Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym

Summary

Craniofaciale kraakbeen te ontwikkelen in nauw contact met andere weefsels en zijn moeilijk te manipuleren in levende dieren. Wij maken gebruik van elektroporatie van moleculaire tools te leveren tijdens de groei van het craniofaciale skelet, terwijl het omzeilen van de vroege embryonale effecten. Deze aanpak stelt ons in staat om efficiënt te testen kandidaat-moleculen

Abstract

Elektroporatie is een efficiënte methode van het leveren van DNA en andere geladen macromoleculen in de weefsels op exacte tijdstippen en in de precieze locaties. Bijvoorbeeld, elektroporatie is gebruikt met groot succes tot neurale en het netvlies ontwikkeling studie in Xenopus, kip en muis ^1-10. Toch is het belangrijk op te merken dat in al deze studies, onderzoekers niet waren zacht weefsel targeting. Omdat we geïnteresseerd zijn in craniofaciale ontwikkeling, hebben we aangepast een methode om het gezicht mesenchym doel.

Wanneer we de literatuur doorzocht, vonden we, tot onze verrassing, zeer weinig meldingen van succesvolle genoverdracht in kraakbeenweefsel. De meerderheid van deze studies zijn gentherapie studies, zoals siRNA of eiwit levering in chondrogene cellijnen, of diermodellen van artritis ^11-13. In andere systemen, zoals kip of muis, elektroporatie van gezicht mesenchym is uitdagend (persoonlijke COMMUNICATionen, Dept van craniofaciale ontwikkeling, KCL). Onze hypothese was dat elektroporatie in procartilaginous en kraakbeen weefsels in Xenopus beter zou kunnen werken. In onze studies, laten we zien dat gentransfer in het gezicht kraakbeen gebeurt efficiënt in een vroeg stadium (28), toen het gezicht primordium nog steeds bestaat uit zacht weefsel voorafgaand aan kraakbeen differentiatie.

Xenopus is een zeer toegankelijke gewervelde systeem voor de analyse van craniofaciale ontwikkeling. Craniofaciale structuren zijn beter waarneembaar in Xenopus dan in enig andere gewervelde model, vooral omdat Xenopus embryo's worden extern bevrucht, waardoor analyses van de vroegste stadia, en faciliteren van live-imaging bij enkele cel resolutie, alsmede het hergebruik van de moeders ^14. Onder de gewervelde modellen te ontwikkelen extern, Xenopus is meer handig voor craniofaciale analyse dan zebravis, Xenopus als larven zijn groter en makkelijker te dissect, en de zich ontwikkelende gezicht regio is meer toegankelijk voor beeldvorming dan het equivalent regio in vis. Daarnaast, Xenopus is evolutionair dichter bij mensen dan zebravis (~ 100 miljoen jaar dichterbij) ^15. Tot slot, in deze stadia, Xenopus kikkervisjes zijn transparant, en de gelijktijdige expressie van fluorescerende eiwitten of moleculen zullen eenvoudige visualisatie van de zich ontwikkelende kraakbeen mogelijk te maken. We verwachten dat deze aanpak zal ons toelaten om snel en efficiënt de kandidaat-moleculen te testen in een in vivo modelsysteem.

Protocol

Deel 1A. Uitrusting

Microscoop: rechtop stereo-ontleden bereik met laag vermogen doel

• Spanning / Pulse Generator: BTX ECM 830 blokgolf Elektroporatie System
• Pipet trekker: P-87 Micropipet Puller (Sutter Instrument Company, CA)
• Manipulator: grof, of gecombineerde grof en fijn afhankelijk van de voorbereiding.
• Micropipet houder: Fine Science Tools
• Elektrode: zelfgemaakte
• Elektroporatie kamer: zelfgemaakte

L-vormige elektroden:

1. Snij 8 cm van hoge zuiverheid 0,4 mm wolfraam draad (Goodfellow) en brengen op middelpunt een 1 ml spuit met behulp van putty (we gebruiken Blu-Tack). Laat 4 cm wolfraam draad bloot van het uiteinde van de spuit en buig tip in L-vorm, 1 cm van het einde (Fig. 1A).
2. Trim tip zodat het uiteinde 0,5 mm maatregelen in de lengte. TZijn tip is de elektrode eindpunt.
3. Run overtollige wolfraam draad parallel aan de spuit en gebruik deze om de elektrode puls generator aan te sluiten.
4. Herhaal het proces maken van een paar elektroden.
5. Bevestig de elektroden op blokgolf generator via DC-kabels.

Elektroporatie kamer

1. Lijn bodem van 90 mm schotel met ~ 5 mm niet-giftig plasticine.
2. Vul de schotel met elektroporatie media.
3. Met behulp van nr. 5 horlogemakerij pincet carve een T-vormige goed (afb. 2). De lange goed zou moeten meten ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm en de korte ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. De elektroporatie schotel kan worden gewassen en hergebruikt.

Deel 1B. Reagentia

DNA of geladen macromoleculen

• Micropipetten: 1 mm breed 4 "lang borosilicaatglas capillairen (WPI, TW100-F)
• Cultuur media: Normaal Amfibie Media (NAM)
• > 10 X voorraad: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO _{3) 2} • 4H ₂ O, 1 mM EDTA.
  • Autoclaaf en bewaren bij 4 ° C.
  • 1 X NAM: verdunnen van 10x voorraad, buffer met 0,1 mM NaHCO ₃ en 0,2 mM Na ₃ PO _4.
• Xenopus laevis kikkervisjes, stage 28

DNA voorbereiding:

1. Bereid expressieplasmiden met behulp van standaard protocollen.
2. Resuspendeer DNA tot een uiteindelijke concentratie van 1 ug / ul in nuclease gratis H ₂ 0.

* We hebben succes gehad met vectoren die een sterke CMV promoter, zoals pCS2 + [16]. Voor de afstamming analyse, we zijn doorgaans voorzien van DNA dat codeert voor groen fluorescent eiwit (GFP pCS2 +) bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 pg / pl. [DNA-concentraties tussen 0,1-3 ng / ul werden ook getest. We vonden dat de concentraties lager dan 0.8 ng / ul inefficiënt gelabelde cellen, terwijl de DNA-concentraties van meer dan 2 g / & mU; Ik wist niet beter elektroporatie efficiency].

Morfolino oligonucleotide voorbereiding:

(Let op:. MO's dienen te worden fluoresceinated (3'-carboxyfluoresceïne gewijzigd) of anders betalen)

1. Resuspendeer morfolino oligonucleotiden (MO) (Genetools, www.genetools.com ) bij een concentratie van 2 mM in nuclease gratis H ₂ 0.
2. Warmte hoeveelheid op voorraad oplossing bij 65 ° C gedurende 5 minuten.
3. Verdun tot uiteindelijke concentratie van 0,5 mM in nuclease vrij water.

* 0,1-1mm MO oplossingen werden getest. 0,5 mM MO oplossingen voldoende waren voor elektroporatie van vele mesenchymale cellen.

Micropipetten

1. Bereid micropipetten van borosilicaatglas capillairen (1 mm breed, 4 "lang, WPI nee. TW100-F). Gebruik naald trekker te micropipetten te bereiden met een 8-12 mm lange taps en fijne tip.
2. Crush tip ~ 2 mmvan de spuitkop en pincet, het creëren van een gekarteld breken.

Media

1. Incubatie media: Bereid 3 / 4 Normale Amfibie Media (NAM) van 1x voorraad. Voeg 0,025 mg / ml gentamycine.
2. Elektroporatie media: als hierboven, met 0,1% benzocaïne (Sigma, 06950).

2. Elektroporatie

Micropipet setup

1. Vul micropipet met ~ 1 ui oplossing voor injectie.
2. Secure micropipet in micromanipulator en hechten aan microinjector (Picospritzer II).
3. Hoek micropipet op 50 ° ten opzichte van het tafelblad.
4. Stel inspuitdruk bij 20 PSI.
5. Kalibreren micropipet tot 30 nl per puls injecteren.

Tadpole voorbereiding

1. Verdoven stadium 28 Xenopus larven door het incuberen in elektroporatie media voor 5 minuten.
2. Overdracht onder narcose kikkervisje in elektroporatie kamer gevuld met elektroporatie media. Positie embryobinnen de lange goed, zodat de hoofdsteunen in de T-splitsing met de dorsale zijde naar beneden en worden blootgesteld buikzijde. Het hoofd enigszins dient te worden verhoogd ten opzichte van de staart.
3. Met behulp van een tang voorzichtig veilig kikkervisje goed aan bij omliggende plasticine. (Let op:.. Als het kikkervisje is niet beveiligd, kan trillen en elektrode tijdens elektroporatie contact In dit geval is het kikkervisje als gezichtstissues zal ernstig worden beschadigd weggooien)

Elektroporatie

1. Plaats micropipet tip direct plaatsvond na de cement klier en in het gezicht mesenchym.
2. Injecteer 30 nl oplossing in mesenchym.
3. Schuif micropipet.
4. Snel uitlijnen elektrode tips parallel aan het hoofd van het embryo (afb. 3).
5. Breng 8 50 ms, 20mV vierkante pulsen.
6. Schuif elektroden.
7. Met behulp van een tang voorzichtig kikkervisje vrijlating uit de put en transfer naar 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml gentamycine.
8. Kikkervisjes kunnen worden geïncubeerd in 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml overnight, of langer.
9. Scherm embryo's voor een efficiënte elektroporatie door fluorescentie microscopie na 24 uur.

3. Representatieve resultaten:

Het gebruik van fluorescerende moleculen maakt eenvoudige screening van embryo's geëlektroporeerd. Figuur 4 toont een typische partij van MO geëlektroporeerd kikkervisjes ~ 12, 48 en 96 uur na elektroporatie, geïncubeerd bij 14,5 ° C. Met behulp van fluorescentie microscopie, kan MO's zichtbaar worden gemaakt direct na de elektroporatie en aanhouden enkele dagen na elektroporatie. In onze ervaring, fluorescentie is zwak evident in stadium 46 (~ 5 dagen later). In het kraakbeen, fluorescentie daalt dramatisch na het begin van differentiatie (~ 42 st), maar MO fluorescentie blijft sterker in andere celtypen, zoals de faryngeale endoderm. Fluorescentie microscopie laat zien dat oligonucleotiden zijn opgenomen in diverse weefsels waaronder craniofaciale kraakbeen. Oligonucleotide fluorescentie ceen vaak gevisualiseerd worden in het weefsel aan weerszijden van het hoofd. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een snelle verspreiding van de injectie-oplossing in de losse craniofaciale mesenchym voorafgaand aan de elektroporatie.

Figuur 1 Homemade elektroden. L-vormige wolfraam draad is bevestigd aan een 1 ml spuit met behulp van niet-giftige klei of stopverf. (A) De elektrode eindpunt maatregelen 5 mm. (B) Bevestig een paar elektroden, zodanig dat de uiteinden parallel lopen. Elektroden zijn bevestigd aan pulsgenerator door DC kabels.

Figuur 2 Elektroporatie kamer. (A) 90 mm schaal bekleed met plasticine is gevuld met media en een T-vormige kamer gesneden met een pincet nr. 5 horlogemaker's. (B) De lange zijde hoogte van 2 mm x 2 mm X10 mmterwijl de korte maatregelen 2 mm x 2 mm x 5 mm. Het hoofd van het embryo ligt in de T-splitsing, ventrale zijde naar boven.

Figuur 3 Schematische illustratie van elektroporatie procedure. St. 28 kikkervisje is geplaatst in elektroporatie kamer, ventrale zijde naar boven. Micropipet wordt ingevoegd in het gezicht mesenchym onderliggende cement klier. Injecteren. Micropipet is verwijderd en L-vormige elektroden zijn opgelijnd parallel aan weerszijden van de kop. Van toepassing acht 50 ms, 20 mV vierkante pulsen. Schuif elektroden. Grow kikkervisjes naar de gewenste fasen. Visualiseer MO of GFP-expressie met behulp van fluorescentie microscopie.

Figuur 4 vertegenwoordiger kikkervisjes 12 (A), 48 (B) en 96 (C) uur na de elektroporatie (fase 30, 34 en 44 respectievelijk). (A "-B"), TL-MO kan worden gevisualiseerd in craniofaciale mesenchym op hertes 30 en 34. Fluorescentie kan worden gedetecteerd in het kraakbeen in fase 44 (pijlpunt, C'-C "). De darm is zeer autofluorescente.

Discussion

In deze video, hebben we aangetoond dat de haalbaarheid van elektroporatie-gemedieerde gen delivery in het gezicht mesenchym van de Xenopus kikkervisjes. Met deze aanpak kunnen we omzeilen vroeg effecten op de ontwikkeling van het manipuleren van genen de functie waardoor we specifieke weefsels richten op latere tijdstippen. Onze studies tonen aan dat heterogene populaties van craniofaciale mesenchymale cellen kan worden beïnvloed, waardoor we afstamming van geëlektroporeerde cellen en cel-autonome eisen voor eiwitten van belang te bestuderen. In combinatie met live-imaging, kunnen we gebruiken deze aanpak genfunctie studeren, na verloop van tijd, tijdens het craniofaciale ontwikkeling. Deze nieuwe methode benadrukt de traceerbaarheid van Xenopus voor de studie van organogenese. We verwachten dat deze methode kan grofweg worden aangepast aan de morfogenese en differentiatie van andere weefsels studie ook.