Kraniofaciala brosk utvecklas i nära kontakt med andra vävnader och är svåra att manipulera med levande djur. Vi använder elektroporation att leverera molekylära verktyg under tillväxten av kraniofaciala skelettet medan förbi tidiga embryonala effekter. Detta tillvägagångssätt ger oss möjlighet att effektivt testa kandidat molekyler<em> In vivo.</em
Elektroporation är en effektiv metod för att leverera DNA och andra laddade makromolekyler till vävnad vid exakta tidpunkter och i exakta platser. Till exempel har elektroporation använts med stor framgång att studera neurala och näthinnans utveckling i Xenopus, kyckling och mus 1-10. Det är dock viktigt att notera att i alla dessa studier var utredarna inte är inriktade på mjuka vävnader. Eftersom vi är intresserade av kraniofaciala utveckling, anpassade vi en metod att rikta ansiktet mesenkym.
När vi sökte litteratur, fann vi, till vår förvåning, väldigt få rapporter om lyckade genöverföring till brosk vävnaden. Majoriteten av dessa studier var genterapi studier, till exempel siRNA eller protein leverans till chondrogenic cellinjer, eller, djurmodeller av artrit 11-13. I andra system, till exempel kyckling eller mus, elektroporation av ansikts mesenkym har varit utmanande (personliga KOMMUNIKATjoner, Institutionen för Kraniofaciala utveckling, KCL). Vi antar att elektroporation i procartilaginous och brosk vävnader i Xenopus kan fungera bättre. I våra studier, visar vi att genöverföring i ansiktet brosket sker effektivt i tidiga skeden (28), när ansikts primordium fortfarande består av mjukvävnad innan brosk differentiering.
Xenopus är ett väldigt lättillgängligt ryggradsdjur systemet för analys av kraniofaciala utveckling. Kraniofaciala strukturer är mer synligt i Xenopus än i något annat ryggradsdjur modell, främst eftersom Xenopus embryon befruktas externt, vilket gör analyser av de tidigaste stadierna, och underlätta Bildproduktion på en enda cell upplösning, samt återanvändning av mödrarna 14. Bland ryggradsdjur modeller utvecklas externt, är Xenopus mer användbart för kraniofaciala analys än zebrafisk, som Xenopus larver är större och lättare att dissect, och utvecklingsländerna ansikts regionen mer tillgänglig för bildbehandling än motsvarande område i fisk. Dessutom är Xenopus evolutionärt närmare människor än sebrafisk (~ 100 miljoner år närmare) 15. Slutligen, på dessa stadier, Xenopus grodyngel är öppna, och samtidigt uttryck för fluorescerande proteiner eller molekyler kommer att tillåta enkel visualisering av att utveckla brosk. Vi räknar med att detta tillvägagångssätt ger oss möjlighet att snabbt och effektivt testa kandidat molekyler i en in vivo-modell system.
I den här videon har vi visat det är möjligt att elektroporation-medierad gen leverans i ansiktet mesenkym av Xenopus grodyngel. Med denna metod kan vi gå förbi tidigt utvecklingseffekter att manipulera geners funktion gör att vi kan rikta specifika vävnader vid senare tidpunkter. Våra studier visar att heterogena populationer av kraniofaciala mesenkymala celler kan påverkas, gör att vi kan undersöka härstamning av electroporated celler samt celler självständiga krav på proteiner av intresse. Kombinerat med levande bilder, kan vi använda denna metod för att studera geners funktion, över tiden, under kraniofaciala utveckling. Denna nya metod belyser spårbarhet Xenopus för studiet av organogenesen. Vi räknar med att denna metod i stort sett kan anpassas för att studera morfogenes och differentiering av andra vävnader också.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för Nancy Papalopulu och Boyan Bonev för hjälp med Xenopus elektroporation. Vi tackar också Marc Dionne för kritisk läsning, Jeremy Green och John Wallingford för hjälpsamma diskussioner och medlemmar av Liu labbet för deras stöd. Detta arbete har finansierats av bidrag från BBSRC (BB/E013872/1) och Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) till KJL.