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Biology

颅面间质细胞的电

doi: 10.3791/3381 Published: November 28, 2011

ERRATUM NOTICE

Summary

颅面软骨发展与其他组织的密切联系和难以操作,在活的动物。我们使用的是电击期间提供的颅面骨骼生长的分子工具,而绕过早期胚胎的影响。这种方法将使我们能够有效地测试候选分子

Abstract

电穿孔是一种有效的方法,在精确的时间点的组织和确切地点提供DNA和其他带电的大分子。例如,电已经取得了巨大成功用于研究在爪蟾神经和视网膜发育,鸡和鼠标1-10。然而,重要的是要注意,在所有这些研究中,研究者针对软组织。因为我们是在颅面发育有兴趣,我们适应目标面部间质的方法。

当我们进行文献检索,我们发现,给我们带来惊喜,很少有成功的基因转移到软骨组织的报告。这些研究大部分基因治疗研究,如siRNA或蛋白质传递到软骨细胞株,或关节炎的动物模型 11-13 。在其他系统,如鸡或鼠标,电击面部间质已具有挑战性(个人COMMUNICAT离子,颅面发育,KCL部)。我们推测,到爪蟾 procartilaginous和软骨组织的电击可能更好地工作。 ,我们在我们的研究表明,有效的基因转移到面部软骨发生在早期阶段(28),面部原基仍是软组织组成,前软骨分化。

爪蟾是一个十分便利的分析颅面部发育的脊椎动物系统。颅面结构可见,在蟾更容易比其他任何脊椎动物模式,主要是因为非洲爪蟾胚胎受精的外部,允许的最早阶段的分析,并促进在单细胞分辨率的实时成像, 以及重用的母亲14。 爪蟾在外部发展的脊椎动物模型,是更多有用的颅面分析比斑马鱼,爪蟾幼虫都较大,更容易DIssect,和面部区域的发展是更容易获得比在鱼相当于地区成像。此外, 非洲爪蟾是对人类进化上更接近比斑马鱼(〜100万年前接近)15。最后,在这些阶段, 爪蟾蝌蚪是透明的,并发表达荧光蛋白或分子将允许开发软骨容易可视化。我们预计,这种做法将让我们能够迅速,高效地测试候选分子在体内模型系统。

Protocol

1A部分。设备

显微镜:直立的立体解剖与低功耗的目标范围

  • 电压/脉冲发生器:BTX ECM 830方波电穿孔系统
  • 移液器拉马:P - 87微管拖轮(萨特仪器公司,CA)
  • 机械手:筹备工作粗糙,或合并的粗,细。
  • 微管持有人:精细的科学工具
  • 电极:自制
  • 自制电穿孔室:

“L”形的电极:

  1. 切8厘米高纯度的0.4毫米的钨丝(古德费洛)和中点处贴上一个1ml注射器,使用腻子(我们使用的Blu - TACK)。离开4厘米钨丝,从暴露成“L”形的注射器和弯尖的一角,从一端1厘米(图1A)。
  2. 修剪提示,以便最终措施,长0.5毫米。 T他的提示是电极总站。
  3. 过剩的钨丝平行运行注射器,并用它来连接电极的脉冲发生器。
  4. 重复过程中,一对电极。
  5. 方波脉冲发生器通过直流电缆连接电极。

电穿孔室

  1. 线的底部为90毫米〜5毫米的非有毒橡皮菜。
  2. 填写电击媒体的菜。
  3. 使用5号制表钳刻出一个T形好(图2)。长以及应测量1〜2毫米x 2毫米× 10毫米,短1〜2毫米x 2毫米x 5毫米。可水洗的电盘和重用。

第1B部分。试剂

DNA或收取大分子

  • 微量移液器:1毫米宽4“长高硼硅玻璃毛细管(WPI的,TW100 - F)
  • 文化传媒:正常两栖类媒体(不结盟运动)
  • > 10倍的股票:1100毫米氯化钠,20毫米KCL,10毫米的Ca(NO 3)2•4H 2 O,1 mM EDTA的。
    • 在4 ° C的高压灭菌器和存储
    • 1 + X南:碳酸氢钠3 0.1毫米和0.2毫米娜3 PO 4的稀释10倍的股票,缓冲区。
  • 非洲爪蟾蝌蚪阶段28

DNA的制备:

  1. 准备表达质粒,使用标准协议。
  2. 重悬DNA的一个终浓度为1μg/μL核酸自由H 2 0。

*我们有包含一个强大的CMV启动子的载体,如pCS2,成功+ [16]。谱系分析,我们通常包括在终浓度为0.1微克/μL的DNA编码绿色荧光蛋白(pCS2 GFP)的。 [0.1-3微克/μL的DNA浓度进行了测试。我们发现,浓度低于0.8μg/μL的低效标记的细胞,而DNA浓度大于2微克/Μ升不提高电穿孔效率]。

吗啉寡聚核苷酸的准备:

(注:。MOS需要fluoresceinated(3' -羧基改性)或以其他方式收取)

  1. 悬浮吗啉代寡核苷酸(MOS)(Genetools, www.genetools.com )核酸自由H 2 0浓度为2毫米。
  2. 热原液分装在65 ° C 5分钟。
  3. 稀释至终浓度为0.5毫米核酸自由水。

* 0.1 - 1mm的MO解决方案进行了测试。 0.5毫米MO解决方案足够的许多间质细胞的电穿孔。

微量移液器

  1. 准备从高硼硅玻璃毛细管(宽1毫米,长4“,WPI的TW100 - F)。微量使用针拉马准备8-12毫米长的锥度和精尖的微量。
  2. 粉碎提示〜2毫米从尖镊子,创造一个锯齿状的突破。

媒体

  1. 孵化媒体:准备新鲜的3 / 4正常两栖类媒体(NAM)从1x股票。添加0.025毫克/毫升的庆大霉素。
  2. 电穿孔媒体:如上所述,用0.1%苯佐卡因(Sigma公司,06950)。

2。电穿孔

微管安装

  1. 填写微量〜1μL注射液。
  2. 固定在显微操作的微管和微量(Picospritzer二)重视。
  3. 从桌面上,在50 °的角度微量。
  4. 设置注射压力20 PSI。
  5. 校准微量注入脉冲NL 30%。

蝌蚪准备

  1. 麻醉阶段28 爪蟾幼虫孵化5分钟电击媒体。
  2. 转移到充满电穿孔媒体电击室麻醉蝌蚪。位置胚胎内长好,让头部背侧和腹侧外露的丁字路口的责任。尾巴相比,头部应该稍微升高。
  3. 使用镊子,轻轻安全以及与周围橡皮蝌蚪。 (注:如果是没有担保的蝌蚪,它可能会抽搐和联系,在电穿孔电极,在这种情况下丢弃的蝌蚪面巾纸将严重受损。)

电穿孔

  1. 插入微量提示后水泥腺和面部间质成。
  2. 30 NL溶液注入到间质。
  3. 缩回微量。
  4. 快速对齐平行电极提示胚胎的头(图3)。
  5. 适用于8月50毫秒,20mV的方波。
  6. 缩回电极。
  7. 使用镊子小心释放蝌蚪转移到3 / 4的不结盟运动,0.025毫克/毫升的庆大霉素。
  8. 蝌蚪可以在不结盟运动,0.025毫克/毫升overn的3 / 4孵育的飞行,或更长的时间。
  9. 24小时后,荧光显微镜高效电击屏幕胚胎。

3。代表性的成果:

允许使用荧光分子电穿孔胚胎容易甄别。图4显示了一个典型的一批MO电穿孔蝌蚪〜12,48和96小时后,电穿孔,孵育在14.5 ° C。用荧光显微镜,MOS可电击后立即可视化,坚持几天后电击。根据我们的经验,荧光弱明显的阶段,46(〜5天以后)。在软骨,荧光分化(42日)后开始急剧下降,但是,莫荧光仍然存在较为强烈的其他类型的细胞,如咽部内胚层。荧光显微镜显示,纳入到几个颅面组织,包括软骨寡核苷酸。寡核苷酸荧光彗星一个经常在组织上的头两侧可视化。这可能是由于整个宽松的颅面间质注射液,以电穿孔前迅速扩散。

图1
图1自制的电极。 L形的钨丝,连接到一个1 ml注射器,采用无毒的粘土或腻子。 (一)电极总站措施5毫米。 (二)将一对电极,这样的总站并行运行。电极连接到脉冲发生器,直流电缆。

图2
图2电穿孔室。 (一)90毫米菜用橡皮衬里填充与媒体和T形腔刻有没有5钟表匠的镊子。 (二)长期方面的措施2毫米x 2毫米X10毫米而2毫米x 2毫米x 5毫米的短期措施。胚胎的头枕在丁字路口,腹侧。

图3
图3示意图说明电击过程。圣28蝌蚪是摆在电击室,腹一面向上。微管插入面部间质底层水泥腺。注入。微管被删除,L形电极平行侧翼头。应用8个50毫秒,20 mV的方波。缩回电极。蝌蚪生长所需的阶段。 Visualise MOS或GFP的表达,用荧光显微镜。

图4
图4蝌蚪代表12(A),48(二),96(三)小时后电击(阶段30,分别为34和44) 。 (A“B”),可以可视化荧光莫内颅面间质在雄鹿ES 30和34。荧光可以检测阶段44(箭头,C' - C“)的软骨。肠道高度autofluorescent。

Discussion

在这段视频中,我们已经证明爪蟾蝌蚪的面部间质电穿孔介导的基因传递的可行性。使用这种方法,我们可以绕过早期发育的影响,操纵基因的功能,让我们在以后的时间点目标特定的组织。我们的研究表明,可能会影响颅面间质细胞的异质人群,让我们研究的电穿孔细胞以及宗族利益的蛋白质细胞的自治要求。结合实时成像,我们可以使用这种方法来研究基因功能,随着时间的推移,在颅面发育。这种新颖的方法,突出器官研究非洲爪蟾的可追踪性。我们预计,这种方法可广泛适应研究以及其他组织的形态发生和分化。

Disclosures

作者有没有利益冲突。

Acknowledgments

我们非常感谢南希Papalopulu 电击的援助和柏彦BONEV 。我们也感谢马克 - 迪翁的关键读,杰里米绿色有益的讨论和刘实验室成员的支持和约翰沃林福德。这项工作是由BBSRC(BB/E013872/1)和威康信托基金会(081880/Z/06/Z)KJL补助。

References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme
Posted by JoVE Editors on 06/28/2013. Citeable Link.

The units for the voltage were incorrectly entered in, Electroporation of Craniofacial Mesenchyme, in two places.

  1. Apply 8 50 ms, 20mV square pulses.
  2. Apply eight 50 ms, 20 mV square pulses.

These were corrected to:

  1. Apply 8 50 ms, 20 V square pulses.
  2. Apply eight 50 ms, 20 V square pulses.
颅面间质细胞的电
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Cite this Article

Tabler, J. M., Liu, K. J. Electroporation of Craniofacial Mesenchyme. J. Vis. Exp. (57), e3381, doi:10.3791/3381 (2011).More

Tabler, J. M., Liu, K. J. Electroporation of Craniofacial Mesenchyme. J. Vis. Exp. (57), e3381, doi:10.3791/3381 (2011).

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