Summary
في المقاطع التالية، ونحن الخطوط العريضة إجراءات لإعداد المجهرية الجينات لاستخدامها في التطبيقات الطبية الحيوية. نحن على وجه التحديد توضيح أسلوب متعدد الطبقات لخلق المجهرية الجينات لغرض مزدوج من خلية والتغليف البروتين كعلاج محتمل لمرض السكري من النوع 1.
Abstract
وقد تلقى الجينات القائم على المواد اهتماما كبيرا للتطبيقات الطبية الحيوية نظرا لطبيعتها المائية، توافق مع الحياة، والهندسة المعمارية المادية. وتشمل التطبيقات التغليف الخلية، تسليم المخدرات، زراعة الخلايا الجذعية، والسقالات هندسة الأنسجة. في الواقع، ويجري حاليا تجارب سريرية التي يجري تنفيذها في الجزر التي يتم تغليف في منظمة التحرير الفلسطينية microbeads الجينات المغلفة كعلاج لمرض السكري النوع الأول. ومع ذلك، يتعين على أعداد كبيرة من الجزر لفعالية بسبب سوء بقاء زرع التالية. قد القدرة على تحفيز الاوعية الدموية الدقيقة محليا تشكيل شبكة حول الخلايا مغلفة زيادة قدرتها على الاستمرار من خلال تحسين نقل الأوكسجين والجلوكوز والمواد المغذية الحيوية الأخرى. عامل نمو الخلايا الليفية-1 (جمعية جيل المستقبل-1) هو عامل نمو طبيعيا أن يكون قادرا على تحفيز الدم تشكيل السفينة وتحسين مستويات الأوكسجين في الأنسجة الدماغية. ومما يعزز من فعالية FGF-1 عندما يتم تسليمها في sustained أزياء بدلا من إدارة واسعة بلعة واحدة. ويمكن المحلية على المدى الطويل الإفراج عن عوامل النمو من أنظمة التغليف جزيرة تحفيز نمو الأوعية الدموية مباشرة نحو الخلايا المزروعة، وتحسين نتائج محتملة الكسب غير المشروع وظيفي. في هذه المقالة، نحن يحدد الإجراءات اللازمة لإعداد المجهرية الجينات لاستخدامها في التطبيقات الطبية الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن تصف طريقة التي قمنا بتطويرها لتوليد microbeads الجينات متعدد الطبقات. ويمكن تغليف الخلايا في الجينات الأساسية الداخلية، والبروتينات عائية في طبقة الجينات الخارجي. والافراج عن البروتينات من هذه الطبقة الخارجية حفز تشكيل شبكات الاوعية الدموية الدقيقة المحلية مباشرة نحو الجزر المزروع.
Protocol
بروتوكول هنا وصفا لإجراء ثلاث خطوات لتوليد microbeads الجينات متعددة الطبقات (الشكل 1). أولا، يتم تشكيلها microbeads الجينات (الشكل 2A). يتم وصف هذا الإجراء في القسم 1 أدناه. يمكن إضافة خلايا أو البروتينات إلى microbeads في هذه الخطوة من أجل بمثابة نظام التسليم. الخطوة التالية ينطوي على تشكيل طبقة permselective على microbeads، ويوصف في القسم 2. الخطوة النهائية ينطوي على تشكيل طبقة إضافية والجينات الموصوفة في القسم 3. ويمكن استخدام هذه الأشكال طبقة على السطح الخارجي للسطح من الخرز (الشكل 2B) لتغليف وتقديم الجزيئات العلاجية (الشكل 2C) لتوجيه استجابة الخليوي الى زرع النظام التالية.
1. الجينات Microbead التحضير
- تعد الجينات LVM 1.5٪ (W / V) حل عن طريق إذابة 15 جرام من الجينات LVM في 1 مل منالداخلية حل الجينات طبقة (25 العازلة HEPES مم، 118 مم كلوريد الصوديوم، 5.6 ملي بوكل، و2.5 ملم MgCl 2 في مياه DI، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.4). خلط على Vortexer حتى قوة الجينات قد حلت تماما لتشكيل واضح، حل لزجة. ملاحظة: هذا البروتوكول يصف الظروف المثلى لتغليف جزيرة داخل كبسولات الجينات ويمكن تغيير (1) تركيز وتكوين المجهرية الجينات لضبط خصائص لتطبيقات أخرى (مثل تسليم المخدرات وهندسة الأنسجة، وغيرها). ملاحظة: لتغليف جزيرة الجزر ويمكن أن يضاف إلى الحل الجينات في هذه الخطوة قبل التحميل في microencapsulator.
- إعداد حل يشابك (22 ملم CaCl 2 في المياه دي) عن طريق إذابة 100 ملي مول CaCl 2 و 10 ملم في HEPES العازلة للمياه DI وضبط درجة الحموضة إلى 7.4. ملاحظة: الكاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى مثل برازيلي 2 يمكن +، الأب، الخ + 2 يمكن استخدامها بدلا من الكالسيوم 2 +، وهذا يتوقف على طبيعة الجينات دبق دesired.
- إعداد سترة جويتين قناة microencapsulator الجينات من خلال إضافة إبرة عيار 25 إلى حقنة، وضبط صمامات على كل جانب للتأكد من أن الإبرة في وسط الغلاف الجوي. ويمكن استخدام الإبر قياس مختلفة لهذه الخطوة، وهذا يتوقف على حجم microbeads الجينات المستهدفة.
ويمكن أيضا أن هذه الخطوة أن يؤديها مع حقنة يجب، وهو microencapsulator لا تكون متوفرة. إضافة إلى حل الجينات الحقنة، وحدد مقياس إبرة استنادا إلى حجم microbeads المطلوب. - وضع قارورة تحتوي على 10 مل من محلول يشابك مباشرة تحت إبرة. وضع بقضيب في الحل.
- قطرات حقن مباشرة في حل 2 CaCl من أجل تشعبي في الجينات لتشكيل microbeads. احتضان حبات في حل يشابك لعلاج ما لا يقل عن خمس عشرة دقيقة، مع التحريك المستمر.
- نقل حبات لأنبوب الطرد المركزي 15 مليلتر. إزالة حل المتبقية،وتؤدي ثلاث غسلات مع 2 CaCl 0.2٪ في محلول ملحي لمدة دقيقتين لكل منهما.
2. طلاء Microbeads مع بولي-L-الأورنيثين
- إعداد 3 مل من محلول 0.1٪ (W / V)، وبولي-L-الأورنيثين (منظمة التحرير الفلسطينية) في ملحي عادي. وضع حل في دوامة حتى يذوب تماما، وتشكل حلا واضحا. ويمكن استخدام بولي-L-يسين (PLL) بدلا من منظمة التحرير الفلسطينية لهذه الخطوة، مما يؤدي الى مستويات مماثلة من permselectivity.
- نقل microbeads الجينات في حل منظمة التحرير الفلسطينية. مكان في دوامة لمدة 30 دقيقة للسماح لمنظمة التحرير الفلسطينية ما يكفي من الوقت للتفاعل مع الجينات، وتشكيل مجمع polycation-polyanion. في نهاية 30 دقيقة، ويجب أن يكون هناك طلاء مرئية بوضوح الأبيض حول microbeads الجينات.
- إزالة حل منظمة التحرير الفلسطينية، وأداء ثلاث غسلات مع 2 CaCl 0.2٪ في ملحي لمدة دقيقتين لكل منهما.
3. خلق الجيني الخارجي لايإيه
- يعد حل الجينات من التركيز المطلوب الذي سيتم استخدامه لإنشاء طبقة الخارجي. يتم تحضير محلول كما هو موضح في (1.1) أعلاه. ويتأثر حجم الطبقة الخارجية من قبل تكوين وتركيز من الجينات المستخدمة (الشكل 3).
- نقل الجينات إلى microbeads مصفاة الخلية. استخدام Kimwipe لامتصاص فائض حل من أجل تجفيف microbeads قدر الإمكان.
- نقل microbeads على سطح Parafilm. يمكن أن تكون بديلا الأسطح الملساء الأخرى مثل الزجاج أو حتى طبق بيتري من البلاستيك لParafilm، اذا شئت.
- نقل الجينات حل أعدت في (3.1) على microbeads الجينات. حجم حل الجينات ينبغي أن تغطي تماما microbeads الجينات. السماح للmicrobeads تبقى في حل الجينات لمدة 45 دقيقة.
- استخدم ماصة لإزالة حل الجينات الزائدة ليست ملزمة للmicrobeads.
- نقل microbeads فيفي التوصل إلى حل من CaCl 22mm و 2. هذا crosslinks الحل الجينات في جميع أنحاء microbeads، مما أدى إلى تشكيل طبقة متميزة الجينات الخارجي.
- أداء ثلاث غسلات مع 22 ملم CaCl 2 في ملحي لمدة دقيقتين لكل منهما. وينبغي عرض microbeads تحت المجهر تسمح لطبقة متميزة الجينات الخارجي أن ينظر إليها تشكلت حول microbead الأساسية.
4. ممثل النتائج
الشكل 1. والتخطيطي لإجراء لخلق microbeads الجينات متعدد الطبقات. تتكرر بإذن من خانا وآخرون. J بيوميد ماطر الدقة A. نوفمبر، 95 (2)، 632-40 (2010).
الشكل 2: (أ) و (ب) عبارة عن صور المقابل مرحلة من microbeads الجينات. (أ) يظهر microbeadبعد الخطوة توليف (1.7)، بينما (B) يعرض طبقة متميزة الجينات الخارجي الحالي بعد الانتهاء من الخطوة (3.7). (ج) هو صورة FITC من بروتين BSA fluorescently المسمى مغلفة في الطبقة الخارجية. تتكرر بإذن من خانا وآخرون. J بيوميد ماطر الدقة A. نوفمبر، 95 (2)، 632-40 (2010).
شخصية يمكن أن 3. أن تختلف حجم طبقة الجينات الخارجي على أساس تكوين وتركيز من الجينات المستخدمة. نتائجنا تظهر أنه، على حد سواء LVM والجينات LVG، وحجم الطبقة الخارجية الزيادات مع تركيز متزايد الجينات، والجينات التي تؤدي LVG الطبقات سمكا الخارجي من الجينات LVM بتركيزات على قدم المساواة. تتكرر بإذن من خانا وآخرون. J بيوميد ماطر الدقة A. نوفمبر، 95 (2)، 632-40 (2010).
الشكل 4. الإصدار من جمعية جيل المستقبل-1، عامل نمو عائية بروتين، من طبقة الجينات الخارجي تختلف استنادا إلى تركيز LVM وLVG الجينات المستخدمة. (أ) و (ب) الإفراج في المئة المعرض، و (ج) و (D) للدلالة على الإفراج الجماعي المقابلة من جمعية جيل المستقبل-1 مقابل الوقت لمختلف الصيغ الطبقة الخارجية هناك إصدار انفجار عرضت لجميع الأوضاع داخل H 5 الأولي (A و C)، وجرعة منخفضة من إطلاق متواصل لمدة تصل إلى 30 يوما (B و D). تتكرر بإذن من خانا وآخرون. J بيوميد ماطر الدقة A. نوفمبر؛ 95 (2)، 632-40 (2010) انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجينات هي الطبيعية، والسكاريد الحمضية المستخرج من الطحالب، وتتكون من وحدات من 1،4 '-β-D-mannuronic حامض (M) و α-L-guluronic حامض (G) 2،3. دبق بسيط يحدث عندما الكاتيونات ثنائي التكافؤ، مثل الكالسيوم 2 +، 2 + الأب، أو با 2 + التفاعل مع G-مونومرات تشكيل الجسور الأيونية بين سلاسل الجينات المجاورة. وقد استخدمت Microbeads من الجينات لتقديم مجموعة متنوعة من البروتينات، بما في ذلك عامل نمو الخلايا الليفية-1 (جمعية جيل المستقبل-1)، عامل نمو الأعصاب، عامل تثبيط سرطان الدم، وعامل نمو بطانة الاوعية الدموية (VEGF)، وبالنسبة لتغليف الخلايا بما في ذلك خلايا الكبد، غضروفية والجزر. مزايا استخدام هذا النظام البوليمر microparticle تشمل حماية من البروتينات والخلايا من التدهور وردود الفعل في الجسم، وحجم الجسيمات الصغيرة مما يسمح للإدارة سهلة من خلال حقن، والسيطرة على انتشار المذاب بواسطة التلاعب في الخصائص الفيزيائية للمادة.
الجينات المجهرية مغلفة بطبقة البوليمر permselective حاليا في تجارب سريرية لعلاج مرض السكري من النوع الأول. ومع ذلك، فإن الاستمرار في الأجل الطويل من الجزر مغلفة المزروعة يعتمد، في جزء منه، على قدرتها على الحصول على الأوكسجين والمواد المغذية من تدفق الدم في الأوعية الدموية. ويجوز للنظام مادة بيولوجية التي يمكن أن تخدم في الوقت نفسه كنظام التغليف عن الجزر، فضلا عن نظام الدفع المستمر للبروتينات عائية تحفيز نمو الأوعية الدموية حول الخلايا المزروعة، مما أدى إلى بقاء الكسب غير المشروع وتحسين. اتساع الأوعية الدموية المستمرة يتطلب إطلاق سراح متواصلة من جمعية جيل المستقبل-1 بدلا من إدارة بلعة واحدة. في هذا المقال [جوف]، نقدم هذا النهج لتوليد microbeads الجينات متعددة الطبقات (الشكل 1). ويمكن استخدام الطبقة الخارجية من أجل إطلاق سراح التغليف والمستدام للجمعية جيل المستقبل-1 في حين يمكن استخدامها في الطبقة الداخلية للimmunoisolation من عمليات زرع جزيرة (الشكل 2
وقد أظهرت مختبرنا في وقت سابق ان ولادة مستمرة من جمعية جيل المستقبل-1 بدلا من إدارة عالية البلعة من نتائج، والبروتين في استجابة شبكة الاوعية الدموية الدقيقة المستمرة 4-6. ويمكن استخدام نظام وصفها هنا لتوليد الطبقة الخارجية للتسليم من البروتينات عائية، مثل جمعية جيل المستقبل-1 (الشكل 2). ويمكن تغيير حجم الطبقة الخارجية على أساس تكوين وتركيز من الجينات المستخدمة (الشكل 3). ويمكن لحجم هذه الطبقة الخارجية تلعب دورا مهما في نجاح هذه النظم. يمكن أن خصائص الطبقة الخارجية تؤثر على حد سواء الافراج عن الجزيئات العلاجية في الأنسجة المحيطة بها، ونقل المواد الغذائية والجزيئات مما يشير إلى الخلايا في الجينات الداخلية. وسوف خصائص الطبقة الخارجية تحتاج إلى أن يكون الأمثل لتطبيق معين. لإيصال FGF-1، يمكن أن يتحقق الإفراج مستمرة لمدة تصل إلى 30 يوما اعتمادا على شكل الجيناتulation (الشكل 4) 7 و 8.
وقد أظهرت التجارب السريرية باستخدام الجزر مغلفة في كبسولات الجينات بعض الأمل لعلاج مرض السكري النوع الأول. ومع ذلك، يتعين على أعداد كبيرة من الجزر لفعالية بسبب بقاء الفقراء بعد الزرع. قد القدرة على تغليف الجزر في كبسولات متعددة الطبقات التي يتم فيها الافراج عن بروتين عائية من الطبقة الخارجية تعزيز الجدوى من الجزر المزروع. وهذا يمكن تحسين قابلية تقليل عدد الجزر المطلوبة للعلاج، وزيادة الأثر المحتمل السريرية وتوفر هذه العلاجات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل وزارة الخارجية الامريكية لشؤون المحاربين القدامى (واشنطن دي سي)، ومنح 0852048، 0731201، 0854430 و من المؤسسة الوطنية للعلوم (أرلينغتون، فيرجينيا)، ومنح RO1 DK080897 من المعاهد الوطنية للصحة (بيثيسدا، MD) . تلقى السيد خانا الدعم من التبرع السخي من السيد إدوارد روس والدكتور مويا مونيكا من مؤسسة بيل وميليندا غيتس (سياتل، واشنطن).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
