Summary
Uncoating는 HIV - 1 수명주기의 초기 단계에 필수적인 단계이며 capsid 쉘의 해체와 바이러스 ribonucleoprotein 복합 (vRNP)의 출시로 정의됩니다. 여기, 우리는 HIV - 1 virions에서 그대로 코어를 분리 및 그들의 uncoating을 quantifying 기술을 입증
Abstract
retroviruses의 게놈은 지질 봉투에 둘러싸인 capsid으로 쌌다는 것입니다. 이러한 HIV - 1과 같은 lentiviruses, 들어, 원뿔 capsid의 껍질은 육각의 격자로 배열 CA 단백질로 구성되어 있습니다. capsid는 원추 1, 2의 좁은 끝에 7 광범 끝에 pentamers와 5 닫힙니다. 이 capsid의 쉘으로 쌌다는 바이러스 ribonucleoprotein 복합이며, 함께 그들은 코어를 구성.
대상 세포막과 바이러스 세포막의 융합에 따라, HIV - 1은 세포질에 발표됩니다. capsid 다음 uncoating이라고도 과정에서 용해 형태로 3 무료 CA를 방출 disassembles. HIV - 1 uncoating의 세포내 위치와 타이밍을 제대로 이해하고 있습니다. capsid의 안정성을 변경 CA에서 단일 아미노 산 대체는 또한 세포 4 감염 HIV - 1의 능력을 손상. 이것은 capsid의 안정성은 HIV - 1 감염에 대해 중요한 것을 나타냅니다. HIV - 1 uncoating이 프로세스에 대한 민감하고 안정적인 assays의 가용성의 부족으로 인해 공부를 어렵게되었습니다. 여기 감염 HIV - 1 입자로부터 분리된 코어를 사용하여 체외에서 uncoating 공부를위한 양적 방법을 설명합니다. 접근 방식은 추위에 세제의 계층 통해 선형 자당 기울기에 집중 virions의 침강에 의해 코어의 고립을 포함한다. uncoating 계량하려면, 분리된 코어는 37 incubated 아르 ° C 각종 초과 간격 및 ultracentrifugation에 의해 연속적으로 pelleted하십시오. uncoating의 범위가 뜨는에서 CA의 분율을 quantifying 의해 분석됩니다. 이 접근은 HIV - 1 capsid 안정성 4, 5, 6에서 바이러스 변이의 효과를 분석하기 위해 고용되었습니다. 또한 HIV - 1 uncoating의 세포 요소의 역할을 공부하는 데 유용합니다.
Protocol
1. HIV - 1 입자의 제작
진행하기 전에 허가를 받아야하고 감염 HIV에 대한 승인 biosafety 시설에서 작업에 기관의 Biosafety 사무실에서 지침을 따르십시오. 그 적절한 치료를 보장해야하며, 안전 조치가 biosafety 연구실에 근무하는 동안 따라하고 있습니다.
HIV - 1 입자의 생산은 일반적으로 칼슘 인산염 transfection 방법 7, 8을 사용하여 HIV - 1 proviral DNA로 293T 세포의 과도 transfection에 의해 수행됩니다. 감염된 T 세포의 문화로 성장 높은 titer의 바이러스 주식도 적합합니다.
- 10% 태아 소 혈청 (FBS)과 항생제로 보충을 포함하는 Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 문화 293T 세포 [페니실린 (100 IU / ML) 및 스트렙토 마이신 (100 μg / ML)] 37 ° C, 5 % CO 2에서 .
- 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 종자 2x10 6을 사용 거의 합류 요리에서 세포를 분리
- 다음날, 세포 monolayers이 25 % 정도 합류하여 transfection 준비되어야합니다. transfected 수 세포 여섯 요리, 멸균 물 2.7 ML의 볼륨 proviral DNA 120 μg을 가져 오십시오. 이 혼합물 2.5 M CaCl 2 0.3 ML과 2XBBS 3 ML을 추가하고 몇 시간을 아래와 pipetting하여 적절히 섞는다. 혼합물이 10~20분 위해 상온에서 대기하도록 허용합니다.
- 섞어 부드럽게 소용돌이 치는 동안 각 요리의 중심에 결과 혼합 dropwise 1 ML을 추가합니다. 35 ° C 3 % CO 2 배양기 세트에 밤새 요리를 (~ 16 시간) 장소.
- 문화 매체를 대기음 부드럽게 5 ML PBS를 추가합니다.
- PBS를 대기음 신선한 매체의 5 ML를 추가합니다. 37 AT & 보육 문화의 세포있길, C와 5 % 추가 24~48시간 2를 CO.
- 바이러스 입자를 포함하는 문화 뜨는를 수집, 50 ML 원추형 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 모든 요리에서 supernatants를 결합하고 펠릿 세포와 찌꺼기로 5 분 1,500 XG에 원심 분리기. 0.45 μm의 기공 크기의 주사기 필터를 사용하여 표면에 뜨는을 필터링합니다. 주의 사항은 라이브 바이러스에 작업하는 동안 에어로졸 형성을 최소화하기 위해 이동해야합니다. 이것은 원심 분리의 단계에서 O - 링 또는 로터 버킷 커버와 원뿔 튜브의 사용을 포함하고 있습니다. 이것이 가능하지 않으면, 튜브의 나사 뚜껑은 parafilm로 포장되어야합니다.
2. ultracentrifugation에 의해 HIV - 1 virions의 농도
- 38.5 ML의 polyallomer의 원심 분리기 튜브 (베크 만 SW32Ti의 회전자 또는 이와 동등한 해당)의 문화 뜨는 (30 ML)를 놓습니다. 부드럽게 5 ML의 pipet을 사용하여 PBS에 20 %의 자당 5 ML 솔루션으로 바이러스가 포함된 뜨는을 밑받침.
- 3 시간 동안 원심 분리기4 32,000 RPM ° C (R 최대시 175,000 XG) 펠릿 바이러스 입자 수 있습니다.
- 튜브의 하단에있는 펠렛을 방해하지 않도록 돌봐, 흡인에 의해 뜨는 제거합니다. 4 관과 장소에 1XSTE 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL [산도 7.4], 100 MM NaCl, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎜)의 0.5 ML 추가 ° C 1 시간 동안 펠렛을 느슨하게합니다. 부드럽게 pipet 위아래로 몇 번 튜브의 바닥에서 펠릿를 분리하는 넓은 구멍 하나 ML의 pipet 팁을 사용합니다. 다음 거품 피하기 위해 간병, 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 느슨하게 펠렛을 전송. 바이러스의 작은 대단히 짧은 시간이 해산 수 있도록 다른 1~3시간 4 ° C에서 품어. 이 기간 동안, 같은 단계 3.1에서 설명한 자당 기울기를 준비합니다.
- 부드럽게 pipet 바이러스 정지 위아래로 4 8000 RPM (6,000 XG) ° C 1 분에 대한 냉장 microfuge시 몇 시간 및 원심 분리기는 잔류 대단히 짧은 시간을 제거합니다. 이 과정에서 샘플 추위 보관하십시오.
3. 자당 기울기코어를 분리하기 위해 원심 분리
HIV - 1 코어는 HIV - 2 코어 10 정화를 위해 이전에 설명한 방법의 수정입니다 "스핀 - thru"방법 9를 사용 고립됩니다.
- SW32.1Ti 회전자의 14.5 ML의 polyallomer의 원심 분리기 튜브의 1XSTE 버퍼에 12 ML 리니어 30% 70 % 자당 기울기를 준비합니다. 경사도를 준비하려면, 전 20 ML 기울기를 사용하여, 장소 가까운쪽에 70 % 자당 용액 6 ML (가까운 콘센트 포트)과 반대편에있는 30 % 자당 용액 6 ML합니다. 공기 방울이 두 방을 연결하는 채널에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 바닥에서 하단에있는 85 % 자당 용액 1 ML이 들어있는 튜브의 상단에 그라디언트를 펌프로 전 자동 Densi 흐름 구배를 사용합니다. 부드럽게 4 그라디언트를 배치 ° C까지 냉각 (2-4시간).
- 넓은 구멍 하나 ML의 pipet 팁을 사용하면 부드럽게 1퍼센트 트리톤 X - 100을 포함하는 STE의 15 % 자당 용액의 0.25 ML로 그라데이션을 오버레이. 넓은 구멍 하나 ML의 pipet 팁을 사용하는 STE에서 7.5 % 자당 용액의 0.25 ML로 부드럽게 오버레이. 레이어를 혼합하지 않도록주의하십시오.
- 2.4 단계에서 0.5 ML 바이러스 서스펜션과 함께 부드럽게 오버레이. 이 단계는 모든 그라디언트의 방해와 underlaid 자당 레이어의 혼합을 피하기 위해주의 깊게 수행해야합니다.
- 4 박 32,000 RPM (R 최대시 187,000 XG) (16~20시간)의 사전 냉각 SW32.1Ti 양동이와 원심 분리기 ° C.에 튜브를 삽입 원심의 진공이 250 μm의에 도달할 때까지 원심의 일시 중지되지 않도록하려면 원심 분리를 시작하지
- 상단에서 자동 Densi 흐름 기울기 fractionator를 사용하여 그라디언트의 하단에 1 ML 분수를 수집합니다. 수령 즉시 얼음에 튜브를 삽입합니다. 반전 몇 배 튜브의 내용을 믹스하고, 엘리사 또는 역방향 transcriptase 활동 분석에 의해 부량 각 분획의 50 μl를 철회.
4. HIV - 1 코어의 현지화그리고 코어의 저장 용량
- uncoating assays를 수행하기 전에, 그것은 분수가 그대로 HIV - 1 코어를 포함하고 결정하는 것이 중요합니다. 이것은 p24 엘리사 또는 단계 3.6에서 50 μl aliquots를 사용하여 역방향 transcriptase 활동 분석에 의해 결정하실 수 있습니다.
- 코어와 관련된 CA의 복구는 종종 코어의 안정성 관련이 있습니다. p24 엘리사 9 각 분획에서 샘플을 사용하여 코어 관련된 CA를 측정. 또한, 각 분획의 리버스 transcriptase 활동을 측정합니다. 두 가지 방법을 사용하여 정상이 분수 약 10하여야한다.
- 코어를 포함하는 분수 수영장. 코어는 0.2-0.3 ML의 aliquots, -80에서 액체 N2와 저장소에 플래시 동결 ° C.에 풀링된 코어 즉시 나누어지는를 분석을 uncoating 사용할 수없는 경우 이러한 방식으로 냉동 코어 uncoating 분석에 적합합니다. 코어 관련된 CA의 수확량은 일반적으로 p24 당 밀리리터 1-2 μg 또는 전체 virion - 관련의 약 15 %입니다p24.
5. HIV - 1 uncoating의 운동 분석
- uncoating 반응 당 필요한 HIV - 1 코어의 양은 약 50 NG입니다. 시험 관내 uncoating 분석에서 수행하려면 정지의 점도를 줄이기 위해 추운 1XSTE 버퍼의 동일한 볼륨 코어의 나누어지는을 predilute하고 pipetting 오류를 최소화하기 위해.
- 또한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에서 10 μg / BSA의 ML을 포함하는 차가운 1XSTE 버퍼의 0.15 ML로 코어 100 μl를 희석. 우리는 튜브 벽에 CA의 흡착을 최소화하기 위해 BSA (10 μg / ML)와 STE 버퍼를 보충. 반전 튜브를 여러 번하여 섞는다. 샘플 와동하지 마십시오. 37 물 목욕에 튜브를 품어 ° C 시간 초과 간격에 대한 (15, 30, 60 및 120 분). 튜브도 온난화을 보장하기 위해서는 적어도 최대 내부 샘플의 수준에 물 목욕에 열중한다.
- - 부화하는 동안 부드럽게 (보통 5 주기적으로 튜브의 내용을 혼합튜브를 flicking 10 분). 제로 분 컨트롤에 대한, 추운 1XSTE 버퍼의 0.15 ML로 코어 100 μl를 희석하고 실험 (120 분)의 전체 길이 얼음 알을 품다. 제로 분 컨트롤은 기초 uncoating 가치를 제공하고 다른 ° C 시간 초과 간격을 위해 37 incubated 코어 uncoating 증가를 결정하는 데 사용됩니다.
- 부화 기간의 끝에, 10 분 동안 얼음에 튜브를 삽입하여 uncoating 프로세스를 중지합니다.
- 45,000 RPM (TLA - 55 로터, R 최대시 125,000 XG)에서 튜브를 원심 4 20 분 ° C. 이것은 펠렛 코어 uncoating의 결과로 발표 그대로 코어와 무료 CA는 뜨는에 남아있는 것이다. 로터는 ° C 전에 샘플을 로딩하기 위해 4 precooled해야합니다.
- 가급적 상온에서 저장 겔 로딩 팁을 사용하여 새 precooled microfuge 튜브에 뜨는을 전송합니다. 펠렛은 육안으로 볼 수 없다는 점에 유의하시기 바랍니다, 그래서 극단주의 w를뜨는을 pipetting hile. 엘리사 샘플 희석제 250 μl (PBS에 0.5 % 트리톤 X - 100과 5% 기증자 송아지 혈청)에 알약을 Resuspend. 엘리사 샘플 희석제를 추가한 후 펠렛의 효율적인 해산, 소용돌이를 보장합니다. 는 다음 섹션에서 설명 p24 엘리사를 사용하여 펠렛과 뜨는의 CA 내용을 계량.
- uncoating의 범위는 뜨는에있는 CA의 분수를 계산하여 얻을 수 있습니다.
6. p24 엘리사에 의해 CA에 대한 분석
- 많은 상업 엘리사 키트는 가능하며 CA를 계량하는 데 사용할 수 있습니다. 상업적 또는 "사내"엘리사를 사용하여 분석의 선형을 결정하는 p24 기준을 포함합니다. 샘플 Dilutions는 정확성을 보장하기 위해 assayed해야합니다.
- 우리는 정기적으로 CA에 대해 분석하는 데 사용하는 수제 엘리사를 개발했습니다. 절차는 이전 보고서 11 적응하고 NIH 보조에서 제공 캡처 및 검출기 항체를 사용하여 수행됩니다S 연구 및 참조 시약 프로그램.
7. 대표 결과 :
코어를 포함한 분수를 결정하기위한 엘리사에서 결과의 예제는 그림 1에 표시됩니다. 분수 (1 ML 각)를 수집 후, 각 분획의 시료 50 μl는 시리얼 dilutions를 만들기 위해 사용되었으며 엘리사에 의해 분석. 열두 분수에 대한 값을 추가하여 얻은 총 p24는 14.5 μg되었습니다. 다른 이름으로 그림 분수에서 8-10 포함된 코어를 표시했습니다. 코어가 포함된 분수에 대한 p24 가치는 2.17 μg되었습니다. 코어 연관된 p24의 비율 (14.97 %)가 전체 p24 값 (14.5 μg)에 핵심 분수에 대한 p24 가치의 비율 (2.17 μg)을 복용에 의해 결정되었다. 분수 1 또는 2는 항상 p24의 최고 금액을 포함합니다, 이것은 코어와 관련되지 않습니다 무료로 CA를 나타냅니다. 이것은 이후의 각 분수와 p24 가치의 점진적 감소, 그리고 날카로운 증가와 p24의 마지막 날카로운 드롭을 따라값. 그라데이션을로드하는 동안 적절한 치료가 함락되는 순간면 코어 관련된 CA의 정상은 약 10 분수 발견된다.
HIV - 1 코어 uncoating의 속도론을 시금 얻은 전형적인 결과는 그림 2에 표시됩니다. 그래프는 야생 형 HIV - 1 코어 uncoating에서 시간 의존 증가를 보여줍니다. 가치를 uncoating %가 뜨는에있는 CA의 분수를 계산하여 얻은 것입니다. 연습, 분석은 높은 재현성하고 체외에서 바이러스 코어의 안정성을 결정하는 데 유용합니다. 분석의 재현성이 절차를 수행하는 동안 샘플의 적절한 취급에 크게 의존된다는 점에 유의하시기 바랍니다. 코어 더위 불안 정한 있으므로 샘플은 ° C의 분석을 통해 잠복기 동안을 제외한 4 유지되어야합니다.
1 평형 밀도 구배 원심 분리의 그림HIV - 1 코어. 집중 바이러스 정지 1% 트리톤 - X - 100과 함께 겹쳐 30~70% 선형 자당 기울기의 상단에 적용되었습니다. 187,000 XG와 4 박 원심 분리를 다음 ° C, 1 ML의 분수가 아래로 위로 (분수 1) (분수 12)에서 수집되었고 p24은 엘리사에 의해 계량했다.
체외에서 HIV - 1 uncoating 2 시간 코스를 그림. 정화 HIV - 1 코어가 ° C 지정된 시간 간격에 대한 희석하고 37 incubated했다. 제로 분 샘플은 실험의 전체 길이 얼음 incubated되었습니다. 부화 후, 샘플 4 ° C.에 20 분 동안 125,000 XG에 ultracentrifuged되었습니다 뜨는와 알약은 p24 엘리사로 구분하여 분석했다. 프로토콜 텍스트에서 설명한대로 uncoating의 범위가 결정되었습니다. 각 uncoating 반응은 중복으로 수행되었다; 오차 막대는 두 값의 범위를 스팬.
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Discussion
이 메서드는 대상 세포에서 HIV - 1 uncoating을 분석 검증 방법 unavailability 특히 인해 HIV - 1 수명주기의이 단계를 공부하는 데 유용합니다 체외에서 uncoating 공부 HIV - 1 코어를 정화하려면 여기를 설명했다. 이 방법은 코어를 정화 평형 ultracentrifugation를 사용하지만, 다른 사람들이 한때 용해 후 직접 pelleting를 사용한 1퍼센트 트리톤 - X - 100 12, 13 또는 0.1 % 트리톤 - X - 100 14, 15 겹쳐 자당 쿠션을 통해 pelleting.
이 방법에 의해 얻은 코어의 회수는 실험 유사 콘텐츠에 적용됩니다. 이 프로토콜의 성공의 변수는 transfection 효율이다. 일반적으로 우리는 그라디언트에서 p24의 최소 7 μg에 해당하는 바이러스의 수량을로드합니다. 저희 연구실은 바이러스 제작을위한 칼슘 인산염 transfection 방법을 사용합니다. 다른 transfection 방법도 적합 있지만, 우리는 코어 절연 그들을 평가하지 않았습니다. 기타 중요한 var에코어 수율에 영향을 미치는 iables은 그라디언트로 레이어를 적용과 샘플 차가운 유지에서 찍은 치료하고 있습니다. 그라디언트의 혼합하지 않도록 자당의 그라디언트를 준비할 때 최대한주의해야합니다. 집중 바이러스 서스펜션을 적용하는 동안 모든 소동이 장벽 자당 층 아래 세제로 virions의 바람직하지 초기 접촉을 초래할 수 있으며, 그러한 장기적인 접촉은 연약한 코어를 따로 휴식 및 감소 capsid 협회가 발생할 수 있습니다. 그것은 절차를 통해 자당 밀도 구배 및 바이러스 서스펜션 추위를 유지하는 것도 마찬가지로 중요합니다. 절차는 우리 연구실에서 여러 과학자들에 의해 마스터 성공적으로 사용되고 있습니다.
HIV - 1 코어는 4 열 - 불안 정한되며 그것이 차가운 얼음에 즉시 수집된 분수를 배치하는 동안 따라서 분류 자당 기울기에 매우 중요합니다. 코어 uncoating하면 산도와 버퍼의 소금 농도에 의존하기 때문에네, 그것은 분석하기 전에 STE 버퍼의 산도를 측정하기 매우 좋습니다. uncoating의 속도는 약간 코어의 각각의 배치와 다를 수 있습니다. Uncoating 반응은 중복으로 수행되어야하며, 값이 이상 15 %와 다를 경우 일관성이 달성 때까지 다음 반응은 세중의에 수행되어야합니다. 무료 CA 단백질은 튜브의 내벽에 집중하는 경향이있다; 따라서 그것은 튜브의 벽에 CA의 흡착을 최소화하기 위해 반응 혼합물에서 10 μg / ML의 최종 농도에 BSA를 포함하는 필수적입니다.
이전에 언급했듯이, uncoating 분석이 여기에 설명된 uncoating에 영향을 미치는 세포 요소를 식별하고 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 내생 역방향 전사 분석을 사용하여 코어에 반대 전사에 capsid 대상 화합물 및 세포 요인의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 충분한 수량의 HIV - 1 코어의 절연은 또한 분석을 허용할 수있다immunogold 전자 현미경에 의한 세포 요인과 capsid의 상호 작용.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
HIV - 1 에이 킨 실험실에서 uncoating 연구는 NIH 보조금 AI40364, AI50423 및 AI076121 지원했다. p24 엘리사에 사용되는 시약을 포함한 몇 가지 주요 자료, NIH AIDS 연구 및 레퍼런스 프로그램, 에이즈 학부, NIAID, NIH에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
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