Elektroporation av Craniofacial mesenkym

Summary

Kraniofaciala brosk utvecklas i nära kontakt med andra vävnader och är svåra att manipulera med levande djur. Vi använder elektroporation att leverera molekylära verktyg under tillväxten av kraniofaciala skelettet medan förbi tidiga embryonala effekter. Detta tillvägagångssätt ger oss möjlighet att effektivt testa kandidat molekyler

Abstract

Elektroporation är en effektiv metod för att leverera DNA och andra laddade makromolekyler till vävnad vid exakta tidpunkter och i exakta platser. Till exempel har elektroporation använts med stor framgång att studera neurala och näthinnans utveckling i Xenopus, kyckling och mus ^1-10. Det är dock viktigt att notera att i alla dessa studier var utredarna inte är inriktade på mjuka vävnader. Eftersom vi är intresserade av kraniofaciala utveckling, anpassade vi en metod att rikta ansiktet mesenkym.

När vi sökte litteratur, fann vi, till vår förvåning, väldigt få rapporter om lyckade genöverföring till brosk vävnaden. Majoriteten av dessa studier var genterapi studier, till exempel siRNA eller protein leverans till chondrogenic cellinjer, eller, djurmodeller av artrit ^11-13. I andra system, till exempel kyckling eller mus, elektroporation av ansikts mesenkym har varit utmanande (personliga KOMMUNIKATjoner, Institutionen för Kraniofaciala utveckling, KCL). Vi antar att elektroporation i procartilaginous och brosk vävnader i Xenopus kan fungera bättre. I våra studier, visar vi att genöverföring i ansiktet brosket sker effektivt i tidiga skeden (28), när ansikts primordium fortfarande består av mjukvävnad innan brosk differentiering.

Xenopus är ett väldigt lättillgängligt ryggradsdjur systemet för analys av kraniofaciala utveckling. Kraniofaciala strukturer är mer synligt i Xenopus än i något annat ryggradsdjur modell, främst eftersom Xenopus embryon befruktas externt, vilket gör analyser av de tidigaste stadierna, och underlätta Bildproduktion på en enda cell upplösning, samt återanvändning av mödrarna ^14. Bland ryggradsdjur modeller utvecklas externt, är Xenopus mer användbart för kraniofaciala analys än zebrafisk, som Xenopus larver är större och lättare att dissect, och utvecklingsländerna ansikts regionen mer tillgänglig för bildbehandling än motsvarande område i fisk. Dessutom är Xenopus evolutionärt närmare människor än sebrafisk (~ 100 miljoner år närmare) ^15. Slutligen, på dessa stadier, Xenopus grodyngel är öppna, och samtidigt uttryck för fluorescerande proteiner eller molekyler kommer att tillåta enkel visualisering av att utveckla brosk. Vi räknar med att detta tillvägagångssätt ger oss möjlighet att snabbt och effektivt testa kandidat molekyler i en in vivo-modell system.

Protocol

Del 1A. Utrustning

Mikroskop: upprättstående stereo-dissekera utrymme med låg effekt mål

• Spänning / pulsgeneratorn: BTX ECM 830 Square Wave elektroporation System
• Pipettera avdragaren: P-87 Mikropipett Avdragare (Sutter Instrument Company, CA)
• Manipulator: grov, eller kombinerad grova och fina beroende på förberedelse.
• Mikropipett innehavaren: Fine Science Tools
• Elektrod: hemlagad
• Elektroporation kammare: hemlagad

L-formade elektroder:

1. Klipp 8 cm hög renhet 0,4 mm volfram tråd (Goodfellow) och anbringa på mittpunkten en 1 ml spruta med spackel (vi använder Blu-Tack). Lämna 4 tråds cm tungsten utsatta spetsen på sprutan och böj spets i L-form, 1 cm från änden (Fig. 1A).
2. Trim tips så att slutet åtgärderna 0,5 mm i längd. Thans tips är elektroden ändstationen.
3. Kör över parallellt volfram tråden till spruta och använda den för att ansluta generatorn elektroden puls.
4. Upprepa processen att göra ett par elektroder.
5. Fäst elektroderna till fyrkantsvåg pulsgenerator via DC-kablar.

Elektroporation kammare

1. Linje botten av 90 mm fat med ~ 5 mm giftfri modellera.
2. Fyll skålen med elektroporation medier.
3. Använda Nr 5 urmakare pincett rista en T-formad väl (Fig. 2). Den långa och ska mäta ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm och kort ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. Den elektroporation maträtt kan tvättas och återanvändas.

Del 1B. Reagenser

DNA eller laddade makromolekyler

• Mikropipetter: 1 mm bredd 4 "lång borosilikatglas kapillärer (WPI, TW100-F)
• Kultur medier: Normal Amphibian Media (NAM)
• > 10 x lager: 1100 mm NaCl, 20mM KCL, 10 mm Ca (NO _{3) 2} • 4H ₂ O, 1 mM EDTA.
  • Autoklav och förvara vid 4 ° C.
  • 1 X NAM: Späd från 10x lager, buffert med 0,1 mM NaHCO ₃ och 0,2 mM Na ₃ PO _4.
• Xenopus laevis grodyngel, etapp 28

DNA-preparation:

1. Förbered uttryck plasmider med standardprotokoll.
2. Resuspendera DNA till en slutlig koncentration av 1 mikrogram / ​​l i nukleas fria H ₂ 0.

* Vi har haft framgång med vektorer som innehåller en stark CMV promotor, som pCS2 + [16]. För härstamning analys inkluderar vi vanligen DNA kodar grönt fluorescerande protein (pCS2 + GFP) till en slutlig koncentration av 0,1 mikrogram / l. [DNA-koncentrationer mellan 0,1-3 mikrogram / l testades också. Vi fann att halter under 0,8 mikrogram / l ineffektivt märkta celler, medan DNA högre koncentrationer än 2 mikrogram / & Mu, l förbättrade inte elektroporation effektiviteten].

Morpholino oligonukleotid förberedelser:

(Obs!. MOS måste fluoresceinated (3'-carboxyfluorescein modifierad) eller på annat sätt debiteras)

1. Resuspendera morpholino oligonukleotider (MOS) (Genetools, www.genetools.com ) vid en koncentration av 2 mm i nukleas fria H ₂ 0.
2. Värme alikvot av stamlösning vid 65 ° C i 5 minuter.
3. Späd till slutlig koncentration av 0,5 mm i nukleas fritt vatten.

* 0,1-1mm MO lösningar testades. 0,5 mM MO lösningar var tillräckligt för elektroporation många mesenkymala celler.

Mikropipetter

1. Förbered mikropipetter av borsilikatglas kapillärer (1 mm bred, 4 "lång, WPI nej. TW100-F). Använd nål avdragare för att förbereda mikropipetter med en 8-12 mm lång kona och fin spets.
2. Krossa spets ~ 2 mmfrån spets med hjälp av pincett, vilket skapar en ojämn paus.

Media

1. Inkubering media: Bered en färsk 3 / 4 Normal Amphibian Media (NAM) från 1x lager. Lägg till 0,025 mg / ml gentamycin.
2. Elektroporation medier: som ovan, med 0,1% Benzocaine (Sigma, 06950).

2. Elektroporation

Mikropipett installation

1. Fyll mikropipett med ~ 1 l injektionslösning.
2. Säkra mikropipett i mikromanipulator och fäster microinjector (Picospritzer II).
3. Vinkel mikropipett vid 50 ° från bordsskivan.
4. Ställ insprutningstryck vid 20 PSI.
5. Kalibrera mikropipett att injicera 30 nl per puls.

Grodyngel förberedelse

1. Bedöva stadium 28 Xenopus larver genom inkubering i elektroporering media i 5 minuter.
2. Överför sövda grodyngel i elektroporation kammare fylld med elektroporation medier. Position embryoinom den långa väl så att huvudet vilar i T-korsningen med ryggsidan nedåt och ventrala sida som exponeras. Huvudet skall vara något förhöjd jämfört med svansen.
3. Använd pincett försiktigt säkra grodyngel väl med närliggande modellera. (Obs!.. Om grodyngel inte är säkrad kan den rycka och kontakta elektroden under elektroporation I detta fall kasta grodyngel som ansiktsservetter kommer att bli allvarligt skadad)

Elektroporation

1. Sätt mikropipett spetsen omedelbart posteriort om cement körteln och i ansiktet mesenkym.
2. Injicera 30 nl lösning i mesenkym.
3. Dra in mikropipett.
4. Snabbt anpassa elektrod tips parallellt med chefen för embryot (Fig. 3).
5. Applicera 8 50 ms, 20mV torget pulser.
6. Dra in elektroderna.
7. Använd pincett försiktigt släppa grodyngel från väl och transfer till 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml gentamycin.
8. Yngel kan inkuberas i 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml overnight, eller längre.
9. Screen embryon för effektiv elektroporering av fluorescensmikroskopi efter 24 timmar.

3. Representativa resultat:

Användningen av fluorescerande molekyler gör det lätt att screening av electroporated embryon. Figur 4 visar ett typiskt parti MO electroporated grodyngel ~ 12, 48 och 96 timmar efter elektroporation, inkuberas vid 14,5 ° C. Använda fluorescensmikroskopi kan MOS visualiseras omedelbart efter elektroporation och kvarstår i flera dagar efter elektroporation. Enligt vår erfarenhet är fluorescens svagt tydligt vid stadium 46 (~ 5 dagar senare). I brosk, minskar fluorescens dramatiskt efter debuten av differentiering (~ st 42), dock kvarstår MO fluorescens mer i andra celltyper som faryngala endoderm. Fluorescensmikroskopi visar att oligonukleotider ingår i flera kraniofaciala vävnader, inklusive brosk. Oligonukleotid fluorescens cen ofta visualiseras i vävnad på vardera sidan av huvudet. Detta beror sannolikt på snabb spridning av injektionslösningen hela löst kraniofaciala mesenkym före elektroporation.

Figur 1 Homemade elektroder. L-formade volfram tråd är ansluten till en 1 ml spruta med giftfria lera eller kitt. (A) Elektroden ändstationen mäter 5 mm. (B) Bifoga ett par elektroder, så att Termini löper parallellt. Elektroder är knutna till pulsgenerator av DC kablar.

Figur 2 elektroporation kammare. (A) 90 mm maträtt fodrad med modellera är fylld med media och en T-formad kammare ristade med nr 5 urmakare pincett. (B) långsidan mäter 2 mm x 2 mm X10 mmmedan den korta mäter 2 mm x 2 mm x 5 mm. Chefen för embryot vilar i T-korsning, ventrala sidan uppåt.

Figur 3 Schematisk illustrerar elektroporation förfarande. St 28 grodyngel placeras i elektroporering kammare, upp ventrala sida. Mikropipett sätts in i ansiktet mesenkym underliggande cement körtel. Injicera. Mikropipett tas bort och L-formade elektroder ligger parallellt flankerar huvudet. Applicera åtta 50 ms, 20 mV torget pulser. Dra in elektroderna. Grow grodyngel till önskad etapper. Visualisera MOS eller GFP uttryck med hjälp av fluorescensmikroskopi.

Figur 4 Representativ grodyngel 12 (A), 48 (B) och 96 (C) timmar efter elektroporation (steg 30, 34 respektive 44). (En "-B") Lysrör MO kan visualiseras inom kraniofacial mesenkym på hjortes 30 och 34. Fluorescens kan upptäckas i brosk i steg 44 (pilspets, C'-C "). Tarmen är mycket autofluorescent.

Discussion

I den här videon har vi visat det är möjligt att elektroporation-medierad gen leverans i ansiktet mesenkym av Xenopus grodyngel. Med denna metod kan vi gå förbi tidigt utvecklingseffekter att manipulera geners funktion gör att vi kan rikta specifika vävnader vid senare tidpunkter. Våra studier visar att heterogena populationer av kraniofaciala mesenkymala celler kan påverkas, gör att vi kan undersöka härstamning av electroporated celler samt celler självständiga krav på proteiner av intresse. Kombinerat med levande bilder, kan vi använda denna metod för att studera geners funktion, över tiden, under kraniofaciala utveckling. Denna nya metod belyser spårbarhet Xenopus för studiet av organogenesen. Vi räknar med att denna metod i stort sett kan anpassas för att studera morfogenes och differentiering av andra vävnader också.