Craniofacial mesenchyme की electroporation

Summary

Craniofacial cartilages अन्य ऊतकों के साथ निकट संपर्क में विकास और जीवित पशुओं में हेरफेर करने के लिए मुश्किल हैं. हम electroporation का उपयोग कर रहे हैं craniofacial कंकाल के विकास के दौरान आणविक उपकरण वितरित करते हुए जल्दी भ्रूण प्रभाव को दरकिनार. यह दृष्टिकोण हमें कुशलतापूर्वक उम्मीदवार अणुओं का परीक्षण करने के लिए अनुमति देगा<em> Vivo में.</em

Abstract

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse ^1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.

When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis ^11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.

Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers ¹⁴. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (˜100 million years closer) ¹⁵. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Protocol

1A भाग. उपकरण माइक्रोस्कोप: कम शक्ति के उद्देश्य के साथ ईमानदार स्टीरियो – विदारक गुंजाइश वोल्ट / पल्स जनरेटर: BTX ECM 830 स्क्वायर वेव electroporation सिस्टम पिपेट डांड़ी: P-87 micropipette डांड़ी (Sutter साधन कंपनी, सीए) मैनिप्युलेटर: मोटे, या संयुक्त मोटे और ठीक तैयारी पर निर्भर करता है. Micropipette धारक: ठीक है विज्ञान उपकरण इलेक्ट्रोड: घर का बना Electroporation कक्ष: घर का बना एल के आकार इलेक्ट्रोड: उच्च शुद्धता के 8 0.4 मिमी टंगस्टन (गूड) तार और मध्य में प्रत्यय सेमी कट एक 1ml सिरिंज का उपयोग पोटीन (हम Blu-हमले का उपयोग करें). 4 सेमी टंगस्टन एल आकार में सिरिंज और मोड़ टिप टिप से उजागर तार छोड़ दो, अंत से 1 सेमी (छवि 1A). टिप इसलिए कि अंत लंबाई में 0.5 मिमी उपायों छाँटो. टीअपने टिप इलेक्ट्रोड टर्मिनस है. सिरिंज के लिए अतिरिक्त टंगस्टन तार समानांतर चलाने के लिए और इसे का उपयोग करने के लिए इलेक्ट्रोड पल्स जनरेटर कनेक्ट. इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी बनाने प्रक्रिया दोहराएँ. डीसी केबल के माध्यम से एक वर्ग तरंग पल्स जनरेटर के लिए इलेक्ट्रोड संलग्न. Electroporation कक्ष ~ 5 मिमी प्लास्टिसिन गैर विषैले के साथ 90 मिमी पकवान रेखा के नीचे. Electroporation मीडिया के साथ पकवान भरें. का प्रयोग नहीं 5 घड़ीसाज़ संदंश टी आकार की एक अच्छी तरह से (छवि 2) बनाना. लंबे समय अच्छी तरह से ~ 2 x 2 मिमी x 10 मिमी और कम मिमी ~ 2 मिमी x 2 मिमी एक्स 5 मिमी उपाय करना चाहिए. electroporation पकवान और धोया जा सकता है reused. पार्ट 1B. अभिकर्मकों डीएनए या चार्ज बड़े अणुओं Micropipettes: 1 मिमी चौड़े 4 "लंबे borosilicate ग्लास capillaries (डब्ल्यूपीआई, TW100-F) संस्कृति मीडिया: सामान्य एम्फ़िबियाई मीडिया (गुटनिरपेक्ष आंदोलन) > 10 एक्स शेयर: 1100 मिमी NaCl, 20KCL मिमी, 10 मिमी Ca (सं 3) 2 • 4H 2 हे, 1 मिमी EDTA. और डिग्री सेल्सियस 4 पर आटोक्लेव दुकान 1 एक्स गुटनिरपेक्ष आंदोलन: 0.1 मिमी 3 NaHCo और 0.2 मिमी ना 3 4 पीओ के साथ 10x शेयर बफर से पतला . Xenopus laevis tadpoles, 28 मंच डीएनए की तैयारी: अभिव्यक्ति मानक प्रोटोकॉल का उपयोग plasmids तैयार करें. 1 / nuclease मुक्त 0 2 एच में μg μl के अंतिम एकाग्रता के लिए डीएनए Resuspend. * हम एक मजबूत सीएमवी प्रमोटर युक्त pCS2 जैसे वैक्टर के साथ सफलता मिली है. + [16] वंशावली विश्लेषण के लिए, हम आम तौर पर 0.1 μg / μl के अंतिम एकाग्रता में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (pCS2 GFP +) एन्कोडिंग डीएनए शामिल हैं. [0.1-3 μg / μl के बीच डीएनए सांद्रता भी परीक्षण किया गया. हमने पाया है कि 0.8 μg μl / निकम्मेपन लेबल कोशिकाओं नीचे सांद्रता, जबकि डीएनए सांद्रता से अधिक 2 / μg और मीटरयू, एल electroporation दक्षता में सुधार नहीं किया]. Morpholino oligonucleotide तैयारी: (नोट: राज्यमंत्री के लिए fluoresceinated करने की आवश्यकता है (संशोधित 3'-carboxyfluorescein) या अन्यथा चार्ज) Resuspend morpholino (राज्यमंत्री) oligonucleotides (Genetools, www.genetools.com nuclease मुक्त एच 0 2 में 2 मिमी की एकाग्रता में). हीट विभाज्य शेयर समाधान के 65 ° सी 5 मिनट के लिए. Nuclease मुफ्त पानी में 0.5 मिमी की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला. * 0.1-1mm एमओ समाधान परीक्षण किया गया. 0.5 मिमी एमओ समाधान कई mesenchymal कोशिकाओं की electroporation के लिए पर्याप्त थे. Micropipettes Micropipettes borosilicate ग्लास capillaries (1 मिमी चौड़ी, 4 "लंबे, थोक मूल्य सूचकांक नहीं. TW100-F) से तैयार सुई खींचने का प्रयोग 8-12 मिमी लंबे शंकु और ठीक टिप के साथ micropipettes तैयार. क्रश टिप ~ 2 मिमीटिप से संदंश का उपयोग, एक दांतेदार तोड़ने बनाने. मीडिया ऊष्मायन मीडिया: 1x स्टॉक से तैयार ताजा 3 / 4 सामान्य एम्फ़िबियाई मीडिया (गुटनिरपेक्ष आंदोलन). 0.025 मिलीग्राम / मिलीलीटर gentamycin जोड़ें. Electroporation मीडिया: के रूप में ऊपर के साथ 0.1% Benzocaine (सिग्मा, 06,950). 2. Electroporation Micropipette सेटअप ~ 1 μl इंजेक्शन समाधान के साथ micropipette भरें. Micromanipulator में micropipette सुरक्षित और microinjector (Picospritzer द्वितीय) के लिए देते हैं. Tabletop से 50 ° कोण micropipette. 20 साई में इंजेक्शन के दबाव सेट. Micropipette जांचना नाड़ी प्रति 30 nl इंजेक्षन. टै़डपोल तैयारी 5 मिनट के लिए electroporation मीडिया में incubating द्वारा चरण 28 Xenopus लार्वा anesthetize. Electroporation electroporation मीडिया के साथ भरा कक्ष में anesthetized मेढक का डिंभकीट स्थानांतरण. स्थिति भ्रूणलंबे समय के भीतर अच्छी तरह से इतना है कि सिर पृष्ठीय पक्ष नीचे और ventral पक्ष उजागर के साथ टी जंक्शन में टिकी हुई है. सिर थोड़ा पूंछ के लिए तुलना में ऊंचा होना चाहिए. संदंश का प्रयोग, धीरे प्लास्टिसिन आसपास के साथ अच्छी तरह से मेढक का डिंभकीट सुरक्षित. (नोट: यदि मेढक का डिंभकीट सुरक्षित नहीं है, यह चिकोटी और electroporation दौरान इलेक्ट्रोड संपर्क कर सकते हैं इस मामले में मेढक का डिंभकीट त्यागने के रूप में चेहरे के ऊतकों को बुरी तरह से क्षतिग्रस्त हो जाएगा) Electroporation Micropipette टिप सीमेंट ग्रंथि तुरंत पीछे और चेहरे mesenchyme में सम्मिलित करें. Mesenchyme में 30 nl समाधान इंजेक्षन. Micropipette वापस लेना. जल्दी भ्रूण के सिर (छवि 3) के लिए समानांतर इलेक्ट्रोड सुझावों संरेखित करें. 8 50 एमएस, 20mV वर्ग दालों लागू करें. इलेक्ट्रोड वापस लेना. संदंश का प्रयोग अच्छी तरह से ध्यान मेढक का डिंभकीट जारी है और 4 / 3 गुटनिरपेक्ष आंदोलन, 0.025 gentamycin मिलीग्राम / एमएल हस्तांतरण. Tadpoles 3 / 4 में गुटनिरपेक्ष आंदोलन, 0.025 मिलीग्राम / मिलीलीटर overn incubated किया जा सकता है हैight, या अब. 24 घंटे के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कुशल electroporation के लिए स्क्रीन भ्रूण. 3. प्रतिनिधि परिणाम: फ्लोरोसेंट अणु का उपयोग electroporated भ्रूण की आसान स्क्रीनिंग की अनुमति देता है. चित्रा 4 एमओ electroporated tadpoles ~ 12, 48 और electroporation के बाद 96 घंटे के एक ठेठ बैच, 14.5 पर incubated डिग्री सेल्सियस से पता चलता है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, राज्यमंत्री electroporation के तुरंत बाद देखे जा सकते हैं और electroporation के बाद कई दिनों के लिए जारी रहती है. हमारे अनुभव में, प्रतिदीप्ति 46 मंच (~ 5 दिन बाद) पर कमजोर स्पष्ट है. Cartilages में, प्रतिदीप्ति भेदभाव (~ 42 सेंट) की शुरुआत के बाद नाटकीय रूप से कम हो जाती है, तथापि, एमओ प्रतिदीप्ति ग्रसनी अन्तस्त्वक् के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं में और अधिक दृढ़ता से बनी रहती है. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से पता चलता है कि oligonucleotides उपास्थि सहित कई craniofacial ऊतकों में शामिल कर रहे हैं. Oligonucleotide प्रतिदीप्ति गएक बार ऊतकों में सिर के दोनों तरफ देखे जा. यह संभावना है ढीला craniofacial mesenchyme भर इंजेक्शन electroporation के लिए पहले समाधान के तेजी से प्रसार के कारण है. चित्रा 1 घर इलेक्ट्रोड. एल आकार टंगस्टन तार एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग गैर विषैले मिट्टी या पोटीन से जुड़ी है. (ए) इलेक्ट्रोड टर्मिनस 5 मिमी उपाय. (बी) इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी संलग्न, जैसे कि Termini समानांतर चलाने. इलेक्ट्रोड डीसी केबल द्वारा पल्स जनरेटर से जुड़े होते हैं. चित्रा 2 electroporation चैम्बर. (ए) 90 मिमी प्लास्टिसिन के साथ पंक्तिवाला पकवान मीडिया और एक टी के आकार का नहीं 5 घड़ीसाज़ संदंश के साथ नक्काशीदार कक्ष साथ भरा है. (बी) लंबे पक्ष मिमी 2 एक्स 2 मिमी X10 मिमी उपायwhilst लघु मिमी 2 एक्स 2 मिमी एक्स 5 मिमी उपायों. भ्रूण के सिर टी जंक्शन, ventral पक्ष में टिकी हुई है. चित्रा 3 योजनाबद्ध electroporation प्रक्रिया illustrating. सेंट 28 मेढक का डिंभकीट electroporation कक्ष में रखा गया है, ventral पक्ष. Micropipette चेहरे mesenchyme अंतर्निहित सीमेंट ग्रंथि में डाला जाता है. सुई. Micropipette हटा दिया है और एल के आकार इलेक्ट्रोड समानांतर सिर flanking गठबंधन कर रहे हैं. आठ एमएस 50, 20 mV वर्ग दालों लागू करें. इलेक्ट्रोड वापस लेना. वांछित चरणों tadpoles हो जाओ. राज्यमंत्री या GFP अभिव्यक्ति का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कल्पना. चित्रा 4 प्रतिनिधि 12 (ए) tadpoles, 48 (बी), और 96 (सी) घंटे पोस्ट electroporation (30 चरणों, 34 और 44 क्रमशः). ("बी") प्रतिदीप्त एमओ हिरन पर craniofacial mesenchyme भीतर visualized किया जा सकता हैतों 30 और 34. प्रतिदीप्ति चरण 44 (arrowhead, C'सी ") पर cartilages में पता लगाया जा सकता है पेट अत्यधिक autofluorescent है.

Discussion

इस वीडियो में, हम Xenopus tadpoles के चेहरे mesenchyme में electroporation की मध्यस्थता जीन डिलीवरी की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम जीन समारोह से छेड़छाड़ हमें बाद में समय बिंदुओं पर विशिष्ट ऊतकों को लक्षित करने के लिए अनुमति के प्रारंभिक विकास प्रभाव को बायपास कर सकते हैं. हमारे अध्ययन बताते हैं कि craniofacial mesenchymal कोशिकाओं के heterogenous आबादी प्रभावित हो सकता है, हमें electroporated के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं हित के प्रोटीन के लिए सेल स्वायत्त आवश्यकताओं के वंश की जांच करने के लिए अनुमति देता है. रहते इमेजिंग के साथ संयुक्त, हम इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए जीन समारोह का अध्ययन कर सकते हैं, समय पर craniofacial विकास के दौरान. इस उपन्यास विधि organogenesis के अध्ययन के लिए Xenopus के शिक्षणीयता पर प्रकाश डाला गया . हम आशा करते है कि मोटे तौर पर इस विधि morphogenesis और अन्य ऊतकों के भेदभाव के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं.