Summary
脱殻は、HIV - 1のライフサイクルの初期段階に必須の工程であるとカプシド殻の分解とウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNP）のリリースとして定義されています。ここで、我々はHIV - 1ビリオンから無傷のコアを分離するためと、その脱殻を定量化するための手法を示します
Abstract
レトロウイルスのゲノムは、脂質エンベロープに囲まれたカプシドに包まれています。このようなHIV - 1のようなレンチウイルス、の場合は、円錐形のカプシドの殻は、六角形の格子として配置されたCAのタンパク質で構成されています。カプシドはコーン1、2の狭い方の端で7広い端の五量体と5でクローズされます。このカプシドの殻で覆われて、ウイルスリボ核タンパク質複合体である、と一緒に彼らは、コアを備える。
標的細胞膜とウイルス膜の融合に続いて、HIV - 1は細胞質に放出される。カプシドは、脱殻と呼ばれるプロセスで可溶性の形態3にフリーCAを解放逆アセンブルします。 HIV - 1脱殻の細胞内の場所とタイミングはよくわかっていない。キャプシドの安定性を変更するカリフォルニア州の単一アミノ酸置換はまた、細胞4を感染させるHIV - 1の能力を損なう。これは、カプシドの安定性は、HIV - 1感染に重要であることを示しています。 HIV - 1脱殻は、このプロセスのための高感度かつ信頼性の高いアッセイの可用性の不足のために勉強することは困難であった。ここでは、感染性HIV - 1粒子から分離されたコアを用いてインビトロで脱殻を研究するための定量的な方法を説明します。アプローチは、寒さで、洗剤の層を通って直線スクロース勾配に集中ビリオンの沈降によってコアの分離を行います。脱殻を定量するために、分離されたコアは37℃でインキュベートする·さまざまな時間間隔および超遠心分離によって、その後ペレット化のためのC。脱殻の範囲は、上清に、CAの割合を定量することによって分析されます。このアプローチは、HIV - 1キャプシドの安定性4、5、6のウイルス変異の影響を分析するために採用されています。また、HIV - 1の脱殻の細胞因子の役割を研究するために有用でなければなりません。
Protocol
1。 HIV - 1粒子の製造
先に進む前に、許可を得なければならないし、感染性HIVのために承認されたバイオセーフティ施設で働くためにあなたの機関のバイオセーフティのオフィスからのガイドラインに従ってください。あなたは適切なケアと安全注意をバイオセーフティ実験室で作業中に続いていることを確認する必要があります。
HIV - 1粒子の製造は、通常、リン酸カルシウムトランスフェクション法7,8を用いて HIV - 1プロウイルスDNAと293T細胞の一過性トランスフェクションによって実行されます。感染したT細胞の培養によって育成された高力価のウイルスストックにも適しています。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質を補充を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養293T細胞[ペニシリン（100 IU / ml）およびストレプトマイシン（100μg/ mlの）] 37℃、5％CO 2で。
- 0.25％トリプシン- EDTAとシード2 × 6を使用し、ほぼコンフルエント皿から細胞を剥離
- 翌日、細胞単層は、約25％コンフルエントとトランスフェクションのための準備ができているはずです。トランスフェクトされる細胞六皿のために、滅菌水2.7 mlの容積にプロウイルスDNAの120μgを持ち出す。この混合物に2.5 M CaCl 2を 0.3 mlおよび2XBBSの3 mlを追加し、上下に数回ピペッティングして適切に混合する。混合物が10〜20分間室温で放置する。
- ミックスに優しく渦巻くながら、各皿の中心に得られた混合物を滴下液1mlを追加。 35 ° C、3％CO 2インキュベータセットで一晩の料理を（〜16時間）に置きます。
- 培地を吸引除去し、穏やかに5 mlのPBSを加える。
- PBSを吸引除去し、新鮮培地5mlを加える。文化37＆でのインキュベーターで細胞度、C、5％追加の24〜48時間のためのCO 2。
- ウイルス粒子を含む培養上清を収集し、50 mlコニカル遠心チューブに移す。すべての皿から上清を組み合わせて、細胞をペレット化し、破片に5分間1,500 xgで遠心。 0.45μmの孔サイズのシリンジフィルターを用いて上清をフィルターします。注意事項は、生きているウイルスでの作業中にエアロゾルの形成を最小限に抑えるよう注意が必要です。これは、遠心分離のステップの間にO -リングまたはローターバケットカバー付きコニカルチューブの使用が含まれています。これが不可能な場合は、チューブのスクリューキャップをパラフィルムでラップする必要があります。
2。超遠心分離によるHIV - 1ビリオンの濃度
- 38.5ミリリットルのポリアロマー遠心管（ベックマンSW32Tiローターまたは同等品用）の培養上清（30 ml）を置きます。穏やかに5 mlのピペットを用いてPBSで20％のショ糖の5mlのソリューションを持つウイルスを含む上清をアンダーレイ。
- で3時間遠心4℃32000回転° C（R 最大で175000 × g）でペレットのウイルス粒子へ。
- チューブの底にペレットを乱さないように注意しながら、吸引して上清を取り除く。 4でチューブと場所に1XSTEバッファー（10mMのトリス- HCl [pH7.4の]、100mMのNaCl、1mMのEDTA）0.5 mlを加え℃で1時間ペレットを緩めます。静かにピペットで吸排出を数回チューブの底からペレットを切断するためにワイドボア1mlのピペットチップを使用する。次に、発泡ように注意しながら、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに緩んでペレットを転送する。ウイルスの小さな塊が分散できるように、別の1〜3時間4℃でインキュベートする。この期間中、ステップ3.1で説明したショ糖密度勾配を準備。
- 4で8000回転（6,000 × g）で上下にそっとピペットウイルス懸濁液を数回し、遠心を·残留凝集塊を除去するために1分間冷却遠心でC。このプロセス中にサンプルの寒さを保つ。
3。ショ糖勾配コアを分離する遠心分離
HIV - 1のコアは、HIV - 2コア10の精製の ための前述の方法の変更である"スピンスルー"方式9を使用して絶縁されています。
- SW32.1Tiローター用14.5ミリリットルのポリアロマーの遠沈管に1XSTEバッファに12ミリリットルリニア30％〜70％ショ糖勾配を準備します。勾配を準備するには、かつての20 mlの勾配を使用して、代わりに近い側の70％ショ糖溶液6ml（近い出口ポートへの）と遠い側の30％ショ糖溶液6mlを。気泡は、2つのチャンバーを接続するチャネルにトラップされていないことを確認してください。底部から下部に85％ショ糖溶液1 mlを含むチューブの上部にグラデーションを送り出す旧オートイルミナフローの勾配を使用してください。ゆっくりと4で勾配を配置° C冷却するまで（2-4時間）。
- ワイドボア1mlのピペットチップを使用すると、ゆっくりと1％トリトンX - 100を含むSTEの15％ショ糖溶液0.25mlを持つグラデーションをオーバーレイ。 ワイドボア1mlのピペットチップを使用してSTEで7.5％ショ糖溶液0.25mlと静かにオーバーレイ。層を混合しないように注意してください。
- ステップ2.4から0.5 mlのウイルス懸濁液と優しくオーバーレイ。この手順は下に置かれたショ糖層の勾配と混合であらゆる妨害を避けるために慎重に行う必要があります。
- 一晩4 32000回転（R 最大で187000 × g）で（16〜20時間）で予冷SW32.1Tiのバケットと遠心機でチューブを置きます℃を遠心分離機内の真空が250ミクロンに達するまで、遠心機の一時停止を避けるために、遠心分離を開始しないでください
- オートイルミナフロー勾配分留塔を使用してグラデーションの上から下まで1mlの画分を集める。採取後すぐに氷中にチューブをセット。反転数回でチューブの内容物を混合し、ELISAによって定量化または逆転写酵素活性アッセイのための各フラクション50μlを撤回。
4。 HIV - 1コアの局在とコアの保管
- 脱外アッセイを行う前に、それは、分数はそのままHIV - 1のコアが含まれているかを判定することが重要です。これは、ステップ3.6からの50μlのアリコートを用いてp24をELISAまたは逆転写酵素活性のアッセイによって決定することができます。
- コアに関連付けられているCAの回復は、多くの場合、コアの安定性に関連しています。 P24 ELISA 9各画分からサ ンプルを使用してコアに関連付けられたCAを測定します。また、各画分の逆転写酵素活性を測定する。両方の方法を使用してピークは分数10日前後になります。
- コアを含む画分をプール。コアは0.2〜0.3mlのアリコート、-80℃で液体窒素や店舗で急速冷凍℃にプールされたコアは、すぐにアリコートをアッセイを脱外に使用されるものではない場合この方法で凍結コアは脱外アッセイに適しています。コアに関連したCAの収率は通常、P24あたりミリリットルの1〜2μgのか合計ビリオン関連の約15％です。P24。
5。 HIV - 1脱殻の速度論的分析
- 脱殻反応ごとに必要なHIV - 1コアの量は、約50 ngのです。 in vitroの脱殻アッセイで実行するには、懸濁液の粘度を減らすために冷たい1XSTE等量のバッファーでのコアのアリコートをpredilute、ピペッティングエラーを最小限に抑える。
- さらに1.5 mlのマイクロ遠心チューブにBSAの10μg/ mlを含む冷1XSTEバッファー0.15 mlのコアの100μlを希釈する。我々は、チューブの壁に、CAの吸着を最小限に抑えるためにBSA（10μg/ mlの）とSTEバッファーを補足する。チューブを転倒数回で混ぜる。サンプルはボルテックスしないでください。 37水浴中でチューブをインキュベート° Cタイムアウト間隔（15、30、60および120分）。チューブは、さらに温暖化を確実にするためには、少なくとも、最大内部サンプルのレベルに水浴に浸漬する必要があります。
- - インキュベーションの間、静かに（通常5定期的にチューブの内容物を混ぜるチューブをフリックで10分）。ゼロ分の制御については、冷1XSTEバッファー0.15 mlのコアの100μlを希釈し、実験（120分）の全体の長さのために氷上でインキュベートする。ゼロ分の制御は、基底脱殻の値を与え、異なる時間間隔で37 ° Cでインキュベートしたコアの脱外の増加を決定するために使用されます。
- 潜伏期間の終わりに、10分間氷上でチューブを配置することにより、脱外のプロセスを停止します。
- 4℃20分間℃、45000回転（R 最大で125000 × gでTLA - 55ローター）でチューブを遠心これは、ペレットはそのままコアとコアの脱外の結果として、リリースされたフリーのCAは、上清に残るでしょう。ローターは、° Cより前のサンプルをロードするために4であらかじめ冷却してください。
- 好ましくは室温で保存したゲルローディングチップを使用して、新しい冷却したマイクロチューブに上清を移す。ペレットは、肉眼では表示されませんがございますので、細心の注意wを取る上清をピペッティングhile。 ELISAのサンプルの希釈液を250μl（PBS中の0.5％トリトンX - 100および5％ドナー子牛血清）でペレットを再懸濁します。ペレット、ELISAの試料希釈液を追加した後の渦の効率的な溶解を確実に。次の節で説明するようにP24 ELISAを用いてペレットと上清のCAコンテンツを定量化する。
- 脱殻の範囲は、上清に存在するCAの割合を計算することによって得られる。
6。 P24 ELISAによるCAのためのアッセイ
- 多くの市販ELISAキットをご用意していますし、CAを定量化するために使用することができます。あらゆる商用または"社内"ELISAを使用して、アッセイの直線性を決定するためにP24規格が含まれています。試料の希釈は正確性を保証するためにアッセイされるべきである。
- 我々は日常的にCAのアッセイに使用する自家製のELISAを開発した。手順は前回の報告書11から適応され、NIHのAIDから利用可能なキャプチャおよび検出器の抗体を使用して実行されますSの研究およびリファレンス試薬プログラム。
7。代表的な結果：
コアを含む画分を決定するためのELISAの結果の例を図1に示されています。分画（1ミリリットルずつ）収集した後、各フラクションからサンプルの50μlを段階希釈を作るために使用され、ELISA法により分析した。 twelve分数の値を合計したものP24は14.5μgのだ。この図の画分に8から10に含まれるコアを示した。コアを含有する分画のためのP24値は2.17μgのだ。 （14.97パーセント）コアに関連するp24の割合は、合計P24値（14.5μgの）へのコアの分画のためのP24値（2.17μg）の比をとることにより決定した。画分1または2が常にp24の最高額が含まれますが、これはコアに関連付けられていないフリーのCAを表します。これは、後続の各画分とP24の値が徐々に減少、その後急激な増加とp24の最後に急落が続いているの値。勾配のロード中に適切なケアが行われている場合、コアに関連したCAのピークは、フラクション10の周囲に見られる。
HIV - 1コアの脱外の反応速度を測定することにより得られる典型的な結果を図2に示されています。グラフは、野生型HIV - 1コアの脱外で時間依存的な増加を示しています。値を脱外％が上清に存在するCAの割合を計算することによって得られた。練習すれば、このアッセイは、非常に再現性とin vitroでのウイルスのコアの安定性を判別するのに便利です。アッセイの再現性は、手続き時にサンプルの適切な取り扱いに大きく依存することに注意してください。コアは熱に不安定なので、サンプルは℃でアッセイを通して、インキュベーション期間中を除いて4℃で維持されるべきである。
1平衡密度勾配遠心分離を図HIV - 1のコア。濃縮したウイルス懸濁液を1％トリトン- X - 100を重ねて30から70パーセント直線ショ糖勾配の上に塗布した。 187000 × gで、4で一晩遠心分離に続い° C、1 mlの画分を上から下へ（フラクション1）（フラクション12）から収集されたとp24をELISAによって定量した。
in vitroで HIV - 1脱殻の2時間コースを示します 。精製HIV - 1のコアは、° C指定された時間間隔で希釈し、37℃でインキュベートした。ゼロ分のサンプルは、実験の全体の長さを氷上でインキュベートした。インキュベーション後、サンプルは4℃で20分間125000 xgで超遠心した上清とペレットは、P24 ELISAによって分離し、分析した。プロトコルのテキストで説明されているように脱殻の程度を決定した。それぞれの脱外反応は二重に行われた、エラーバーは2つの値の範囲に及ぶ。
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Discussion
方法は、標的細胞にHIV - 1脱殻を分析するために、検証方法の無効性が、特にためにHIV - 1のライフサイクルのこの段階を、研究するための有用なin vitroで脱外勉強するHIV - 1のコアを浄化するためにここで説明する。このメソッドはコアを浄化するために平衡超遠心分離を使用していますが、その他は1％トリトン- X - 100 12、13または0.1％のTriton - X - 100 14、15に重ねショ糖クッションを介してペレットと簡単な溶解後に直接ペレットを使用している。
この方法で得られたコアの回復は、実験的な変動の対象となります。このプロトコルの成功の変数は、トランスフェクション効率です。一般的に我々は、勾配上でp24の少なくとも7μgのと同等のウイルス量を読み込みます。当研究室では、ウイルス産生のためのリン酸カルシウムトランスフェクション法を使用しています。他のトランスフェクションの方法も適切かもしれないが、我々は、コアの分離のためにそれらを評価していない。他の重要なVARコアの歩留まりに影響を与えるiablesはグラデーションレイヤーを適用すると、サンプルは冷たいままで取られた心配です。勾配の混合を避けるために、ショ糖勾配を準備するときに最大の注意を払う必要がある。濃縮したウイルス浮遊液をかけながらあらゆる妨害はバリアスクロース層の下に洗剤でビリオンの望ましくないと早期に接触する可能性があります。そのような長期の接触により、脆弱なコアを分解し、減少カプシド関連する可能性があります。それは、ショ糖密度勾配と手続きを通じてウイルス懸濁液の寒さを保つためにも同様に重要です。手続きは、当研究室で様々な科学者が習得し、正常に使用されています。
HIV - 1のコアは、4熱不安定であり、それは寒さと氷の上ですぐに収集された分画を配置する一方したがって、それは分画、ショ糖勾配に非常に重要です。コアの脱殻でもバッファーのpHと塩濃度に依存するので4、それは分析に進む前に、STEバッファーのpHを測定することを強くお勧めです。脱殻率は若干コアの各バッチによって異なる場合があります。脱外の反応は二重に行われるべき、との値が15％以上異なっている場合は一貫性が達成されるまで、その後の反応は三重に行ってください。無料のCAタンパク質は、試験管の内壁に付着する傾向を持つためには、チューブの壁に、CAの吸着を最小限に抑えるために反応混合物中の10μg/ mlの最終濃度でBSAを含めることが不可欠です。
前述したように、脱殻アッセイは、ここで説明する脱殻に影響を与える細胞因子を同定し、研究するために使用することができます。また、内因性の逆転写アッセイを使用してコアの逆転写でカプシド標的化合物と細胞因子の効果を研究するために使用されることがあります。十分な量のHIV - 1コアの分離、分析を許可することが免疫金電子顕微鏡法による細胞因子とのカプシドの相互作用の。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
HIV - 1エイケン実験室での脱殻の研究は、NIHの助成金AI40364、AI50423とAI076121によってサポートされていました。 P24 ELISAで使用される試薬を含む、いくつかの重要な材料は、、NIH AIDSリサーチ＆リファレンスプログラム、エイズの部、NIAID、NIHによって提供されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
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