren und Elektrophysiologie
Teil A: Slice Vorbereitung
- Anesthetize (60 mg / kg Ketamin und Xylazin 2mg/kg) und köpfen die Maus. Dissect des Gehirns in künstlichen Rückenmarksflüssigkeit (ACSF, in mM: 124 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 Glucose, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, pH 7,4, wenn mit einer Mischung aus sprudelte 95% O2 und 5% CO 2 5,1), dabei nicht auf die Riechkolben Schäden. Trennen Sie die beiden Hemisphären und Ort auf Agar mit dem ventralen Oberfläche auch mit einer Kante (für horizontale Abschnitte).
- Kleben Sie die Agar und dorsale Oberfläche jeder kortikalen Hemisphäre auf die Vibrationatome Futter, und langsam füllt die Badewanne mit eiskaltem ACSF. Scheiben aus Ventralfläche in 300 um Abschnitte, die Übertragung jeden Abschnitt zu warm (34-36 ° C) und Sauerstoff ACSF, so dass sie für 30-45 Minuten zu erholen.
Teil B: Loose-Patch Messung der Schwelle zu Spike
- Nach bringen die Scheiben auf Raumtemperatur für 30 Minuten, sanft statt einer Scheibe in die Aufnahme Kammer des Mikroskops Kammer unter konstanter Perfusion von mit Sauerstoff angereichertem ACSF.
Bei Gefahr von übermäßig stimulierenden ChR2 infizierten Neuronen, kann das Vorhandensein von EYFP-ChR2 unter Epifluoreszenz (Abb. 2a) bestätigt werden - Pull-Glaselektroden auf einer Pipette Abzieher (Sutter P-97). Füllen Sie diese Elektrode mit ACSF. Wenn in der ACSF Bad platziert die Spitze Widerstand sollte zwischen 7-10 MOhm sein.
- Unter fluoreszierende Beleuchtung, in die Scheibe ein gesundes ChR2-EYFP Neuron mit reifen Morphologie zu finden. Auch finden dieses Neurons Soma unter Patchen Optik.
- Mit leichten Überdruck durch die Spitze der Elektrode weitergegeben, senken Sie die Patch-Elektrode in Richtung der identifizierten fluoreszierende Nervenzelle. Als Membran Kontakt hergestellt ist, schnell Freisetzung positiver Druck und geben Sie eine kleine und kurze Betrag von Saug-durch die Spitze. Ein Giga-Ohm-Siegel sollte zwischen der Plasmamembran und die Wände der Patch-Elektrode vorgenommen werden.
- Selbst wenn ein Giga-Seal ist nicht gebildet, wenn die Elektrode ist ausreichend, um ein fluoreszierendes Neuron spiking Aktivität in der Nähe eine messbare lokale Feld Potenzial produzieren sollte. Aktivieren ChR2 in diesem Neuron durch Blinken verschiedenen Dosierungen von Licht. Da Licht-Dosis ist eine Funktion der beiden LED-Leistung und die Dauer berechnen, wie viel Licht notwendig, um ein Aktionspotential an mehreren Kräften und der Dauer (Abb. 2b) hervorrufen wird. Beachten Sie auch, wie viel spiking tritt unter Quecksilberlampe Beleuchtung.
3. Repräsentative Ergebnisse:
Auf unserem Mikroskop (Olympus BX51WI), ist unser LED in line mit 2 Öffnungen und eine Kondensorlinse, so bleibt das ursprüngliche Lichtweg des werkseitig installierten Bogenlampe. Durch die Schließung sowohl der Leuchtfeldblende und die aperature Zwerchfell, erreichen wir Hellfeld Gegensatz ausreichend für Patch Clamp Messungen (Abb. 1b). Bei allen Membranen vollständig öffnen wir setzen die Scheibe, um maximale Lichtleistung für Channelrhodopsin Aktivierung (Abb. 1a). Auf unserem Mikroskop, produziert dieses Patchen Konfiguration Licht-Dichte, die etwa drei Größenordnungen niedriger als die maximale volle Felddichte (4,1 mW / mm 2 versus 6,88 mW / mm 2) ist.
Wir sehen robust Kennzeichnung von Erwachsenen geboren Riechkolben Granulat-und periglomerular Neuronen Wochen nach lentiviralen Infektion der Migration Neuroblasten im rostralen wandernde Bach (Abb. 2a) Eine lose-patch-Aufnahme von einem Erwachsenen geboren ChR2-EYFP Ausdruck Körnerzelle zeigt an, dass ein 5 ms Stimulation Maximeum Macht (6,88 mW / mm 2) ist ausreichend, um hervorzurufen spiking (Abb. 2b). Seit Ausdruck variiert zwischen den Zellen, wird die Menge an Licht, dass die Schwelle geht auf Spike variieren und sollte statistisch für jeden Zelltyp des Interesses beschrieben werden.
Abbildung 1. LED-Array-Setup für Full-Field Photostimulation und Patch-Clamp-Elektrophysiologie Scheibe. So aktivieren Sie Channelrhodopsin (ChR2) projizieren wir einen gebündelten Strahl durch offene Rückseite Öffnungen und Kondensoroptik (a). Diese Konfiguration kann in hohem Kontrast Patchen Optik durch die vollständige Schließen der Leuchtfeldblende und die Modulation der Breite des Feldes Membran (b) geändert werden. Abkürzungen: a. Lüfter, b. Kühlkörper, c. LED-Array, d. Kollimationslinse, e. Spiegel, f. Feldblende, g. Aperturblende, h. Kondensorlinse, i. sample Bühne, j. Ziel.
Abbildung 2. Das Bild einer 300 pm horizontale Scheibe Riechkolben für Patch-Clamp-und Ganzfeld-Photostimulation (a). Lentivirally infizierten Erwachsenen geboren Körnerzellen Ausdruck ChR2-EYFP sehen strahlenförmig von der Kern der Riechkolben werden. Die Licht-Dosis erforderlich zu evozieren spiking kann durch Erhöhung der Dauer der LED-Blitz (b) gefunden werden. Der Schwellenwert für diese Körnerzelle war Voll-LED-Intensität (2.43mW/mm 2) 5ms. Maßstab in (a) = 500 um, Maßstab in (b) = 50ms.
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Discussion
In den letzten Jahren haben zu einer Explosion in der Popularität von optogenetische Werkzeuge für die neurowissenschaftliche Forschung 6 zu sehen. Als Ergebnis wird es immer wichtiger, um die Hürde für Labors wollen beginnen mit diesen neuen Instrumenten zu senken. Hier beschreiben wir, wie eine einfache und kostengünstige Nachrüstung und Kalibrierung eines herkömmlichen Patch-Clamp-rig durchzuführen, so dass es Full-Field-optische Stimulation Channelrhodopsin-exprimierenden Neuronen tun können. Insbesondere wenden wir diese Technik, um das Studium der Riechkolben adulte Neurogenese gezielt zu steuern neu geboren Neuronen mit Licht.
Wir zeigen, wie Sie feststellen können, ob eine LED-Lichtquelle erzeugt genügend Strom für ChR2 Aktivierung und zeigen, wie die eigensicheren schnellen on / off Geschwindigkeit von LEDs können problemlos regeln die Dosierung von Licht für Neuronen. Während unserem Labor erfolgreich diese Technik verwendet, gibt es alternative Möglichkeiten des Aussetzens Neuronen kontrollierten Dosen von Licht jedes with seine eigenen Vorteile und Nachteile.
Wenn mehr optische Leistung benötigt wird, werden viele Quecksilber-Lampen erzeugen deutlich mehr Licht als ein LED-Array und einem Mikroskop das Ziel und Filter-Sets sind bereits vorhanden, um die gewünschten Wellenlängen auf die Probe zu konzentrieren. Doch mit dieser Lösung weder die Macht noch die Dauer der Exposition kann leicht kontrolliert werden. Dauer der Exposition müsste von einem externen Auslöser gesteuert werden, und diese sind oft teurer als ein LED-Array und die Macht müsste abgeschwächt werden, indem Neutralfilter um den Lichtweg zu - bei Gefahr, dass Vibrationen, würde die die Erfolgsquote der Patch-Clamp-Experimenten.
Unsere Implementierung macht es auch schwierig, die räumliche Ausdehnung der Beleuchtung zu steuern. Wenn Spotbeleuchtung erwünscht ist, bestimmte Gruppen von Neuronen exprimiert ChR2 Ziel ist eine Lösung für einen Laserspot mit einem galvometer Scanspiegel um verschiedene Scan-Standorte auf der Scheibe. An diesem Punkt aber beginnt das Mikroskop zu einem konventionellen konfokalen Mikroskop in beiden Komplexität und Kosten zu ähneln. Eine kürzlich entwickelte Alternative besteht darin, das Bild einer Mikro-LED-Array auf die Probe 7 zu konzentrieren, oder ein einheitliches Gebiet der Anregung mit einer digitalen Mikrospiegel Einrichtung 8 Form.
LED-Arrays haben deutliche Vorteile, die sie eindeutig Channelrhodopsin Stimulation geeignet machen. Ihre on / off speed tritt auf Nanosekunden-Zeitskala und so dieser Geschwindigkeit kann zur Feinabstimmung der Dauer der Lichteinwirkung auf biologische Gewebe. Darüber hinaus können die Farbe der LEDs gewählt, um spezifische Anregung Bands, ohne die Notwendigkeit für die Filterung angepasst werden. Mit dem Aufkommen der Rotverschiebung Channelrhodopsin Mutanten, wäre es einfach, zwei LEDs in verschiedenen Farben zu verwenden, um individuell zu erregen zwei verschiedene Populationen von Neuronen. Alternativ, weiße LED-Arrays - wie in diesem Bericht verwendet werden, die blau kombiniert (450 nm pEAK) und grün (550nm Peak) Gallium-Nitrid-Dioden - sind breit-Spektrum, das die Ermittler die Freiheit gibt, ein breites Spektrum an Anregungs-Bands Ziel.
Nach optische Kalibrierung muss jeder Zelltyp, Channelrhodopsin drückt aus, um festzustellen, wie viel Licht benötigt wird, um ein Aktionspotential auslösen werden. Wir beschreiben eine einfache elektrophysiologische Charakterisierung mittels der loose-Patch-Methode, die den Vorteil der Vermeidung Veränderung der Zelle interne Dynamik mit der Pipette Lösung hat. Allerdings in einer umfassenden Studie Ganzzellableitungen sind notwendig, um festzustellen, wie viel Licht erzeugt einen bestimmten Betrag der Depolarisation und die Stabilität dieser evozierte Potentiale im Laufe der Zeit. Leider ist die Empfindlichkeit von Spike-Aktivität ans Licht Dosis wird auf eine Reihe von Parametern außerhalb der experimentellen Kontrolle abhängt. Dazu gehören die Höhe der ChR2 Ausdruck (in Abhängigkeit von Konstruktion Kopienzahl und Entwicklungsstörungen Regulierung der viralen Abschlussballoter) und die intrinsische biophysikalischen Eigenschaften des Neurons 9.
Die Fluoreszenzintensität der ChR2-EYFP Fusion kann ein Indikator dafür, wie viel Licht benötigt wird, um das Neuron zu Schwelle zu bringen. Es gibt jedoch Nichtlinearitäten in dieser Art von Schätzung verinnerlicht Aggregate des Kanals verursacht und durch Rangieren Leitwerte durch Aktivierung Kanäle distal der Spitze Einleitung Zone verursacht. Letztlich für jede Art von Neuron eine statistische Charakterisierung der Bevölkerung getroffen werden müssen. Diese leidet für die Einschränkung, dass nur schwach fluoreszierende Zellen schwierig zu patchen, und so virale Konstrukte können von einer zusätzlichen Fluoreszenz-Markierung, die somatisch 10 beschränkt profitieren.
Es ist eindeutig redundant zu einem ChR2 infizierten Neuronen Patch, wenn Licht kann verwendet werden, um ihre spiking Aktivität zu kontrollieren. Eine bessere Nutzung der Optogenetik in-vitro ist die synaptische Verbindung eines optogenetically untersuchenZielgruppe mit anderen Mitgliedern der Schaltung. In unseren Händen, wir haben Vollfeld Stimulation ChR2 Erwachsene geboren Körnerzellen mit Patch Clamp Messungen von Mitralzellen gekoppelt, um die Eigenschaften des neu gebildeten Synapsen zwischen diesen beiden Zelltypen 4 zu messen. Da die Wahrscheinlichkeit einer Verbindung zwischen einem Granulat-und Mitral-Zellen sehr gering ist, war unser Experiment nur durch die gleichzeitige Aktivierung von vielen hundert ChR2 Ausdruck Körnerzellen möglich. Zukünftige Entdeckung neuer genetischer Marker und neue virale Lieferung Methoden zur speziellen neuronalen Populationen label erhöht den Nutzen der in-vitro Optogenetik in verschiedenen Systemen. Insbesondere ist diese Technik ideal geeignet, um spärlich, aber starke Verbindungen zwischen unerwarteten neuronalen Teilmengen 11,12 entdecken. Da die vielfältigen Einsatzmöglichkeiten dieser Technik wächst, so die für eine einfache und kostengünstige Hardware muss das Licht auf in-vitro Scheiben geliefert zu kontrollieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Versicherungsgesellschaft "AG2R-La-Mondiale", Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), die Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-neur-004" im Rahmen des "ERA-NET NEURON unterstützt "des RP7-Programm von der Europäischen Kommission und der Pasteur-Stiftung. Sebastien Wagner wurde von den Letten Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
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