Summary
Adultos nacidos en las neuronas que expresan ChR2 puede ser manipulado en los preparativos rebanada electrofisiológicos para examinar su contribución a la función olfativa de los circuitos neuronales.
Abstract
Electrofisiología rebanada estándar ha permitido a los investigadores para probar los componentes individuales de los circuitos neuronales mediante el registro de las respuestas eléctricas de las células individuales en respuesta a las manipulaciones de 1,2 eléctrica o farmacológica. Con la invención de métodos para controlar ópticamente genéticamente las neuronas específicas (optogenética), los investigadores ahora tienen un nivel sin precedentes de control sobre grupos específicos de neuronas en la preparación rebanada estándar. En particular, fotosensibles canalrodopsina-2 (ChR2) permite a los investigadores para activar las neuronas con luz 3,4. Mediante la combinación de una cuidadosa calibración de LED basada en la fotoestimulación de ChR2 con electrofisiología rebanada estándar, se podrá analizar con mayor detalle el papel de los adultos nacidos en las interneuronas en el bulbo olfatorio, el primer relevo el centro del sistema olfativo. Utilizando la expresión viral de ChR2-YFP específicamente en los adultos nacidos en las neuronas, que pueden controlar de forma selectiva los adultos jóvenes nacidos en las neuronas en un entorno de mayores unad maduro neuronas. Nuestro control óptico utiliza un sistema sencillo y barato LED, y se muestra cómo este sistema puede ser calibrado para comprender cuánta luz se necesita para provocar picos de actividad de neuronas individuales. Por lo tanto, breves destellos de luz azul puede controlar a distancia el patrón de activación de las células transducidas ChR2-recién nacido.
Protocol
1. Calibración óptica: LED de medición
- Adjunte una matriz de LED a un disipador activo refrigerado por un ventilador y poner este mismo aparato LED / disipador de calor a una lente de colimación.
- Cambiar la lámpara utilizada en campo claro de iluminación con LED / disipador / ventilador / aparato de la lente. Este aparato debe ser cuidadosamente colocado de modo que el haz colimado LED viaja en línea recta hacia la óptica de la lente condensadora. Asegúrese de que el disipador / ventilador está correctamente conectado a tierra a un terreno común del sistema.
- Unidad de la matriz de LED con una fuente de alimentación que puede dar pulsos rápidos y de la plaza de la corriente. Esta fuente de alimentación puede ser controlada por un pulso de 5V TTL procedente de un generador de impulsos.
- Centro del haz colimado a lo largo de la trayectoria de la luz se define entre el diafragma de campo y la lente del condensador. Lo ideal sería que el haz LED ligeramente llene excesivamente el diafragma de campo abierto por completo. Por lo general, un haz de luz más bien colimada llenará esta apertura menor, y se produce mortalidade el poder a costa de la uniformidad. En nuestra configuración hemos aumentado uniformidad de la luz por la elección de una lente de colimación que proyecta una imagen un poco más amplia de la matriz de LED en su plano conjugado en el diafragma consenser.
- Alcanzar la iluminación Kohler, centrándose en el condensador para que la imagen del diafragma de campo (el diafragma más cercano a la fuente de luz) se centra en la cámara de corte (fig. 1). Un tejido fino de papel de la lente puede actuar como una pantalla de proyección para visualizar la imagen enfocada del diafragma de campo en otras profundidades.
- Perforar una serie de agujeros de diámetro conocido en un material opaco. Coloque uno de estos pequeños agujeros sobre el sensor de potencia óptica metros. Coloque el medidor de potencia en el escenario de muestras y el centro del medidor de potencia sobre la imagen, centrado en el diafragma de campo con sólo mover el medidor de potencia hasta que se le da una lectura máxima. Colocar el medidor de potencia en esta posición.
- Abra completamente todas las aberturas (diafragma y aperaturecampo de diafragma). Sistemáticamente mover la cámara de corte adjunto / medidor de potencia en relación con el paso de luz óptica y cálculo de la uniformidad de la potencia óptica en el área iluminada. Construcción de la trama la uniformidad de su sistema. Si el microscopio está bien configurada con iluminación Kohler centrado en el foco del objetivo, la potencia máxima debe estar directamente debajo del objetivo, y regiones fuera de este enfoque ahora debe recibir una cantidad conocida de energía de acuerdo con el argumento de uniformidad.
- Para cada tamaño de agujero de alfiler, construir una curva de nivel de potencia óptica frente a la superficie del agujero de alfiler. Mediante el ajuste de la corriente de entrada a la matriz de LED, produce esta curva en varios niveles de potencia y de cada curva de calcular la potencia por mm2. Si el conjunto de LEDs se va a utilizar para la óptica de parches, asegúrese de introducir elementos ópticos necesarios para parchear (condensadores, perforaciones y filtros) para saber la cantidad de luz se transmite bajo la iluminación de parches.
- Dar la vuelta al medidor de potencia parafrente a los objetivos, calcular la intensidad de la iluminación a 470 nm cuando la lámpara de mercurio está encendido.
- Añadir un trozo vivo de la cámara, y la reconstrucción de las curvas de calibración para determinar la potencia de la luz transmitida a través del tejido cerebral de dispersión.
2. Procedimiento de corte y Electrofisiología
Parte A: Preparación Cortar
- Anestesiar (60 mg / kg de ketamina y xilazina 2mg/kg) y decapitar el ratón. Diseccionar el cerebro artificial en el líquido cefalorraquídeo (ACSF, en mM: NaCl 124, KCl 3, 1,3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 glucosa, 2 CaCl2; ~ 310mOsm, pH 7,4, cuando se burbujea con una mezcla de O2 95% y el 5% de CO 2 5,1), teniendo cuidado de no dañar los bulbos olfatorios. Separar los dos hemisferios y el lugar en agar con la superficie ventral, incluso con una ventaja (para las secciones horizontales).
- Pegue el agar y la superficie dorsal de cada hemisferio cortical a la vibrAtome mandril, y poco a poco llenar la bañera con helado de ACSF. Rebanada de la superficie ventral en 300 secciones micras, la transferencia de cada sección para calentar (34-36 ° C) y oxigenada ACSF, que les permita recuperar durante 30-45 minutos.
Parte B: Medición parche suelto del Umbral a Spike
- Después de llevar los cortes a la temperatura ambiente durante 30 minutos, con cuidado coloque una rebanada en la cámara de grabación de la cámara del microscopio en la perfusión constante de ACSF oxigenada.
Corren el riesgo de excesiva estimulación ChR2 neuronas infectadas, la presencia de EYFP-ChR2 se puede confirmar en epifluorescencia (fig. 2a) - Tire de los electrodos de vidrio en un extractor de pipeta (Sutter P-97). Rellene este electrodo con ACSF. Cuando se coloca en el baño de la resistencia ACSF punta debe estar entre 7.10 MOhms.
- Bajo iluminación fluorescente, localizar en el corte una sana ChR2-EYFP neuronas con morfología madura. También localizar soma esta neurona bajo la óptica de parches.
- Con una ligera presión positiva pasa a través de la punta del electrodo, el electrodo inferior parche hacia la neurona identificado fluorescentes. Contacto con la membrana se hace, de forma rápida liberación de presión positiva y aplique una pequeña cantidad y breve de succión a través de la punta. Un sello de giga-ohm debe hacerse entre la membrana plasmática y las paredes de los electrodos de parche.
- Incluso si un giga-sello no se forma, si el electrodo está suficientemente cerca de una actividad de las neuronas fluorescentes adición debe producir un potencial medible de campo local. Activar ChR2 en esta neurona mediante el parpadeo de las diferentes dosis de la luz. Porque la luz de dosis es una función tanto de LED y la duración, calcular cuánta luz es necesaria para provocar un potencial de acción en múltiples poderes y duración (figura 2b). También se observa la cantidad de adición se produce en el mercurio de iluminación de la lámpara.
3. Los resultados representativos:
En nuestro microscopio (Olympus BX51WI), nuestro LED i esn línea con dos aberturas y una lente de condensador, manteniendo así el paso de luz original de la fábrica instalada lámpara de arco. Al cerrar tanto el diafragma de campo y el diafragma aperature, podemos lograr el contraste suficiente para grabaciones de campo claro de patch clamp (fig. 1b). Con todos los diafragmas completamente abierto que exponga el sector a la luz de encendido máximo para canalrodopsina activación (fig. 1a). En nuestro microscopio, esta configuración de parches produce la luz-la densidad que es aproximadamente tres órdenes de magnitud menor que la densidad máxima de campo completo (4,1 mW / mm 2 frente a 6,88 mW / mm 2).
Vemos etiquetado robusto de adultos nacidos en gránulos bulbo olfatorio y semanas después de la infección neuronas periglomerular lentiviral de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral (fig. 2a) Una grabación sueltas parche de un solo adulto de origen ChR2-EYFP expresión de células granulares indica que un 5 ms de estimulación en Maximum poder (6,88 mW / mm 2) es suficiente para provocar picos (figura 2b). Dado que el nivel de expresión varía entre las células, la cantidad de luz que pasa el umbral de la punta puede variar y deben ser descritos estadísticamente para cada tipo de célula de interés.
Figura 1. LED de matriz para la configuración de campo completo de la fotoestimulación y patch-clamp electrofisiología rebanada. Para activar canalrodopsina (ChR2) que proyectan un haz colimado a través de aberturas de atrás abierta y la óptica del condensador (a). Esta configuración se puede cambiar en la óptica de parches de alto contraste por completo cerrar el diafragma de campo y la modulación de la anchura del diafragma de campo (b). Abreviaturas: a. ventilador, disipador de calor b., c. serie LED, d. colimador lentes, espejos e., f. diafragma de campo, el diafragma g. de apertura, la lente del condensador h., i. SAetapa MPLE, j. objetivo.
Figura 2. Imagen de una sección horizontal de 300μm bulbo olfatorio de patch clamp y fotoestimulación todo el campo (a). Lentivirally adultos infectados nacidos en las células granulares expresar ChR2-EYFP se puede ver irradiando desde el centro del bulbo olfatorio. La luz de dosis necesarias para provocar picos se puede encontrar mediante el aumento de la duración del flash LED (b). El umbral de esta era de células granulares de 5 ms a plena intensidad LED (2.43mW/mm 2). Escala en (a) = 500μm, la escala en (b) = 50 ms.
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Discussion
En los últimos años han visto una explosión en la popularidad de las herramientas para la investigación en neurociencias optogenetic 6. Como resultado de ello, es cada vez más importante para reducir la barrera de entrada para los laboratorios que deseen comenzar a utilizar estas nuevas herramientas. A continuación se describe cómo llevar a cabo una adaptación fácil y barato y la calibración de un sistema convencional de patch-clamp plataforma para que pueda hacer todo el campo de la estimulación óptica de canalrodopsina neuronas que expresan. En particular, se aplica esta técnica al estudio de la neurogénesis adulta bulbo olfatorio para controlar específicamente las neuronas recién nacidos con la luz.
Demostramos cómo determinar si una fuente de luz LED produce energía suficiente para la activación de ChR2, y demostrar cómo la intrínseca rápido encendido / apagado de velocidad de los LED puede regular la dosis de luz dada a las neuronas. Mientras que nuestro laboratorio ha utilizado con éxito esta técnica, existen formas alternativas de exposición de las neuronas a dosis controladas de luz cada won sus propias ventajas y desventajas.
Si hay más de potencia óptica que se necesita, muchas lámparas de mercurio se producen mucho más luz que una matriz de LED, y establece el objetivo y el filtro de un microscopio ya están presentes en el enfoque de la longitud de onda deseada en la muestra. Sin embargo, con esta solución ni el poder ni la duración de la exposición se puede controlar fácilmente. Duración de la exposición tendrá que ser controlada por un obturador externo, y estas son a menudo más caro que un conjunto de LEDs, y el poder tendría que ser atenuada mediante la adición de filtros de densidad neutra a la trayectoria de la luz - a riesgo de causar vibraciones que reduciría la tasa de éxito de los experimentos de patch-clamp.
Nuestra implementación también hace que sea difícil controlar la extensión espacial de la iluminación. Si la iluminación spot se desea dirigirse a grupos específicos de neuronas que expresan ChR2, una solución consiste en escanear un punto del láser con un espejo de escaneado a diferentes galvometerlugares en el segmento. En este punto, sin embargo, el microscopio comienza a parecerse a un microscopio confocal convencional, tanto en complejidad y costo. Una alternativa desarrollada recientemente es para enfocar la imagen de una matriz de micro-LED en la muestra 7, o para dar forma a un campo uniforme de excitación con una cámara digital de microespejos 8.
Matrices de LED tienen ventajas que los hacen especialmente adecuado para la estimulación canalrodopsina. Su encendido / apagado de velocidad se produce en escalas de tiempo de nanosegundos, y por lo que esta velocidad puede ser usada para ajustar con precisión la duración de la exposición a la luz de los tejidos biológicos. Además, el color de los LEDs pueden ser elegidos para adaptarse a bandas específicas de excitación sin necesidad de filtrado. Con la llegada de desplazada hacia el rojo mutantes canalrodopsina, sería fácil de usar dos LEDs de diferentes colores para excitar individualmente dos diferentes poblaciones de neuronas. Por otra parte, las matrices de LED blanco - como el usado en este informe que combina azul (450 nm pEAK) y verde (550 nm pico) diodos de nitruro de galio - son de amplio espectro que da al investigador la libertad para llegar a un amplio rango de bandas de excitación.
Después de la calibración óptica, cada tipo de célula que expresa canalrodopsina debe caracterizarse para determinar cuánta luz se necesita para evocar un potencial de acción. Se describe una simple caracterización electrofisiológica usando el método de suelta-parche, que tiene la ventaja de evitar cambios en la dinámica interna de la célula con la solución de la pipeta. Sin embargo, en un estudio completo de células enteras grabaciones son necesarias para determinar la cantidad de luz produce una cantidad dada de la despolarización y la estabilidad de estos potenciales evocados a través del tiempo. Por desgracia la sensibilidad de los picos de actividad a la dosis de luz depende de una serie de parámetros fuera de control experimental. Estos incluyen el nivel de ChR2 expresión (en función del número de copias de la construcción y la regulación del desarrollo de la fiesta de graduación viraloter), y las propiedades intrínsecas de biofísica de la neurona 9.
La intensidad de fluorescencia de la fusión ChR2-EYFP puede ser un indicador de cuánta luz es necesaria para que la neurona umbral. Sin embargo, hay linealidad en este tipo de estimación causadas por agregados interiorizado del canal, y por derivación conductancias causada por la activación de los canales de distal a la zona del pico de la iniciación. En última instancia, para cada tipo de neurona una caracterización estadística de la población tendrá que ser hecho. Este sufre por la advertencia de que las células débilmente fluorescentes son difíciles de parche, y así construye viral se pueden beneficiar de una etiqueta adicional fluorescente que se somáticamente restringido 10.
Es claramente redundante para un parche de neuronas infectadas ChR2 si la luz puede ser usado para controlar la actividad de adición. Un mejor uso de la optogenética in vitro consiste en investigar la conectividad sináptica de un optogeneticallydirigidos contra la población con los demás miembros del circuito. En nuestras manos, hemos unido la estimulación con campos llenos de ChR2 células granulares para adultos que nacen con grabaciones de patch clamp de células mitrales para medir las propiedades de las sinapsis recién formadas entre estos dos tipos de células 4. Debido a la probabilidad de que la conectividad entre un gránulo sola y célula mitral es muy baja, nuestro experimento sólo fue posible por la activación simultánea de varios cientos ChR2 que expresan las células granulares. Futuro descubrimiento de nuevos marcadores genéticos y los nuevos métodos de distribución viral de la etiqueta poblaciones neuronales específicas se incrementará la utilidad de la optogenética in-vitro en diferentes sistemas. En particular, esta técnica es ideal para descubrir las conexiones entre las escasas pero fuertes inesperados subconjuntos neuronales 11,12. A medida que la variedad de usos de esta técnica crece, también lo hará la necesidad de hardware simple y de bajo costo para controlar la luz entregada en rodajas in-vitro.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la compañía de seguros de vida ", AG2R-La Mondiale-", Escuela de Neurociencias de París (PEV), la Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-neur-004" en el marco de la "ERA-NET NEURON "del 7 º PM programa por la Comisión Europea y la Fundación Pasteur. Sebastien Wagner fue apoyada por la Fundación Letten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
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