Summary
ChR2 ifade Yetişkin doğmuş nöronlar, koku alma nöral devrelerin işlevini doğru katkıları incelemek amacıyla dilim elektrofizyolojik hazırlıkları manipüle edilebilir.
Abstract
Standart dilim elektrofizyoloji araştırmacılar, elektrik veya farmakolojik manipülasyonlar 1,2 yanıt olarak tek hücre elektriksel yanıtlar kayıt sinir devresi bileşenleri tek tek prob izin verdi . Genetik hedef nöronların (optogenetics) optik kontrol etmek için yöntemler icat sayesinde, araştırmacılar standart bir dilim hazırlık nöronların belirli gruplar üzerinde kontrol görülmemiş bir düzeye sahiptir. Özellikle, araştırmacılar ışık 3,4 nöron aktif hale getirmek için channelrhodopsin-2 (ChR2) ışığa sağlar. LED tabanlı standart dilim elektrofizyoloji ChR2 photostimulation dikkatli kalibrasyon birleştirerek, daha fazla ayrıntı, koku alma ampul, koku alma sisteminin ilk merkezi röle yetişkin doğumlu internöronlar rolü prob. Özellikle yetişkin doğumlu nöronlar ChR2-YFP viral bir ifade kullanarak, biz seçici eski bir ortamda genç bir yetişkin doğumlu nöronlar kontrol edebilirsinizd olgun nöronlar. Optik kontrol, basit ve ucuz bir LED sistemi kullanır ve bu sistem çok fazla ışık, tek nöronların faaliyet spike uyandırmak için gerekli olan anlamak için nasıl kalibre göstermektedir. Bu nedenle, kısa mavi ışık yanıp söner uzaktan ChR2 transduced yeni doğan hücrelerin ateşleme düzenini kontrol edebilirsiniz.
Protocol
1. Optik Kalibrasyon: Ölçme LED Güç
- LED dizisi aktif için bir fan ve yapıştırmayın bu LED / soğutucu aparat collimating objektif ile soğutulan bir soğutucu takın.
- Aydınlık aydınlatma lambası kullanılan LED / soğutucu / fan / lens cihazları ile değiştirin. Bu cihaz dikkatle paralelleştirilmiş LED ışını düz bir optik yoğunlaştırıcı lens doğru yol boyunca hareket şekilde yerleştirilmesi gerekir. Soğutucu / fan sisteminin ortak bir zemin düzgün topraklanmış olduğundan emin olun.
- Sürücü akım hızlı ve kare bakliyat verebilir bir güç kaynağı ile LED dizisi. Bu güç kaynağı bir darbe jeneratörü kaynaklanan bir 5V TTL darbe tarafından kontrol edilebilir.
- Merkezi paralelleştirilmiş ışın alan diyafram ve kondenserin objektif arasında tanımlanan ışık yolu boyunca. İdeal olarak, LED ışın tamamen açılmış alanında diyafram biraz aşırı doldurmayın. Tipik olarak, daha sıkı collimated bir LED ışını bu diyafram daha az dolduracak, ve mor üretecektekdüzelik pahasına e güç. Kurulumu consenser diyafram konjuge düzlemde LED dizi biraz daha genişletilmiş bir görüntü yansıtılır collimating objektif seçerek ışık tekdüzelik arttı.
- Kohler aydınlatma alanında diyafram (ışık kaynağının en yakın diyafram) görüntü dilim odası (Şekil 1) odaklanmış böylece kondansatör odaklanarak elde edin. Mercek kağıdı ince bir doku diğer derinliklerde alan diyafram odaklı görüntü görselleştirmek için bir projeksiyon perdesi olarak hareket edebilir.
- Opak bir madde olarak bilinen bir çapa iğne deliği bir dizi delin. Bu küçük iğne deliği, optik bir güç metre sensör üzerinde tek bir yerde. Alan diyaframın maksimum okuma verir kadar sadece güç metre hareket ettirerek odaklı resmin üzerine numune aşamasında ve merkezi güç ölçer güç ölçer yerleştirin. Bu pozisyonda yapıştırmayın güç ölçer.
- Tüm açıklıkları (diyafram açıklıkları diyafram ve tam olarak açılmasınaalanında diyafram). Sistematik optik lightpath göre ekli dilim haznesi / güç metre taşımak ve optik güç tekdüzelik ışıklı alanı içinde hesaplayabilirsiniz. Sisteminiz için tekdüzelik arsa oluşturun. Mikroskop objektif odak merkezli Kohler aydınlatma ile kurulum doğru ise, maksimum güç doğrudan hedefi altında olmalıdır ve bu odak dışında kalan bölgelerde artık bilinen bir miktar tekdüzelik arsa göre güç almalıdır.
- Iğne deliği her boyutu için optik güç vs iğne deliği yüzey alanı, standart bir eğri oluşturmak. LED diziye giriş akımı ayarlayarak, birden çok güç düzeyinde bu eğri üretmek ve her bir eğri mm2 başına gücünü hesaplamak. LED dizi yama optikler için kullanılacak ise, ışık ne kadar yama aydınlatma altında iletilen bilmek için gerekli yama (kondansatörler, gözeneklerin ve filtreler) optik unsurlarını tanıtmak için emin olun.
- Güç ölçer Flippingcıva lambası açıkken amacı yüz, 470Nm aydınlatma yoğunluğunu hesaplamak.
- Odasının canlı bir dilim ekleyin ve saçılma beyin dokusu üzerinden iletilen ışık gücü belirlemek üzere standart eğrileri yeniden.
2. Dilimleme Usul ve Elektrofizyoloji
Bölüm A: Dilim Hazırlık
- Fare anestezisi (60 mg / kg Ketamin ve 2mg/kg Xylazine) ve başını kesmek. ; Karışımı ile kabarmış ~ 310mOsm, pH 7.4 NaCl 124, 3 KCl, 1.3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 glikoz, 2 CaCl 2: yapay beyin omurilik sıvısı beyin teşrih (ACSF mM % 95 O2 ve% 5, koku ampuller zarar vermemeye özen, 2 5,1) CO . Hatta bir kenarı (yatay bölümler için) ile ventral yüzeyi ile agar iki yarımküresinin ve yer ayırın.
- Tutkal vibr agar ve her kortikal yarımkürenin dorsal yüzeyatome ayna, ve banyo yavaş yavaş buz ACSF ile doldurun. Dilim, ventral yüzeyinden 300 mikron bölümlerde ısıtılmış (34-36 º C) ve her bölümün transfer oksijenli ACSF onları kurtarmak için 30-45 dakika izin verir.
Bölüm B: Gevşek Patch Ölçüm Spike Eşik
- 30 dakika oda sıcaklığında dilim getirerek sonra, yavaşça oksijenli ACSF sürekli perfüzyon altında mikroskop odası kayıt odasında bir dilim koyun.
Aşırı ChR2 enfekte olmuş nöronların uyarıcı riski, EYFP-ChR2 varlığı Epifloresans (şekil 2a) altında teyit edilebilir - Bir pipet çektirmesi (Sutter P-97) cam elektrotlar çekin. Bu elektrot ACSF doldurun. ACSF banyosuna konulduğunda ucu direnci 7-10 Mohms arasında olmalıdır.
- Floresan aydınlatma altında, olgun morfolojisi ile dilim sağlıklı bir ChR2 EYFP nöron bulun. Ayrıca bu yama optik altında nöronun soma bulun.
- Elektrot ucu geçirilir hafif pozitif basınç ile tespit floresan nöron doğru yama elektrot düşük. Membran temas yapıldığında, hızlı bir şekilde bırakın ve pozitif basınç emme ucu ile küçük ve kısa bir miktarda uygulayın. Giga-ohm mühür plazma membran ve yama elektrot duvarları arasında yapılmalıdır.
- Giga-mühür, ölçülebilir bir yerel alan potansiyeli üretmek elektrot floresan nöron aktivitesi spike yeterince yakınsa oluşur. Olsa bile Farklı dozlarda ışık yanıp sönen bu nöron ChR2 etkinleştirin. Hafif doz LED gücü ve süresi, hem de bir fonksiyonu olduğundan, çok fazla ışık nasıl bir aksiyon potansiyeli, birden fazla yetki ve süreleri (şekil 2b) uyandırmak için gerekli hesaplar. Spike cıva lambası aydınlatma altında oluşur ne kadar gözlemliyoruz.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Mikroskopta (Olympus BX51WI), LED i2 menfez ve yoğunlaştırıcı mercek n hattı, böylece orijinal fabrika yüklü ark lambası lightpath sürdürmek. Alan diyafram ve diyafram açıklıkları diyafram kapatarak, yama kelepçe kayıtları (Şekil 1b) yeterli aydınlık kontrast elde edebilirsiniz. Tüm diyaframlar ile tam channelrhodopsin aktivasyonu (şekil 1a) için maksimum ışık gücü dilim maruz açın. Bizim mikroskop, bu yama yapılandırma (4.1 μW / mm 2 karşı 6.88 mW / mm 2), maksimum alan yoğunluğu daha büyüklüğü yaklaşık üç siparişlerin düşük ışık yoğunluğu üretir .
Biz tek bir yetişkin doğumlu ChR2 EYFP granül hücresi ifade belirtir rostral göçmen akımı (şekil 2a) Gevşek bir yama kayıt neuroblasts göç lentiviral enfeksiyonu sonra yetişkin doğumlu koku alma ampul granül ve periglomerular nöronlar hafta sağlam bir etiket maxim 5 ms stimülasyonum güç (6.88 mW / mm 2) spike (şekil 2b) uyandırmak için yeterli olacaktır. Ekspresyon seviyesi hücreleri arasındaki farklılık gösterdiğinden, başak eşiği geçen ışığın miktarı değişebilir ve ilgi her hücre türü için istatistiksel olarak tarif edilmelidir.
Şekil 1 tam saha photostimulation ve patch-kelepçe dilim elektrofizyoloji dizi kurulum LED. Channelrhodopsin etkinleştirmek için (ChR2) açık arka diyafram açıklığı ve kondenser optikler (a) ile bir paralel ışın proje. Bu yapılandırma, tam alanında diyafram kapatma ve modüle alan diyafram genişliği (b), yüksek kontrastlı yama optik içine değiştirilebilir. Kısaltmalar: a. fan, b. soğutucu, c LED dizisi, d. collimating lens, e. ayna, f. alanında diyafram, g. diyafram, h. yoğunlaştırıcı lens, i. sample sahne, j. objektif.
Şekil 2. resmi yama kelepçe ve tüm alan photostimulation için koku alma ampul 300μm yatay dilim (a). Yayılan koku ampul çekirdek ChR2-EYFP ifade Lentivirally enfekte yetişkin doğumlu granül hücreleri görülebilir. Spike uyandırmak için gerekli olan ışık doz, LED flaş, (b) süresi artırılarak bulunabilir. Bu granül hücre için eşik tam LED yoğunluğu (2.43mW/mm 2) 5ms oldu. Ölçeği (a), (b) = 50ms ölçek = 500μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda popülaritesi sinirbilim araştırması, 6 optogenetic araçları bir patlama gördük. Sonuç olarak, bu yeni araçları kullanmaya başlamak isteyen laboratuarlar için giriş bariyer düşürmek için giderek daha önemli. İşte biz bu channelrhodopsin ifade nöronlar tam alan optik stimülasyonu yapabilirsiniz böylece geleneksel bir yama klemp kulesi basit ve düşük maliyetli güçlendirme ve kalibrasyon yapmak için nasıl açıklar. Özellikle, biz, özellikle ışık ile yeni doğan nöronlar kontrol etmek için koku alma ampul yetişkin nöron çalışma için bu tekniği uygulamak.
Biz bir LED ışık kaynağı ChR2 aktivasyonu için yeterli güç üreten olmadığını belirlemek ve nöronlara verilen ışık dozu kolaylıkla ayarlayabilir nasıl özünde hızlı açık / kapalı LED hızı göstermek için nasıl gösterilmektedir. Laboratuarımızda bu tekniğin başarılı olmakla birlikte, kontrollü dozlarda w ışık her nöron açığa alternatif yolları vardıri. kendi yararları ve sakıncaları.
Daha optik güç gerekli ise, çok sayıda cıva lambaları bir LED dizi çok daha fazla ışık üretecek ve bir mikroskop objektif ve filtre setleri örnek üzerine istenen dalga boylarını odak mevcut. Ancak, bu çözüm gücü ne maruz kalma süresi ne kolaylıkla kontrol edilebilir. Maruz kalma uzunluğu harici deklanşör tarafından kontrol edilmesi gerekir ve bu genellikle bir LED dizi daha pahalı ve ışık yolu nötral yoğunluk filtreleri ekleyerek gücü zayıflatılmış olması gerekir azaltacaktır titreşimlere neden daha fazla risk altında patch-kelepçe deneylerde başarı oranı.
Bizim uygulanması da zor mekansal ölçüde aydınlatma kontrol etmek için yapar. ChR2 ifade nöronlar belirli grupları hedef aydınlatması isteniyorsa, bir çözüm galvometer tarama ayna ile farklı bir lazer nokta taramadilim konumları. Bu noktada, ancak mikroskop karmaşıklık ve maliyet hem de geleneksel bir konfokal mikroskop benzemeye başlar. Yakın zamanda geliştirilen bir alternatif örnek üzerine 7 mikro liderliğindeki bir dizi görüntü odaklanmak, ya da bir dijital micromirror 8 cihaz ile düzgün bir alan uyarma şekli.
LED dizilerini, onları benzersiz channelrhodopsin stimülasyon uygun kılan belirgin avantajları var. Onların açma / kapama hızı nanosaniyelik zaman çizelgesi üzerinde oluşur ve bu hız ince biyolojik doku ışığa maruz kalma süresini ayarlamak için kullanılabilir. Buna ek olarak, LED renk filtreleme için gerek kalmadan özel uyarma bantları sığdırmak için seçilebilir. Kırmızı-kaymıştır channelrhodopsin mutantlar gelişi ile, ayrı ayrı iki farklı nöron popülasyonları heyecanlandırmak için farklı renklerde iki LED kullanımı kolay olurdu. Alternatif olarak, beyaz LED dizileri, mavi birleştiren bu raporda kullanılan bir gibi (450nm pEAK) ve yeşil (550nm tepe) galyum nitrür diyotlar araştırmacı uyarma bantlar geniş bir hedef için özgürlük verir, geniş spektrumlu.
Optik kalibrasyon sonra, channelrhodopsin ifade her hücre tipi çok hafif bir eylem potansiyelini uyandırmak için ne kadar gerekli belirlemek için karakterize olmalıdır. Biz, pipetle bir çözüm ile değişen hücrenin iç dinamikleri kaçınmak avantajı vardır gevşek yama yöntemi kullanarak basit bir elektrofizyolojik karakterizasyonu açıklar. Ancak, tam bir çalışmada tüm hücre kayıtları ışık depolarizasyon belirli bir miktarda üretir ve zamanla bu uyarılmış potansiyeller istikrarı ne kadar belirlemek için gerekli. Ne yazık ki, ışık doz etkinlik spike hassasiyeti deneysel kontrolü dışındaki bir takım parametreler bağlıdır. Bu ChR2 ifade düzeyi (yapı kopya sayısı ve viral balo gelişimsel düzenleme fonksiyonuOter) ve nöron 9 içsel biyofiziksel özellikleri.
ChR2 EYFP füzyon floresan yoğunluğu fazla ışık eşiğine nöron getirmek için gerekli olan nasıl bir göstergesi olabilir. Ancak, bu tür kanal içselleştirilmiş agrega neden olduğu tahmin doğrusal olmayan vardır ve başak başlatma bölgesi distalinde kanallarını aktive neden conductances şant. Sonuçta, her nöron tipi için nüfusun bir istatistik karakterizasyonu yapılacak. Loş floresan hücrelerin yama zor ve bu nedenle viral yapıları, ek bir floresan etiket somatik 10 sınırlıdır yarar ihtar çekiyor.
Bu ışık, spike aktivitesini kontrol etmek için kullanılıp kullanılamayacağını ChR2 enfekte nöron yama açıkça gerek yoktur. In-vitro optogenetics daha iyi kullanmak bir optogenetically sinaptik bağlantı araştırmak içindevrenin diğer üyeleri ile birlikte nüfus hedeflenmektedir. Bizim ellerde, biz bu iki hücre tipleri 4 arasındaki yeni kurulan sinaps özelliklerini ölçmek için tam alan uyarımı yama kelepçe kayıtları ile mitral hücreler ChR2 yetişkin doğumlu granül hücreleri birleştiğinde var. Tek bir granül ve mitral hücre arasındaki bağlantı olasılığının çok düşük olduğu için, deney, granül hücrelerinin ifade yüzlerce ChR2 eşzamanlı aktivasyonu ile mümkün oldu. Geleceği keşif yeni genetik belirteçler ve spesifik nöronal nüfusu etiketlemek için yeni viral teslimat yöntemleri, farklı sistemlerin in-vitro optogenetics kullanışlılığı artacaktır . Özellikle, bu tekniğin ideal beklenmedik nöronal altkümelerini 11,12 arasında seyrek ama güçlü bağlantıları keşfetmek için uygundur. Için kullandığı bu tekniği çeşitliliği arttıkça, bu nedenle basit ve düşük maliyetli donanım için in-vitro dilimleri üzerine teslim ışık kontrol etmek için ihtiyacınız olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, hayat sigortası şirketi "AG2R-La Mondiale" Ecole des Nörobilim de Paris (AKP), Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004", "ERA-NET NÖRON çerçevesinde tarafından desteklenen "Avrupa Komisyonu, ve Pasteur Vakfı tarafından FP7 programı. Sebastien Wagner Letten Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
- Nissant, A. Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb. Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).
- Apicella, A. Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli. Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).
- Boyden, E. S. genetically targeted optical control of neural activity. Nature. 8, 1263-1263 (2005).
- Bardy, C. where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).
- Grubb, M. S. Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis. The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).
- Zhang, F. Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems. Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).
- Grossman, N. Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array. Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).
- Dhawale, A. K. Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse. Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).
- Weick, J. P. Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting. Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).
- Toni, N. Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells. Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment. PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.
- Tye, K. M. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
