Summary
Volwassen geboren neuronen die ChR2 kunnen worden gemanipuleerd in slice elektrofysiologische voorbereidingen om hun bijdrage aan de functie van olfactorische neurale circuits te onderzoeken.
Abstract
Standaard slice elektrofysiologie heeft toegestaan onderzoekers om afzonderlijke componenten van neurale circuits sonde door het opnemen van elektrische reacties van enkele cellen in reactie op elektrische of farmacologische manipulaties 1,2. Met de uitvinding van de methoden om optisch controle genetisch gerichte neuronen (optogenetics), onderzoekers hebben nu een ongekend niveau van controle over de specifieke groepen van neuronen in de standaard slice voorbereiding. In het bijzonder lichtgevoelige channelrhodopsin-2 (ChR2) stelt onderzoekers in staat om neuronen te activeren met licht 3,4. Door het combineren van een zorgvuldige kalibratie van LED-gebaseerde fotostimulering van ChR2 met standaard slice elektrofysiologie, we zijn in staat om probe met meer detail de rol van de volwassen geboren interneuronen in de bulbus olfactorius, de eerste centrale relais van de olfactorische systeem. Met behulp van virale uiting van ChR2-YFP specifiek in volwassen geboren neuronen, kunnen we selectief jonge volwassene geboren neuronen in een milieu van ouderen eend volwassen neuronen. Onze optische controle maakt gebruik van een eenvoudige en goedkope LED-systeem, en laten we zien hoe dit systeem kan worden gekalibreerd om te begrijpen hoe veel licht nodig is om op te roepen stekelige activiteit in enkele neuronen. Vandaar dat korte flitsen van blauw licht op afstand het afvuren patroon van ChR2-getransduceerde pasgeboren cellen.
Protocol
1. Optische Kalibratie: Meten LED Power
- Bevestig een LED-array naar een heatsink actief gekoeld door een ventilator en brengen deze LED / heatsink aparatus om een collimeren lens.
- Vervang de lamp gebruikt worden in helderveld verlichting met LED / heatsink / fan / lens apparaat. Dit toestel moet zorgvuldig worden geplaatst, zodat de gecollimeerde LED-straal langs een rechte optische pad naar de condensor lens. Zorg ervoor dat de heatsink / fan is geaard om gemeenschappelijke het systeem aarde.
- Rij de LED-array met een voeding die kan geven snel en vierkante impulsen van stroom. Deze voeding kan worden gecontroleerd door een 5V TTL puls afkomstig van een pulsgenerator.
- Midden van de gerichte lichtstraal langs het lichtpad gedefinieerd tussen de velddiafragma en de condensor lens. In het ideale geval zal de LED-straal iets te vol van de volledig geopende velddiafragma. Meestal zal een strakker gecollimeerde LED-straal Vul dit diafragma minder, en zal produceren more macht ten koste van de uniformiteit. In onze opstelling hebben we meer licht uniformiteit door te kiezen voor een collimeren lens die een lichtjes uitgebreid beeld van de LED-reeks geprojecteerd op zijn geconjugeerde vliegtuig op de consenser membraan.
- Kohler verlichting te bereiken door zich te richten van de condensor zodat het beeld van het veld membraan (het membraan het dichtst bij de lichtbron) is gericht op de slice kamer (fig. 1). Een dunne weefsel van de lens van papier kan fungeren als een projectiescherm aan de scherp beeld van het veld diafragma op andere diepten te visualiseren.
- Boor een reeks gaatjes van bekende diameter in een ondoorzichtig materiaal. Plaats een van deze kleine gaatjes over de sensor van een optische power-meter. Plaats de power meter op het model podium en het centrum van de macht meter boven de scherp beeld van het veld diafragma door simpelweg het verplaatsen van de power meter tot het geeft een maximum lezen. Brengt de power meter in deze positie.
- Volledig open alle openingen (Aperture diafragma envelddiafragma). Systematisch te verplaatsen het bijgevoegde schijfje kamer / power meter ten opzichte van de optische lichtpad en bereken de uniformiteit van de optische macht binnen het verlichte oppervlak. Bouw de uniformiteit plot voor uw systeem. Als de microscoop goed is ingesteld met Kohler verlichting gecentreerd op de focus van de doelstelling van de, moet maximaal vermogen worden direct onder de doelstelling, en de regio's buiten deze aandacht moet krijgen nu een bekende hoeveelheid van stroom op basis van de uniformiteit plot.
- Voor elke grootte van de pinhole, bouwen van een standaard curve van optisch vermogen versus pinhole oppervlakte. Door het aanpassen van de input stroom naar de LED-array, produceren deze curve bij verschillende energieniveaus, en van elke curve berekenen de kracht per mm2. Als de LED-array wordt gebruikt voor het patchen van optica, zorg ervoor dat optische elementen die nodig zijn voor het patchen (condensors, gaatjes en filters) te introduceren om te weten hoeveel licht wordt overgedragen onder patchen verlichting.
- Flipping de wattmeterhet gezicht van de doelstelling, het berekenen van de intensiteit van de verlichting op 470nm wanneer het kwik lamp is ingeschakeld.
- Voeg een live-slice naar de kamer, en weer op te bouwen standaard curves om het licht de macht overgedragen door de verstrooiing hersenweefsel te bepalen.
2. Slicing Procedure en Elektrofysiologie
Deel A: Slice Voorbereiding
- Verdoven (60 mg / kg ketamine en 2mg/kg Xylazine) en onthoofden de muis. Ontleden van de hersenen in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF, in mm: 124 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 glucose, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, pH 7,4 bij borrelen met een mengsel van 95% O2 en 5% CO 2 5,1), zorg ervoor dat u de olfactorische bollen beschadigen. Scheid de twee hersenhelften en leg ze op agar met de buikoppervlakte zelfs met een rand (voor horizontale secties).
- Lijm de agar en de dorsale oppervlak van elke corticale halfrond naar de vibratieAtome chuck, en langzaam het bad vullen met ijskoude ACSF. Slice van buikoppervlakte in 300 micrometer secties, de overdracht van elke sectie om opgewarmd (34-36 ° C) en zuurstof ACSF, om te herstellen gedurende 30-45 minuten.
Deel B: Loose Patch Meting van de Threshold naar Spike
- Na het brengen van de plakjes op kamertemperatuur gedurende 30 minuten, voorzichtig plaats een stukje in de opname kamer van de microscoop kamer onder constante perfusie van zuurstofrijk ACSF.
Het risico van overmatig stimuleren ChR2 geïnfecteerde neuronen, kan de aanwezigheid van EYFP-ChR2 worden bevestigd onder epifluorescentie (fig. 2a) - Trek de glazen elektrodes op een pipet trekker (Sutter P-97). Vul deze elektrode met ACSF. Wanneer geplaatst in het bad ACSF de tip weerstand moet tussen de 70 tot 10 Mohm.
- Bij TL-verlichting, vinden in de slice een gezonde ChR2-EYFP neuron met volwassen morfologie. Ook vinden deze neuron is soma onder patching optiek.
- Met lichte positieve druk doorgegeven via de elektrode tip, hoe lager de patch elektrode naar de geïdentificeerde fluorescerende neuron. Wanneer membraan contact wordt gemaakt, snel los positieve druk en breng een kleine en korte hoeveelheid zuigkracht door de tip. Een giga-ohm afdichting moet worden gemaakt tussen de plasmamembraan en de muren van de patch elektrode.
- Zelfs als een giga-seal is niet gevormd, als de elektrode voldoende dicht bij een fluorescerende neuron stekelige activiteit moet een meetbare lokale veld potentieel te produceren. Activeer ChR2 in dit neuron door te knipperen met verschillende doses van het licht. Omdat licht-dosering is een functie van zowel LED-vermogen en de duur, bereken hoeveel licht nodig is om een actiepotentiaal op te roepen op meerdere bevoegdheden en de duur (fig. 2b). Ook zien hoe veel stekelige gebeurt onder kwiklamp verlichting.
3. Representatieve resultaten:
Op onze microscoop (Olympus BX51WI), onze LED in lijn met twee openingen en een condensor lens, waardoor behoud van de oorspronkelijke lichtpad van de fabriek geïnstalleerde booglamp. Door het sluiten van zowel het gebied van membraan en de Aperture middenrif, kunnen we helderveld contrast voldoende voor patch clamp opnames (fig. 1b). Met alle diafragma helemaal open we de slice bloot aan een maximale licht vermogen voor channelrhodopsin activering (fig. 1a). Op onze microscoop, deze patchen configuratie geeft licht-density, dat is ongeveer drie ordes van grootte lager dan de maximale full-field dichtheid (4,1 μW / mm 2 versus 6,88 mW / mm 2).
We zien robuuste kenmerken van volwassen geboren bulbus olfactorius korrel en periglomerular neuronen weken na de lentivirale infectie van migreren neuroblasts in de rostrale migrerende stroom (fig. 2a) Een los-patch opname van een alleenstaande volwassene geboren ChR2-EYFP uiten van granulaat cel geeft aan dat een 5 ms stimulatie op maximum vermogen (6,88 mW / mm 2) is voldoende om op te roepen stekelige (fig. 2b). Omdat expressie varieert tussen de cellen, zal de hoeveelheid licht die de drempel overgaat op spike variëren en moeten statistisch worden beschreven voor elk celtype van belang.
Figuur 1. LED-array set-up voor full-field fotostimulering en patch-clamp slice elektrofysiologie. Om te activeren channelrhodopsin (ChR2) hebben we het project een gerichte lichtstraal door de open rug openingen en de condensor optiek (een). Deze configuratie kan veranderd worden in een hoog contrast patchen optiek door het volledig sluiten van de velddiafragma en het moduleren van de breedte van het veld membraan (b). Afkortingen: a. fan, b. heatsink, c. LED-array, d. collimeren lens, e. spiegel, f. velddiafragma, g. diafragma, h. condensor lens, i. sample stadium, j. doelstelling.
Figuur 2. Afbeelding van een 300μm horizontale deel van reukorgaan voor patch clamp en hele-field fotostimulering (a). Lentivirally geïnfecteerde volwassen geboren granule cellen die ChR2-EYFP kan worden gezien straalt vanuit de kern van de bulbus olfactorius. De lichte dosis die nodig is op te roepen stekelige kan worden gevonden door het verhogen van de duur van de LED-flitser (b). De drempel voor deze module cel werd 5ms op volle LED-intensiteit (2.43mW/mm 2). Schaal in (a) = 500μm, schaal in (b) = 50ms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De laatste jaren een explosie in de populariteit van optogenetic tools voor neurowetenschappelijk onderzoek 6. Als gevolg hiervan, wordt het steeds belangrijker het verlagen van de drempel van binnenkomst voor laboratoria die willen beginnen met het gebruik van deze nieuwe hulpmiddelen. Hier beschrijven we hoe u een eenvoudige en goedkope aanpassingen en het kalibreren van een conventionele patch-clamp tuig gedrag, zodat het kan full-field optische stimulatie van channelrhodopsin-expressie neuronen doen. In het bijzonder, passen we deze techniek op de studie van bulbus olfactorius volwassen neurogenese specifiek controle pasgeboren neuronen met licht.
Laten we zien hoe om te bepalen of een LED-lichtbron levert voldoende vermogen voor ChR2 activatie, en te tonen hoe de intrinsiek snel aan / uit-snelheid van de LED's kunnen gemakkelijk de dosering van het licht gegeven aan neuronen reguleren. Terwijl onze lab heeft met succes gebruik gemaakt van deze techniek, zijn er alternatieve manieren van het blootstellen van neuronen om gecontroleerde doses van het licht elk wet zijn eigen voordelen en nadelen.
Als er meer optisch vermogen nodig is, zullen veel kwik lampen produceren aanzienlijk meer licht dan een LED-array, en een microscoop de doelstelling en filter sets zijn al aanwezig op de gewenste golflengtes focus op het monster. Echter, met deze oplossing noch de bevoegdheid noch de duur van de blootstelling kunnen gemakkelijk worden gecontroleerd. Duur van de blootstelling zou moeten worden gecontroleerd door een externe sluiter, en deze zijn vaak duurder dan een LED-array, en de kracht zou moeten worden verzwakt door het toevoegen van grijsfilters aan het licht pad - het risico van het veroorzaken van trillingen die zou verminderen het succes van de patch-clamp experimenten.
Onze implementatie maakt het ook moeilijk om de controle van de ruimtelijke omvang van verlichting. Als spot verlichting gewenst is om specifieke groepen van ChR2 uitdrukken neuronen doel, een oplossing is om een laser plek te scannen met een galvometer scanning spiegel naar verschillendelocaties op het schijfje. Op dit punt, maar de microscoop begint te lijken op een conventionele confocale microscoop, zowel in complexiteit en kosten. Een recent ontwikkelde alternatief is om het beeld van een micro-LED-array richten zich op het monster 7, of om een uniform veld van excitatie vorm met een digitale microspiegeltjes 8.
LED-arrays hebben verschillende voordelen waardoor ze bij uitstek geschikt voor channelrhodopsin stimulatie. Hun aan / uit-snelheid vindt plaats op nanoseconde tijdschaal en dus deze snelheid kan worden gebruikt om fijn tunen van de duur van de blootstelling aan licht aan biologische weefsel. Bovendien kan de kleur van de LED's worden gekozen voor specifieke excitatie banden passen zonder de noodzaak voor het filteren. Met de komst van rood-verschoven channelrhodopsin mutanten, zou het eenvoudig om twee LEDs van verschillende kleuren te gebruiken om individueel te prikkelen twee verschillende populaties van neuronen. Als alternatief, witte LED arrays - zoals degene die in dit rapport, dat een combinatie van blauw (450nm pEAK) en groen (550nm piek) gallium nitride diodes - zijn breed-spectrum, die geeft de onderzoeker de vrijheid om een breed scala van excitatie bands doel.
Na de optische kalibratie, moet elk celtype dat channelrhodopsin uitdrukt gekarakteriseerd worden om te bepalen hoeveel licht nodig is om een actiepotentiaal op te roepen. Beschrijven we een eenvoudig elektrofysiologische karakterisatie met behulp van de losse-patch-methode, die het voordeel van het vermijden van het veranderen van de cel interne dynamiek met de pipet oplossing heeft. Echter, in een volledige studie whole-cell opnames zijn nodig om te bepalen hoeveel licht produceert een bepaalde hoeveelheid van de depolarisatie, en de stabiliteit van deze evoked potentials in de tijd. Helaas is de gevoeligheid van spiking activiteit aan het licht dosis is afhankelijk van een aantal parameters buiten de experimentele controle. Deze omvatten het niveau van de ChR2 expressie (een functie van het te bouwen aantal kopieën en ontwikkeling regulering van de virale promoter), en de intrinsieke biofysische eigenschappen van het neuron 9.
De fluorescentie-intensiteit van de ChR2-EYFP fusie kan een indicator van hoeveel licht nodig is om het neuron te brengen drempel. Echter, er zijn niet-lineaire in dit soort van schatting wordt veroorzaakt door geïnternaliseerde aggregaten van kanaal, en door het rangeren conductances veroorzaakt door het activeren van kanalen distaal van de spike initiatie zone. Uiteindelijk is voor elk type neuron een statistische karakterisering van de bevolking zal moeten worden gemaakt. Dit lijdt voor het voorbehoud dat vaag fluorescerende cellen zijn moeilijk op te lappen, en zo virale constructen kunnen baat hebben bij een extra fluorescent label dat somatisch is beperkt 10.
Het is duidelijk overbodig om een ChR2 besmet neuron patch als licht kan worden gebruikt om de spiking activiteit te controleren. Een beter gebruik van optogenetics in-vitro is het onderzoeken van de synaptische connectiviteit van een optogeneticallydoelgroep met andere leden van het circuit. In onze handen, hebben we gekoppeld volledige gebied stimulatie van ChR2 volwassen geboren granule cellen met patch clamp opnamen van mitralisklep cellen naar de eigenschappen van de nieuw gevormde synapsen meten tussen deze twee celtypen 4. Omdat de kans van connectiviteit tussen een korrel en mitralis cel is erg laag, ons experiment was alleen mogelijk door gelijktijdige activering van vele honderden ChR2 uiten granule cellen. Toekomstige ontdekking van nieuwe genetische merkers en nieuwe virale levering methoden om specifieke neuronale populaties label zal de bruikbaarheid van de in-vitro optogenetics in verschillende systemen. In het bijzonder is deze techniek zeer geschikt voor dun, maar sterke verbindingen tussen de onverwachte neuronale subsets 11,12 ontdekken. Als de verscheidenheid van toepassingen voor deze techniek groeit, zal dus de behoefte aan eenvoudige en goedkope hardware om het licht te leveren op in-vitro plakjes controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het leven verzekeringsmaatschappij "AG2R-La Mondiale-" Ecole des Neurowetenschappen de Paris (ENB), het Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-neur-004" in het kader van "ERA-NET NEURON "van KP7 programma door de Europese Commissie, en het Pasteur Foundation. Sebastien Wagner werd gesteund door de Letten Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
- Nissant, A. Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb. Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).
- Apicella, A. Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli. Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).
- Boyden, E. S. genetically targeted optical control of neural activity. Nature. 8, 1263-1263 (2005).
- Bardy, C. where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).
- Grubb, M. S. Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis. The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).
- Zhang, F. Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems. Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).
- Grossman, N. Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array. Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).
- Dhawale, A. K. Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse. Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).
- Weick, J. P. Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting. Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).
- Toni, N. Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells. Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment. PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.
- Tye, K. M. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
