Summary
Adulto-nascido neurônios expressando ChR2 pode ser manipulado em preparações fatia eletrofisiológicos, a fim de examinar sua contribuição para a função olfativa de circuitos neurais.
Abstract
Eletrofisiologia fatia padrão tem permitido aos pesquisadores sondar os componentes individuais dos circuitos neurais gravando respostas elétricas de células individuais em resposta a elétrica ou farmacológica 1,2 manipulações. Com a invenção de métodos para controle de neurônios geneticamente opticamente alvo (optogenética), os pesquisadores agora têm um nível sem precedentes de controle sobre grupos específicos de neurônios na preparação fatia padrão. Em particular, fotossensível channelrodopsina-2 (ChR2) permite que os pesquisadores para ativar os neurônios com 3,4 luz. Ao combinar calibração cuidadosa de LED com base em fotoestimulação de ChR2 com eletrofisiologia fatia padrão, somos capazes de sonda com maior detalhe o papel de adulto-nascido interneurônios no bulbo olfativo, o primeiro relé central do sistema olfativo. Usando a expressão viral de ChR2-YFP especificamente no adulto-nascido neurônios, podemos controlar seletivamente jovens adultos-nascido neurônios em um ambiente de mais umd neurônios maduros. Nosso controle óptico usa um sistema simples e barato LED, e vamos mostrar como esse sistema pode ser calibrado para entender como muita luz é necessária para evocar spiking atividade de neurônios individuais. Por isso, lampejos de luz azul pode controlar remotamente o padrão de disparo de ChR2-transduzidas células recém-nascido.
Protocol
1. Calibração óptico: Power LED de medição
- Anexar uma matriz de LEDs para um dissipador de calor ativa refrigerada por uma ventoinha e apor este aparato LED / dissipador de calor para uma lente colimadora.
- Troque a lâmpada usada em iluminação com LED brightfield / heatsink / fan / aparelho lente. Este aparelho deve ser cuidadosamente posicionado de modo que o feixe colimado LED viaja ao longo de um caminho reto em direção à lente óptica condensador. Verifique se o dissipador de calor / ventilador está devidamente aterrado para um terreno comum do sistema.
- Unidade de matriz LED com uma fonte de alimentação que pode dar pulsos rápidos e quadrado da corrente. Esta fonte de alimentação pode ser controlado por um pulso TTL 5V proveniente de um gerador de pulsos.
- Centro do feixe colimado ao longo do caminho da luz definida entre o diafragma de campo ea lente condensador. Idealmente, o feixe de LED será ligeiramente sobrecarregue o diafragma de campo totalmente aberto. Tipicamente, um feixe mais firmemente colimado LED vai encher esta abertura menos, e vai produzir morpoder e à custa de uniformidade. Em nossa configuração, aumentamos a uniformidade de luz, escolhendo uma lente colimadora que projetam uma imagem ligeiramente ampliada da matriz de LED no seu plano conjugado no diafragma consenser.
- Atingir a iluminação Kohler, concentrando-se o condensador, para que a imagem do diafragma de campo (o diafragma mais próximo da fonte de luz) é focada na câmara de slice (fig. 1). Um tecido de papel fino lente pode agir como uma tela de projeção para visualizar a imagem focalizada do diafragma de campo em outras profundidades.
- Perfurar uma série de furos de diâmetro conhecido em um material opaco. Coloque um desses pequenos furos sobre o sensor óptico de um poder metros. Coloque o medidor de energia no palco exemplar e centro do medidor de energia sobre a imagem focada do diafragma de campo simplesmente movendo o medidor de energia até que dá uma leitura máxima. Apor metros o poder nesta posição.
- Totalmente aberta todas as aberturas (diafragma e Aberturacampo diafragma). Sistematicamente mover a câmara anexada fatia metros / potência em relação ao caminho óptico óptico e calcular a uniformidade de potência óptica dentro da área iluminada. Construir o enredo uniformidade para o seu sistema. Se o microscópio está configurada corretamente com iluminação Kohler centrado em foco o objetivo, a potência máxima deve ser diretamente abaixo do objetivo, e as regiões fora deste foco agora deve receber uma quantidade conhecida de energia de acordo com o enredo uniformidade.
- Para cada tamanho de pinhole, construir uma curva padrão de potência óptica versus superfície pinhole. Ao ajustar a corrente de entrada para a matriz de LED, produzir esta curva em múltiplos níveis de potência e de cada curva de calcular a potência por mm2. Se a matriz de LEDs é para ser usado para correção óptica, certifique-se de introduzir elementos de óptica necessários para remendar (condensadores, pinholes e filtros) para saber a quantidade de luz é transmitido sob iluminação patching.
- Lançando o medidor de potência paraenfrentar o objetivo, calcular a intensidade de iluminação em 470nm quando a lâmpada de mercúrio está ligado.
- Adicionar uma fatia ao vivo para a câmara, e reconstruir as curvas padrão para determinar a potência de luz transmitida através do tecido cerebral de espalhamento.
2. Procedimento corte e Eletrofisiologia
Uma parte: Preparação Slice
- Anestesiar (60 mg / kg cetamina e Xilazina 2mg/kg) e decapitar o mouse. Dissecar o cérebro no líquido cerebral espinhal artificial (ACSF, em mM: 124 NaCl, KCl 3, 1,3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 glicose, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, pH 7,4, quando borbulhou com uma mistura de O2 de 95% e 5% CO 2 5,1), tomando cuidado para não danificar os bulbos olfatórios. Separar os dois hemisférios e colocar em agar com a superfície ventral, mesmo com uma borda (para seções horizontal).
- Cola o ágar e superfície dorsal de cada hemisfério cortical à vibrAtome chuck, e, lentamente, encher a banheira com gelo frio ACSF. Fatia da superfície ventral em 300 seções M, transferindo cada seção para aquecido (34-36 ° C) e ACSF oxigenado, permitindo-lhes recuperar para 30-45 minutos.
Parte B: Medição patch soltas do Threshold para Spike
- Depois de trazer as fatias à temperatura ambiente por 30 minutos, coloque delicadamente uma fatia na câmara de gravação da câmara de microscópio sob perfusão constante de ACSF oxigenado.
Em risco de excessivamente estimulante ChR2 neurônios infectados, a presença de EYFP-ChR2 pode ser confirmado sob epifluorescência (fig. 2) - Puxe eletrodos de vidro em um extrator da pipeta (Sutter P-97). Preencha este eletrodo com ACSF. Quando colocada no banho ACSF a resistência da ponta deve ficar entre 70-10 Mohms.
- Sob iluminação fluorescente, localizar a fatia de um neurônio ChR2-EYFP saudável com morfologia maduro. Também localizar essa soma neurônio sob a ótica patching.
- Com pressão positiva de luz atravessou a ponta do eletrodo, menor o eletrodo de patch para o neurônio identificados fluorescente. Quando o contato da membrana é feita de forma rápida liberação de pressão positiva e aplique uma pequena quantidade e breve de sucção através da ponta. Um selo giga-ohm deve ser feita entre a membrana plasmática e as paredes do eletrodo patch.
- Mesmo que um giga-selo não é formado, se o eletrodo está suficientemente perto de uma atividade dos neurônios fluorescentes spiking deve produzir um potencial campo mensuráveis local. Ativar ChR2 neste neurônio, piscando doses diferentes de luz. Porque a luz da dose é uma função tanto do poder LED e duração, calcular a quantidade de luz que é necessário evocar um potencial de ação em múltiplos poderes e durações (fig. 2b). Também observar o quanto spiking ocorre sob a iluminação de mercúrio da lâmpada.
3. Resultados representativos:
Em nosso microscópio (Olympus BX51WI), o nosso LED é in linha com duas aberturas e uma lente condensador, mantendo assim o caminho óptico original da fábrica instalada lâmpada de arco. Fechando tanto o diafragma de campo e Abertura do diafragma, podemos alcançar contraste brightfield suficientes para gravações de patch-clamp (fig. 1b). Com todos os diafragmas totalmente aberta expomos a fatia ao poder máximo de luz para channelrodopsina ativação (fig. 1a). Em nosso microscópio, essa configuração patching produz luz de densidade que é de aproximadamente três ordens de magnitude menor do que a densidade de campo máxima cheia (4,1 μW / mm 2 versus 6,88 mW / mm 2).
Vemos etiquetagem robusta do adulto-nascido grânulo bulbo olfatório e semanas após a infecção neurônios periglomerular lentiviral de migrar neuroblastos no fluxo migratório rostral (fig. 2) A gravação solta-patch a partir de um único adulto-nascido ChR2-EYFP expressar célula granular indica que a 5 ms na estimulação máximahum alimentação (6,88 mW / mm 2) é suficiente para evocar spiking (fig. 2b). Desde nível de expressão varia entre as células, a quantidade de luz que passa o limiar a espiga vai variar e deve ser descrito estatisticamente para cada tipo de célula de interesse.
Figura 1. LED de configuração matriz para full-campo fotoestimulação e patch-clamp eletrofisiologia fatia. Para ativar channelrodopsina (ChR2) projetamos um feixe colimado através de aberturas dos fundos aberta e óptica condensador (a). Esta configuração pode ser alterada em óptica de alto contraste patching por fechar completamente o diafragma de campo ea largura da modulação do diafragma de campo (b). Abreviaturas: a. ventilador, dissipador de calor b., c. matriz de LEDs, d. colimação lente, espelho e., f. diafragma de campo, g. diafragma de abertura, h. lente condensadora, i. sample palco, j. objetivo.
Figura 2. Imagem de uma fatia horizontal de 300μm bulbo olfatório de patch clamp e de todo o campo fotoestimulação (a). Lentivirally células infectadas pelo adulto-nascido grânulo expressar ChR2-EYFP pode ser visto irradiando a partir do núcleo do bulbo olfatório. A luz da dose necessária para evocar spiking pode ser encontrada, aumentando a duração do flash LED (b). O limite para essa célula granular foi 5ms em intensidade LED completa (2.43mW/mm 2). Escala em (a) = 500μm, escala em (b) = 50ms.
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Discussion
Nos últimos anos temos visto uma explosão na popularidade de ferramentas para pesquisa em neurociência optogenetic 6. Como resultado, é cada vez mais importante para diminuir a barreira de entrada para laboratórios que desejam começar a usar estas novas ferramentas. Aqui nós descrevemos como conduzir uma adaptação simples e de baixo custo e calibração de um equipamento de patch-clamp convencionais, de modo que ele pode fazer de campo total estimulação óptica de channelrodopsina-expressando neurônios. Em particular, nós aplicamos essa técnica para o estudo da neurogênese adulta bulbo olfativo para controlar especificamente os neurônios recém-nascidos com a luz.
Demonstramos como determinar se uma fonte de luz LED produz energia suficiente para ChR2 ativação e demonstrar como a rápida intrinsecamente ligado / desligado velocidade de LEDs pode facilmente regular a dosagem de luz dada aos neurônios. Enquanto nosso laboratório tem utilizado com sucesso esta técnica, existem formas alternativas de expor os neurônios a doses controladas de luz cada wom suas próprias vantagens e desvantagens.
Se mais de potência óptica é necessário, muitas lâmpadas de mercúrio vai produzir muito mais luz do que uma matriz de LEDs, e define objetivos e filtrar um microscópio já estão presentes a concentrar-se os comprimentos de onda desejados para a amostra. No entanto, com esta solução nem o poder nem a duração da exposição pode ser facilmente controlado. Tempo de exposição teria de ser controlado por um obturador externo, e estes são muitas vezes mais caro do que uma matriz de LEDs, eo poder deveria ser atenuada pela adição de filtros de densidade neutra para o caminho da luz - em risco de causar vibrações que reduziria a taxa de sucesso de patch-clamp experimentos.
Nossa implementação também torna mais difícil controlar a extensão espacial de iluminação. Se a iluminação local é desejado para atingir grupos específicos de neurônios expressando ChR2, uma solução é fazer a varredura um ponto a laser com um espelho de varredura galvometer a diferenteslocais sobre a fatia. Neste ponto, no entanto, o microscópio começa a se assemelhar a um microscópio confocal convencional em ambos os complexidade e custo. Uma alternativa desenvolvida recentemente é focar a imagem de um micro-array levou para a amostra 7, ou a forma de um campo uniforme de excitação com um dispositivo de microespelhos digitais 8.
Arrays LED têm vantagens distintas que os tornam especialmente adequado à estimulação channelrodopsina. Sua velocidade on / off ocorre em escalas de tempo nanossegundo e assim esta velocidade pode ser usado para o ajuste fino da duração da exposição à luz ao tecido biológico. Além disso, a cor dos LEDs pode ser escolhida para se adaptar bandas de excitação específica, sem a necessidade de filtragem. Com o advento da vermelho-mudou mutantes channelrodopsina, seria simples de usar dois LEDs de cores diferentes para excitar individualmente duas populações diferentes de neurônios. Alternativamente, branco matrizes LED - como o usado neste relatório que combina azul (450 nm peak) e verde (550nm de pico) diodos de nitreto de gálio - são de amplo espectro que dá ao pesquisador a liberdade de alvo uma ampla gama de bandas de excitação.
Após a calibração óptica, cada tipo de célula que expressa channelrodopsina deve ser caracterizada para determinar quanta luz é necessária para evocar um potencial de ação. Nós descrevemos uma caracterização simples eletrofisiológicas usando o método loose-patch, que tem a vantagem de evitar a mudança da célula dinâmica interna com a solução da pipeta. No entanto, em um estudo completo de célula inteira gravações são necessários para determinar a quantidade de luz produz uma determinada quantidade de despolarização, ea estabilidade destes potenciais evocados ao longo do tempo. Infelizmente a sensibilidade do spiking atividade a dose de luz é depende de uma série de parâmetros fora do controle experimental. Estes incluem o nível de ChR2 expressão (em função do número de cópias construir e regulação do desenvolvimento do prom viraloter), e as propriedades intrínsecas biofísica do neurônio 9.
A intensidade fluorescente da fusão ChR2-EYFP pode ser um indicador da quantidade de luz que é necessário para levar o neurônio a limiar. No entanto, existem não-linearidades neste tipo de estimativa causado por agregados internalizado de canal, e por derivação condutâncias causada pela ativação de canais de distal para a zona de iniciação do ponto. Em última análise, para cada tipo de neurônio uma caracterização estatística da população terá que ser feita. Este sofre por a ressalva de que as células fracamente fluorescentes são difíceis de patch, e assim constrói viral podem beneficiar de uma etiqueta adicional fluorescente que é somaticamente restrito 10.
É claramente redundantes para corrigir um neurônio ChR2 infectados se a luz pode ser usada para controlar a sua actividade spiking. A melhor utilização dos optogenética in-vitro é investigar a conectividade sináptica de um optogeneticallypopulação alvo com outros membros do circuito. Em nossas mãos, temos acoplado estimulação campo cheio de ChR2 células adultas-nascido de grânulos com gravações a partir de células patch clamp mitral para medir as propriedades da sinapse recém-formada entre esses dois tipos de células 4. Porque a probabilidade de conectividade entre um grânulo única e célula mitral é muito baixa, a nossa experiência só foi possível pela ativação simultânea de muitas centenas ChR2 expressando células granulares. Futuras descobertas de novos marcadores genéticos e novos métodos de entrega viral para rotular populações neuronais específicas irá aumentar a utilidade de ensaios in vitro optogenética em diferentes sistemas. Em particular, esta técnica é ideal para descobrir conexões esparsas, mas forte entre inesperado subconjuntos neuronal 11,12. Como a variedade de usos para esta técnica cresce, assim será a necessidade de hardware simples e de baixo custo para controlar a luz entregues no in-vitro fatias.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela empresa de seguros de vida "AG2R-La Mondiale-", Ecole des Neurociências de Paris (PEV), a Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004" no quadro de "NEURON ERA-NET "do 7 º PQ programa pela Comissão Europeia, e da Fundação Pasteur. Sebastien Wagner foi apoiado pela Fundação Letten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Imalgène 1000 | 100 mg/ml | |
| Xylazine | Rompun | 2% | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | &nbps; |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NaHPO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries | Harvard Apparatus | GC150T-10 | 1.5 mm O.D./1.17 mm I.D. |
| LED array | Bridgelux | BXRA-C2000 | |
| Collimating lens | Thorlabs Inc. | LEDC1 | 40 mm beam diameter |
| Power supply | A1W Electronik | HKO2800 | 2.8 amp |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM 100 | |
| Heatsink | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Fan | Thermaltake | A1838 | Silent Boost K8 |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S |
References
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