Summary
Uncoating är ett viktigt steg i den tidiga fasen av HIV-1 livscykel och definieras som demonteringen av kapsid skalet och frisläppandet av den virala ribonucleoprotein komplexa (vRNP). Här visar vi tekniker för att isolera intakta kärnor från HIV-1 virioner och för att kvantifiera deras uncoating
Abstract
Genomet av retrovirus är inkapslad i en kapsid omgiven av en lipid kuvert. För lentiviruses, såsom HIV-1, är den koniska kapsid skalet består av CA protein arrangeras som ett galler för Hexagon. Den kapsid stängs av 7 pentamers på den breda änden och 5 i den smala änden av konen 1, 2. Innesluten i denna kapsid skalet är virala ribonucleoprotein komplexa, och tillsammans utgör kärnan.
Efter fusion av virala membran med målet cellmembranet, är HIV-1 släpps ut i cytoplasman. Kapsid sedan demonteras släppa fri CA i löslig form 3 i en process som kallas uncoating. Den intracellulära plats och tidpunkt för HIV-1 uncoating är dåligt kända. Enstaka aminosyror substitutioner i Kalifornien som förändrar stabiliteten i kapsid försämrar också förmågan av HIV-1 för att infektera celler 4. Detta tyder på att stabiliteten i kapsid är avgörande för HIV-1 infektion. HIV-1 uncoating har varit svårt att studera på grund av bristande tillgång på känsliga och tillförlitliga testmetoder för denna process. Här beskriver vi en kvantitativ metod för att studera uncoating in vitro med hjälp av borrkärnor isolerad från smittsam HIV-1 partiklar. Den strategi som innebär isolering av kärnor genom sedimentation av koncentrerad virioner genom ett lager av tvättmedel och till en linjär sackaros gradient, i kylan. Att kvantifiera uncoating, är isolerade kärnor inkuberas vid 37 ° C för olika tidsintervall och därefter pelleterat genom ultracentrifugering. Omfattningen av uncoating analyseras genom att kvantifiera hur stor del av CA i supernatanten. Denna metod har använts för att analysera effekter av viral mutationer i HIV-1 kapsid stabilitet 4, 5, 6. Det bör också vara användbart för att studera betydelsen av cellulära faktorer i HIV-1 uncoating.
Protocol
1. Produktion av HIV-1 partiklar
Innan du fortsätter måste du skaffa tillstånd och följer riktlinjer från biosäkerhet kontor din institution att arbeta i en biosäkerhet anläggning godkänd för smittsam HIV. Du måste säkerställa att rätt vård och säkerhetsföreskrifter följs under arbetstid i biosäkerhet laboratoriet.
Produktion av HIV-1-partiklar är normalt utförs av övergående transfektion av 293T celler med HIV-1 proviral DNA med en kalcium metod fosfat transfektion 7, 8. Hög titer viruslagren vuxit genom odling av infekterade T-celler är också lämpliga.
- Kultur 293T celler i Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS) och kompletterades med antibiotika [Penicillin (100 IE / ml) och streptomycin (100 mikrogram / ml)] vid 37 ° C, 5% CO 2 .
- Koppla loss celler från nästan konfluenta rätter med 0,25% Trypsin-EDTA och utsäde 2x10 6
- Nästa dag bör cellen monolager vara ca 25% konfluenta och redo för transfektion. För sex rätter av celler som ska transfekterade, ta 120 mikrogram proviral DNA upp till en volym på 2,7 ml med sterilt vatten. För att denna blandning lägga till 0,3 ml 2,5 M CaCl 2 och 3 ml 2XBBS, och blanda ordentligt genom att pipettera upp och ned flera gånger. Låt blandningen stå i rumstemperatur i 10-20 minuter.
- Tillsätt 1 ml av blandningen droppvis till mitten av varje rätt och samtidigt snurra försiktigt för att blanda. Placera disken över natten (~ 16 timmar) i en inkubator inställd på 35 ° C och 3% CO 2.
- Aspirera odlingsmedium och försiktigt lägga till 5 ml PBS.
- Aspirera PBS och tillsätt 5 ml rent medium. Kultur cellerna i inkubator vid 37 &grader, C och 5% CO 2 för ytterligare 24-48 timmar.
- Samla supernatant som innehåller viruspartiklar, överför den till ett 50 ml koniskt centrifugrör. Kombinera supernatanterna från alla skålar och centrifugera vid 1500 xg under 5 min till pellets celler och skräp. Filtrera supernatanten med 0,45 ìm por-storlek spruta filter. Försiktighetsåtgärder bör vidtas för att minimera aerosolbildning vid arbete med levande virus. Detta inkluderar användning av koniska rör med O-ringar eller rotor täcker hink under centrifugeringen steg. Om detta inte är möjligt bör skruvlock av rören lindade med parafilm.
2. Koncentration av HIV-1 virioner genom ultracentrifugering
- Placera supernatant (30 ml) i en 38,5 ml polyallomer centrifugrör (för Beckmans SW32Ti rotor eller motsvarande). Försiktigt underlag viruset innehåller supernatanten med 5 ml lösning av 20% sackaros i PBS med hjälp av en 5 ml pipett.
- Centrifugera i 3 timmar vid32.000 rpm vid 4 ° C (175 tusen xgi r max) till pellets viruspartiklar.
- Avlägsna supernatanten genom aspiration, noga med att inte störa pelleten i botten av röret. Tillsätt 0,5 ml 1XSTE buffert (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) till röret och placera vid 4 ° C i 1 timme för att lossa pellets. Med hjälp av en bred bar en tip ml pipett försiktigt pipettera upp och ner några gånger för att lossa pellets från botten av röret. Därefter överför lossade pelleten i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med försiktighet för att undvika skumbildning. Inkubera vid 4 ° C i ytterligare 1-3 timmar för att tillåta små klumpar av viruset för att skingra. Under denna period förbereda sackaros lutning som beskrivs i steg 3,1.
- Försiktigt pipettera viruset fjädring upp och ner flera gånger och centrifugera vid 8000 rpm (6000 xg) vid 4 ° C i kylskåp mikrofugrör under 1 minut för att ta bort rester av klumpar. Förvara provet kallt under denna process.
3. Sackaros lutningcentrifugering för att isolera kärnor
HIV-1-kärnor är isolerade med hjälp av en "spin-thru"-metoden 9 som är en modifiering av den tidigare beskrivna metoden för rening av HIV-2 kärnor 10.
- Förbered en 12 ml linjärt 30% till 70% sackaros gradient i 1XSTE buffert i en 14,5 ml polyallomer centrifugrör för SW32.1Ti rotorn. För att förbereda lutning, använd en 20 ml gradient förra, plats 6 ml 70% sackaros lösning på den närmaste sidan (nära utloppet) och 6 ml 30% sackaroslösning på andra sidan. Se till att luftbubblor inte är fångade i kanalen som förbinder de två kamrarna. Använd den automatiska inte bestämmelserna om Flow gradient tidigare att pumpa gradient från botten till toppen av röret som innehåller 1 ml 85% sackaroslösning i botten. Placera försiktigt lutning vid 4 ° C tills svalnat (2-4 timmar).
- Med hjälp av en bred bar en tip ml pipettera försiktigt överlägg lutning med 0,25 ml 15% sackaroslösning i Ste innehåller 1% Triton X-100. Försiktigt overlay med 0,25 ml 7,5% sackaroslösning i Ste med ett brett bar en spets ml pipett. Var noga med att inte blanda lagren.
- Försiktigt overlay med 0,5 ml virussuspension från steg 2,4. Detta steg ska utföras noggrant för att undvika eventuella störningar i övertoningen och blandning av underlaid sackaros lager.
- Placera rören i den nedkylda SW32.1Ti hink och centrifugera vid 32.000 rpm (187 tusen xgi r max) över natten (16-20 timmar) vid 4 ° C. För att undvika att pausa av centrifugen, börja inte centrifugeringen tills vakuum i centrifugen når 250 ìm
- Samla 1 ml fraktioner från topp till botten av lutning med hjälp av Auto-inte bestämmelserna om Flow gradient fraktionerings. Placera rören på is omedelbart efter samlingen. Blanda innehållet i tuberna genom att vända några gånger och ta ut 50 l av varje fraktion för kvantifiering med ELISA eller omvänt transkriptas aktivitet analys.
4. Lokalisering av HIV-1-kärnoroch lagring av kärnor
- Innan du utför uncoating analyser är det viktigt att bestämma vilka fraktioner innehåller intakta HIV-1-kärnor. Detta kan avgöras genom att p24-ELISA eller omvänt transkriptas aktivitet analys med 50 l alikvoter från steg 3,6.
- Återhämtningen av CA i samband med kärnor är ofta relaterad till stabiliteten i kärnor. Mät kärnan tillhörande CA av p24-ELISA 9 med hjälp av ett prov från varje fraktion. Alternativt kan mäta omvänt transkriptas aktivitet av varje fraktion. Med båda metoderna toppen bör vara cirka bråkdel 10.
- Pool i fraktioner som innehåller kärnor. Om kärnor inte ska användas för uncoating analys omedelbart, uppmätt den poolade kärnor i 0,2 till 0,3 ml-portioner, flash-frysa i flytande N2 och förvara vid -80 ° C. Kärnor frysta på detta sätt är lämpliga för uncoating analysen. Avkastningen av de centrala-associerade CA är normalt 1-2 mikrogram p24 per milliliter eller ca 15% av den totala virionens-associeradep24.
5. Kinetisk analys av HIV-1 uncoating
- Mängden HIV-1-kärnor krävs per uncoating reaktionen är ca 50 ng. För att utföra in vitro uncoating analys, predilute den delmängd av kärnor med en lika stor volym kallt 1XSTE buffert för att minska viskositeten av fjädring och för att minimera pipettering fel.
- Späd ytterligare 100 ìl av kärnor in 0,15 ml kallt 1XSTE buffert som innehåller 10 mikrogram / ml av BSA i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Vi kompletterar STE bufferten med BSA (10 mikrogram / ml) för att minimera adsorption av CA på väggarna i röret. Blanda genom att vända röret flera gånger. Inte vortexblandare proverna. Inkubera rören i ett vattenbad vid 37 ° C under tidsintervall (15, 30, 60 och 120 min). Rören ska vara nedsänkt i vattenbad minst upp till nivån av den interna prov för att säkerställa jämn uppvärmning.
- Under inkubation, blanda försiktigt innehållet i röret regelbundet (vanligen 5 -10 min) genom att ställa röret. För en nolla minut kontroll, späd 100 ìl av kärnor in 0,15 ml kallt 1XSTE buffert och inkubera på is för hela experimentets längd (120 min). Den noll minuters kontroll ger de basala uncoating värde och används för att fastställa ökning uncoating kärnor inkuberas vid 37 ° C för olika tidsintervall.
- I slutet av inkubationstiden, stoppa uncoating processen genom att placera rören i isen i 10 minuter.
- Centrifugera rören vid 45.000 rpm (TLA-55 rotor, 125.000 xgi r max) under 20 minuter vid 4 ° C. Detta kommer att pellets den intakta kärnor och den fria CA frigörs som en följd av uncoating kärnor blir kvar i supernatanten. Rotorn ska precooled vid 4 ° C före lastning proverna.
- Överför supernatanten till nya precooled mikrofugrör tuber helst med hjälp av gel-lastning tips förvaras i rumstemperatur. Observera att pellets inte kommer att vara synlig för blotta ögat, så största försiktighet wedan pipettera ut supernatanten. Resuspendera pellets i 250 l av ELISA prov spädningsmedel (0,5% Triton X-100 och 5% Donor kalvserum i PBS). För att säkerställa en effektiv upplösning av pellets, virveln efter tillsättning av ELISA prov spädningsvätskan. Kvantifiera CA innehållet i pellets-och supernatanten med hjälp av p24-ELISA som beskrivs i följande avsnitt.
- Omfattningen av uncoating erhålls genom att beräkna andelen av CA som finns i supernatanten.
6. Assay för CA med p24-ELISA
- Många kommersiella ELISA kit finns tillgängliga och kan användas för att kvantifiera CA. Använd kommersiella eller "in-house" ELISA och inkluderar p24-standarder för att fastställa linjäriteten vid analysen. Utspädningar av prover bör analyseras för att säkerställa noggrannheten.
- Vi har utvecklat en hemmagjord ELISA som vi rutinmässigt använder för analys för CA. Förfarandet är anpassad från en tidigare rapport 11 och utförs med fångst och detektor antikroppar tillgängliga från NIH HJÄLPENS Forskning och Reference Reagent Program.
7. Representativa resultat:
Ett exempel på ett resultat av ELISA för bestämning av fraktioner som innehåller kärna visas i figur 1. Efter att samla fraktioner (1 ml vardera) var 50 ìl av prov från varje bråk som används för att göra spädningar och analyseras med ELISA. Den totala p24 erhålls genom att addera värdena för tolv fraktioner var 14,5 mikrogram. Som visas i figur fraktioner från 8 till 10 innehöll kärnor. Det p24 värdet för kärnan innehåller fraktioner var 2,17 mikrogram. Andelen core-associerad p24 (14,97%) bestämdes genom att förhållandet mellan p24-värde för kärnan fraktioner (2,17 mikrogram) till den totala p24 värdet (14,5 mikrogram). Fraktion 1 eller 2 kommer alltid att innehålla högsta beloppet av p24, vilket innebär fri CA som inte är associerad med kärnor. Detta följs av en gradvis minskning av p24-värden med varje efterföljande bråk, då en kraftig ökning och slutligen en kraftig minskning av p24värden. Om lämplig vård tas vid inläsning lutningen därefter toppen av core-associerade CA finns runt bråkdel 10.
Ett typiskt resultat som erhålls genom analys kinetik uncoating av HIV-1 kärnor visas i figur 2. Grafen visar en tidsberoende ökning uncoating av vild-typ HIV-1-kärnor. Det procent uncoating värde erhölls genom att beräkna andelen av CA som finns i supernatanten. Med praktiken är analysen mycket reproducerbar och är användbar för att bestämma stabilitet virala kärnor in vitro. Observera att reproducerbarheten för analysen är starkt beroende av korrekt hantering av proverna under förfarandet. Eftersom kärnorna är värme labila bör proverna hållas vid 4 ° C under hela testet, utom under inkubationstiden.
Figur 1 Equilibrium centrifugering densitetsgradient avHIV-1-kärnor. En koncentrerad virussuspension tillämpades på toppen av en 30 till 70% linjär sackaros lutning överdrog med 1% Triton-X-100. Efter övernattning centrifugering vid 187.000 xg och 4 ° C, var 1 ml fraktioner som samlas in från toppen (Fraktion 1) till botten (Fraktion 12) och p24 kvantifierades med ELISA.
Figur 2 Tid loppet av HIV-1 uncoating in vitro. Renat HIV-1-kärnor var utspädd och inkuberas vid 37 ° C under den angivna tidsintervall. Den noll min Urvalet gjordes inkuberades på is för hela längden av försöket. Efter inkubation, togs prover ultracentrifugeras på 125 tusen xgi 20 minuter vid 4 ° C. Supernatanten och pellets var separerade och analyseras av p24-ELISA. Omfattningen av uncoating bestämdes enligt protokollet texten. Varje uncoating reaktion utfördes i två exemplar; felstaplar span utbudet av de två värdena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här för att rena HIV-1-kärnor för att studera uncoating in vitro är användbar för att studera denna fas av hiv-1 livscykel, särskilt på grund av avsaknad av en validerad metod för att analysera HIV-1 uncoating i målceller. Även om denna metod använder jämvikt ultracentrifugering att rena kärnor, andra har använt direkt pelletering efter kort lys med 1% Triton-X-100 12, 13 eller pelletering genom sackaros kudde täckt med 0,1% Triton-X-100 14, 15.
Återhämtningen av kärnor som erhållits genom denna metod är föremål för experimentell variation. En variabel i framgången för detta protokoll är transfektion effektivitet. Typiskt vi lastar en mängd virus motsvarande minst 7 mikrogram av p24 på övertoningen. Vårt laboratorium använder en kalcium metod fosfat transfektion för virus produktion. Medan andra transfektion metoder kan också vara lämpliga, har vi utvärderat dem inte för isolering av kärnor. Andra viktiga variables som påverkar kärnan avkastningen är omsorg vid tillämpningen av lagren till lutning och i att hålla proverna kalla. Yttersta försiktighet måste iakttas vid beredning sackaros lutningar för att undvika blandning av lutning. Eventuella störningar samtidigt som den koncentrerade virussuspension kan leda till oönskade och tidig kontakt virioner med diskmedel under barriären sackaros lagret, såsom långvarig kontakt kan bryta isär den bräckliga kärnorna och leda till minskad kapsid förening. Det är också lika viktigt att hålla lutning sackaros densiteten och virussuspension kylan under hela förfarandet. Förfarandet har bemästrat och framgångsrikt används av många olika forskare i vårt laboratorium.
HIV-1-kärnor är värmekänsliga 4, och därför är det mycket viktigt att fraktioneras sackaros lutning medan det är kallt och att placera insamlade fraktioner omedelbart på is. Sedan uncoating av kärnor är också beroende av pH och salthalt i bufferten4, är det högst lämpligt att mäta pH STE buffert innan du fortsätter med analysen. Andelen uncoating kan variera något med varje sats kärnor. Uncoating reaktioner bör utföras i två exemplar, och om de värden som avviker mer än 15%, då reaktionerna ska utföras i tre exemplar tills konsistens uppnås. Gratis CA protein har en tendens att fastna på insidan av rören, därför är det nödvändigt att inkludera BSA en slutlig koncentration på 10 mikrogram / ml i reaktionsblandningen för att minimera adsorption av CA på väggarna i rören.
Som tidigare nämnts beskrev uncoating analysen här kan användas för att identifiera och studera cellulära faktorer som påverkar uncoating. Den kan också användas för att studera effekten av kapsid målsökande substanserna och cellulära faktorer på omvänd transkription i kärnor med hjälp av en endogen analys omvänd transkription. Isolering av HIV-1-kärnor i tillräcklig mängd kan också tillåta analysinteraktioner av kapsid med porös faktorer genom immunogold elektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
HIV-1 uncoating studier i Aiken laboratoriet fick stöd av NIH bidrag AI40364, AI50423 och AI076121. Flera viktiga material, inklusive reagens som används i p24 ELISA, lämnades av NIH aids forsknings-och referensbibliotek Program, Avdelningen för aids, NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C. Methods in Molecular Biology. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
