Summary
以下のセクションでは、我々は、生物医学アプリケーションで使用するためのアルギン酸ミクロスフェアを調製するための手順を概説します。我々は、特に1型糖尿病の潜在的な治療法として細胞やタンパク質のカプセル化という二重の目的のために多層アルギン酸ミクロスフェアを作成するためのテクニックを示しています。
Abstract
アルギン酸をベースとする材料がよいため、親水性、生体適合性、および物理アーキテクチャの生物医学アプリケーションのためにかなりの注目を集めている。アプリケーションは、細胞のカプセル化、薬物送達、幹細胞培養、組織工学の足場が含まれています。実際に、臨床試験が現在の島が、I型糖尿病の治療薬としてPLOコーティングされたアルギン酸ビーズ中にカプセル化されている実行されている。しかし、島の多数は移植後の生存率が低いことに起因する効果のために必要とされています。局所的にカプセル化されたセルの周囲に微小血管ネットワーク形成を刺激する能力は、酸素、ブドウ糖やその他の重要な栄養素の改善されたトランスポートを介して自分の可能性を高める可能性があります。線維芽細胞成長因子1（FGF-1）は、血管形成を刺激し、虚血組織中の酸素濃度を向上させることができる天然の成長因子である。それはSUSTに配信されたときにFGF-1の有効性が強化されていますainedファッションではなく、単一の大規模ボーラス投与。膵島カプセル化システムからの成長因子のローカルの長期のリリースでは、潜在的に機能的な移植の転帰を改善する、移植細胞に向かって直接血管の成長を刺激する可能性があります。この記事では、我々は、生物医学アプリケーションで使用するためのアルギン酸ミクロスフェアを調製するための手順を概説します。さらに、我々は多層アルギン酸ビーズを生成するために開発する方法を説明します。細胞は、外側のアルギン酸塩層の内側のアルギン酸コア、新生タンパク質にカプセル化することができます。この外側の層からのタンパク質の放出は、移植膵島に向かって直接ローカル微小血管ネットワークの形成を刺激するだろう。
Protocol
ここでプロトコルは多層アルギン酸マイクロビーズ（ 図1）を生成するための3つのステップの手順について説明します。まず、アルギン酸マイクロビーズ（ 図2A）が形成されている。この手順は、以下のセクション1に記載されている。細胞やタンパク質は、配信システムとして動作するために、このステップのマイクロビーズに追加することができます。次のステップでは、マイクロビーズ上に選択透過層の形成を含み、第2章で説明されています。最後のステップは、追加のアルギン酸塩層の形成を伴い、第3節で説明されています。ビーズの表面（ 図2B）の外側にこの層の形態は、移植後のシステムへの細胞応答を誘導する治療用分子（ 図2C）をカプセル化し、提供するために使用することができます。
1。アルギン酸マイクロビーズの調製
- 1mL中にLVMアルギン酸の15グラムを溶解することによって1.5％（w / v）のLVMアルギン酸溶液を調製内層アルギン酸塩溶液（25 mM HEPES緩衝DI水にある118軒のNaCl、5.6 mMの塩化カリウム、2.5 mMのMgCl 2、pH7.4に調整）。アルギン酸塩の電源が完全に透明で粘性のある溶液を形成するために溶解するまでボルテックスで混和します。注：このプロトコルは、アルギン酸マイクロカプセル内の膵島のカプセル化のための最適な条件を記述する1アルギン酸ミクロスフェアの濃度と組成は、他のアプリケーション（例えば、薬物送達、組織工学など）に注意するためのプロパティを調整するために変更することができます。膵島のカプセル化膵島microencapsulatorにロードする前にこの段階でアルギン酸塩溶液に添加することができます。
- DI水に100 mMのCaCl 2及び10mMのHEPES緩衝液に溶解し、pH7.4に調整することにより、架橋溶液（純水で22 mM CaCl 2を ）準備します。注意：このようなBr 2のような他の二価陽イオン+、Srの2 +などがアルギン酸ゲルdの性質に応じて、Ca 2 +の代わりに使用することができますesired。
- シリンジに25ゲージの針を追加することにより、2チャンネルエアジャケットアルギン酸microencapsulatorを設定し、針がエアジャケットの中央にあることを確認するために、各側にバルブを調整します。異なるゲージの針がターゲットアルギン酸マイクロビーズのサイズに応じて、このステップに使用することができます。
このステップはまた、注射器で行うことができ、microencapsulatorが使用可能であるべきではありません。シリンジにアルギン酸塩溶液を追加し、希望するマイクロビーズのサイズに基づいて、ニードルゲージを選択します。 - 直接針の下に架橋溶液10 mLを入れたフラスコを置きます。溶液中で攪拌棒を配置します。
- マイクロビーズを形成するために、アルギン酸を架橋するためには、CaCl 2溶液に直接滴を注入します。連続的に攪拌しながら、少なくとも15分間硬化させるために架橋溶液中でビーズをインキュベートします。
- 15 mLの遠心チューブにビーズを転送します。 、残液を除去すると2分ごとに生理食塩水で0.2％CaCl 2で3回洗浄を行います。
2。ポリ-L-オルニチンでコーティングMicroBeadsを
- 生理食塩水のポリ-L-オルニチン（PLO）の0.1％（w / v）溶液3 mLを準備します。それは完全に透明な溶液を形成し、溶解するまでボルテックスでソリューションを配置します。ポリ-L-リジン（PLL）は、選択透過性と同様のレベルで、その結果このステップのためにPLOの代わりに使用できます。
- PLO溶液にアルギン酸ビーズを転送します。ポリカチオン、ポリアニオン複合体を形成し、アルギン酸塩と相互作用するPLOに十分な時間を可能にするために30分間ボルテックス上に置きます。 30分の終わりには、アルギン酸マイクロビーズ周りにはっきりと見える白いコーティングがあるはずです。
- PLOのソリューションを削除し、2分ごとに生理食塩水0.2％CaCl 2で3回洗浄を行います。
3。外アルギン酸を作成するには、レイえー
- 外側の層を作成するために使用される所望の濃度のアルギン酸塩溶液を準備します。 （1.1）上記のような溶液を調製する。外層のサイズは、（ 図3）を使用アルギン酸の組成および濃度の影響を受けています。
- セルストレーナーにアルギン酸ビーズを転送します。可能な限りマイクロビーズを乾燥するために、余分な溶液を吸収するためにキムワイプを使用しています。
- パラフィルムの表面にマイクロビーズを転送します。必要に応じて、例えば、ガラスあるいはプラスチック製のペトリ皿のような他の滑らかな表面は、パラフィルムの代わりに使用できます。
- アルギン酸マイクロビーズ上（3.1）で調製したアルギン酸塩溶液を転送します。アルギン酸溶液の体積は、完全にアルギン酸ビーズをカバーする必要がありますすることができます。マイクロビーズは、45分間アルギン酸塩溶液に残ってみましょう。
- マイクロビーズに結合していない過剰なアルギン酸塩溶液を削除するには、ピペットを使用しています。
- のマイクロビーズを転送22mmのCaCl 2の溶液へ。これは、別個の外側のアルギン酸塩層を形成し、その結果、マイクロビーズの周りにアルギン酸塩溶液を架橋。
- 2分ごとに生理食塩水に22 mMのCaCl 2で3回洗浄を行います。顕微鏡下でマイクロビーズを表示すると、コアのマイクロビーズの周りに形成され見られるように別個の外側のアルギン酸塩層のために許可する必要があります。
4。代表的な結果
図1多層アルギン酸ビーズを作成する手順の概略。 Khanna らから許可を得て複製。 J BIOMEDマーテル解像度A. 11月95（2）、632から40（2010）。
図2（A）と（B）アルギン酸マイクロビーズの位相コントラストイメージです。 （）マイクロビーズを示しています。後の合成工程（1.7）、（B）ステップ（3.7）の完了後に存在する別個の外側のアルギン酸塩層を表示した。 （C）外側の層にカプセル化された蛍光標識したBSA蛋白質のFITCイメージです。 Khanna らから許可を得て複製。 J BIOMEDマーテル解像度A. 11月95（2）、632から40（2010）。
図は3つ。外側のアルギン酸塩層のサイズが使用アルギン酸塩の組成及び濃度に基づいて変化させることができる。我々の結果は、増加するアルギン酸塩濃度を有する外層のサイズが増加すると、LVMおよびLVGアルギン酸の両方の、ことを示し、そのLVGアルギン酸塩は、同じ濃度でLVMアルギン酸よりも厚い外層が得られます。 Khanna らから許可を得て複製。 J BIOMEDマーテル解像度A. 11月95（2）、632から40（2010）。
FGF-1の図4。リリース、外側のアルギン酸塩層からの血管新生増殖因子タンパク質は、使用するLVMとLVGアルギン酸塩の濃度に基づいて変化した。 （A）と（B）％の放出を示し、（C）と（D）別の外層製剤の時間に対するFGF-1の対応する質量放出を示す。すべての初期5時間（AとC）内の条件、30日（BおよびD）までの低線量連続リリースのために展示バースト放出があります。 Khanna らから許可を得て複製。 J BIOMEDマーテル解像度A. 11月; 95（2）、632から40（2010） 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
アルギン酸塩は藻類から抽出された、1,4 '-β-D-マンヌロン酸（M）とα-L-グルロン酸（G）2,3の単位で構成されている天然の酸性多糖類である。シンプルなゲル化が発生したときに、例えばCa 2のような二価陽イオン、+、のSr 2 +、またはBa 2 +、隣接するアルギン酸塩の鎖間のイオン架橋を形成するG-モノマーと対話します。アルギン酸マイクロビーズは、線維芽細胞成長因子1（FGF-1）を含む、様々なタンパク質を提供するために利用し、神経成長因子、白血病抑制因子、血管内皮増殖因子（VEGF）、および軟骨細胞を含む細胞のカプセル化のため、肝されていますと小島。このような微粒子ポリマー系を使用することの利点は、注射を介して容易な管理を可能にする体、小粒子量の低下や反応からのタンパク質や細胞の保護、および材料の物理的特性の操作による溶質拡散の制御が含まれています。
選択透過性のポリマー層で被覆されたアルギン酸ミクロスフェアは、I型糖尿病の治療のため、現在臨床試験中である。しかし、移植されたカプセル化膵島の長期生存率は血管の血液の供給から酸素と栄養分を獲得する能力に、部分的に依存しています。膵島のカプセル化システムと同様に血管新生タンパク質の持続的なデリバリーシステムとして同時に機能する生体システムが改良された移植片の生存率で、その結果、移植細胞の周囲に血管の増殖を刺激する可能性があります。永続的な血管新生は、FGF-1の徐放性ではなく、単一のボーラス投与を必要とします。このJoveの記事では、多層アルギン酸マイクロビーズ（ 図1）を生成するためのアプローチを提示します。内側の層は、膵島移植のimmunoisolationのために使用することができますが、外側の層は、（ 図2 FGF-1のカプセル化と徐放のために使用することができます
我々の研究室では以前にFGF-1の持続配信ではなく、タンパク質の高ボーラス投与、持続的な血管ネットワークの応答4-6の結果が示されている。ここで説明するシステムは、FGF-1（ 図2）血管新生タンパク質の送達のための外側の層を生成するために使用することができます。外層のサイズは、（ 図3）を使用アルギン酸の組成及び濃度に基づいて変化させることができる。この外側の層のサイズがシステムの成功に重要な役割を果たしている可能性があります。外側の層の特性は、周囲の組織に治療用分子の放出と内側のアルギン酸塩の細胞に栄養素やシグナル伝達分子の輸送の両方に影響を与える可能性がある。外側のレイヤーのプロパティは、特定のアプリケーション用に最適化する必要があります。 FGF-1の配信のために、徐放は、アルギン酸塩の形に応じて30日までに達成することができる。ulation（ 図4）7、8。
アルギン酸マイクロカプセルの中にカプセル化膵島を用いた臨床試験では、I型糖尿病の治療薬として、いくつかの約束を示している。移植後の生存率が低いのしかし、島の大規模な番号が有効性に必要とされる。血管新生タンパク質は外側の層から放出された多層マイクロカプセル中の小島をカプセル化する機能は、移植膵島の生存率を高めることができる。この改良された生存率は、これらの治療の潜在的な臨床的影響と可用性が向上し、治療するために必要な膵島の数を減らすことができます。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この研究は国立衛生研究所からの米国退役軍人局（ワシントンDC）、助成金0852048、0731201、および0854430国立科学財団（アーリントン、バージニア州）から、および助成金RO1 DK080897（ベセスダ、MD）によってサポートされていました。氏カンナは、ビル＆メリンダ·ゲイツ財団（ワシントン州シアトル）から氏エドワード·ロス博士モニカ·モヤで寛大な寄付から支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronova Ultrapure LVG alginate | Nova-Matrix | 4200006 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Pronova Ultrapure LVM alginate | Nova-Matrix | 4200206 | A variety of alginate formulations are available. The choice of alginate influences the end properties of the microbeads, including size, mechanical properties, and transport. The composition used should be optimized for a given application. |
| Poly-L-ornithine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P2533 |
References
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