Medicine

ラットの坐骨神経と疼痛過敏テストの慢性的なくびれ

Published: March 13, 2012 doi: 10.3791/3393

Paul J. Austin¹, Ann Wu¹, Gila Moalem-Taylor¹

¹School of Medical Sciences, University of New South Wales

Summary

手術のシンプルかつ堅牢な行動の結果により、坐骨神経の慢性収縮は、神経因性疼痛の卓越した動物モデルの一つです。手術後24時間以内に、疼痛過敏症は、von Freyの角膜知覚計（機械試験）と足鎮痛メーター（温度試験）を使用して確立されており、定量的に測定することができます。

Abstract

慢性の神経因性疼痛は、中枢または末梢神経系への損傷に起因する、人口の^1,2の7から18パーセントに影響を与え、流行と衰弱状態です。症状は、自発的（のようなうずき、燃焼、電気ショック）の痛み、dysaesthesia、感覚異常、アロディニア（痛みは通常は非痛み刺激に起因する）と痛覚過敏を（痛み刺激に対する応答の増加）が含まれています。感覚症状は、不眠やうつ病などの行動障害との併存である。慢性神経因性疼痛を勉強する末梢神経損傷を模倣するいくつかの動物モデルが開発されている、最も広く使用されているの一つは、ベネットと謝（1988年）一方的な坐骨神経の慢性狭窄損傷^{（CCI）3（} 図1）。ここでは、CCIとテストの疼痛過敏を実行するための手法を提案する。

CCIは、次のようにすることによって公開された一方の側の坐骨神経で、全身麻酔下で行われる親族切開し、中殿浅と大腿二頭筋の筋肉の間に結合組織を切断する。四クロム腸の字だけ閉塞するために、1ミリメートルの間隔で坐骨神経の周りにゆるく結んが神経鞘の血流を逮捕されていません。傷は皮膚の筋肉やステープルで縫合閉鎖しています。疼痛過敏症テストを開始する前に、動物は、その後24時間の手術から回復するために許可されています。

行動テストのために、ラットを試験装置に配置され、テスト手順に慣らすために許可されています。テストエリアは、坐骨神経の分布範囲内に後足の半ばに底表面（ 図2）です。機械的な撤退のしきい値は機械的に電子の動的足底のフォン·フレイ角膜知覚計またはマニュアル·フォン·フレイ毛^4を使用^して負傷し、無傷の後肢の両方を刺激することによって評価されています。機械的な撤退のしきい値は、作用する最大圧力です。（グラム）足の撤退をトリガします。第一ハーグリーブスら（1988）によって記述され、熱回収の遅延の測定については、後足は足鎮痛メーター^5,6を使用^して、透明なガラス表面からの放射熱のビームにさらされている。熱刺激に撤退レイテンシが負傷し、無傷の両方の後肢の足撤退のための時間として記録されます。以下CCI、負傷した足に機械的な撤退のしきい値と同様に、熱回収の遅延は、ベースラインの測定と無傷の足（ 図3）と比較して、両方とも大幅に減少しています。疼痛過敏症テストを組み合わせた末梢神経損傷のCCIモデルでは、慢性の神経因性疼痛を変更するには、潜在的な治療薬の有効性を検討するためのモデルシステムを提供します。私たちの研究室では、病因に神経免疫相互作用の役割を調べるために後肢の熱的、機械的な感度と一緒にCCIを活用神経因性疼痛の治療と。

Protocol

1。坐骨神経の慢性くびれ

無菌テクニックは外科的処置に使用する必要があります。 70％エタノールで手術の作業面を消毒し、オートクレーブで滅菌し、事前の機器（例えば、微細なハサミ、鉗子、およびトラクター）、ガーゼ、ステープルと綿棒で準備します。複数の手術については、70％エタノールまたはラットの間に乾燥したビーズ滅菌器と楽器をきれいにし、resterilise。手術用マスク、ヘアボンネットと滅菌手袋を着用する必要があります。

神経の収縮のために、乾燥を防ぐために、滅菌生理食塩水に浸漬し、約3 cmの長さの小片にそれを切断することによりクロム腸縫合糸を準備します。傷を閉じるため、市販の滅菌絹縫合糸を使用しています。

O ₂におけるイソフルランの5％を使用した誘導チャンバ内にラットを麻酔をかけるし、フェイスマスク、カスタムメイドを経由してO ₂にイソフルラン2％を提供し、手順の実行中にanesthetised動物を監視する。一般的な代替麻酔薬はハロタンまたはペントバルビタール腹腔内ナトリウムを吸入されています。これらの受容体は神経因性疼痛の開発において重要であるので、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体拮抗薬としてケタミンは、避けるべきである。
ラットの左後肢を剃る。その後、37℃の熱安定化された加熱マットの上に動物を配置°Cと目に潤滑眼軟膏を適用します。
70％イソプロピルアルコールとヨウ素溶液の3つの代替アプリケーションで剃毛面積を滅菌する。
その胸/胸の上に横たわったラットと、左後肢を高め、足にマスキングテープを使用して、背骨に対して90°にfemorの位置に保持します。
皮膚と平行に切開が、femor以下3〜4ミリメートルを作成し、結合組織を切断することによって切開を周囲の筋肉から皮膚を解放します。
臀筋浅上腕二頭筋との間に結合組織を切って鈍いはさみを使用して、大腿の筋肉。
坐骨神経の明確な可視化を可能にする、二つの筋肉の間のギャップを広げるためにトラクターを使用しています。
湾曲した平滑末端先端鉗子、マイクロはさみを使用して、そっとフリー周囲の結合組織からの坐骨神経（坐骨三つの部分に分かれることに近位）の約10ミリメートル。
顕微鏡と良好な光源下で、坐骨神経の三分割に近ダブルノットを持つ4つの合字（クロム腸4.0、エチコン、米国）、間隔を1 mm、接続します。各字では、単一の緩いループを開始し、ループに近い両端をつかみ、ループがかろうじてぴったりされており、合字は、神経に沿ってスライドしなくなるまで締めます。その適切な位置にループを保持するために、結び目を完了する最初の上に2番目のループを配置します。最後に、約1ミリメートルの字の緩い端をカット。神経の収縮は最小限である、と簡単な筋が観察された場合には直ちに停止し、thの逮捕を防ぐため必要があります電子神経鞘の血流。字を締めすぎると軸索切断につながり、成功した疼痛過敏テストを排除する自切（自傷）は、両方の不要な副作用。
皮膚を固定する筋層とステープル（Autoclip、9 mm）を閉じるために縫合糸（Mersilk 5.0、エチコン）を使用します。次に、傷口を滅菌するためにヨウ素溶液（Riodine）を使用します。
窒息無意識の動物を防ぐために、麻酔の回復期間中に密接にラットを観察し、それは平らな紙の寝具（ない標準的な畜産ベッド）を持つ別のケージに回復することができます。
すべての術後鎮痛の捜査を与える前に、これは疼痛過敏テストを妨げる可能性があるという事実を考慮する必要があります。実際には、負傷時の麻酔薬、リドカイン、ローカルのアプリケーションは、神経因性疼痛の開発を変更し、前の週⁷の痛覚過敏の程度を減少させることができるという証拠がある。このmのさらなる議論のためにBennett ら ⁸でレビューをアッター湖。

2。痛みの挙動の測定

実験を開始する前に、数日間のラットの毎日の処理は、そのハンドラにラットを慣らすストレスやかむのリスクを軽減するために推奨されます。
行動試験の前に、ラットは、試験手順や動物のエンクロージャに慣らさする必要があります。テスト環境は、一定の温度と湿度、静かでよく制御され保持され、各テストセッション日の同様の時間で実施する必要があります。
疼痛過敏テストは必要に応じて、CCI（ベースライン）の前と後のCCIの異なる時点で複数回実行する必要があります。

3。機械逃避閾値

テストの日に、場所ラット上昇メッシュ床試験ケージに撤退のしきい値を測定する前に、15〜30分、ケージの探査とgrooを許可する明は、活動を中止し、ラットはリラックスして静止になること。
動的足底·フォン·フレイ角膜知覚計（ウーゴ·バジーレ、イタリア）を使用して、金属メッシュを避けて、後足の半ばに底表面直下にフィラメントとタッチ刺激ユニットを配置し、スタートキーを押します。これは機械的に増加させる力と後足の足底表面を刺激するフィラメントを持ち上げる。

マニュアル·フォン·フレイ毛は、皮膚に適用されたときに特定の力を誘発するために校正されて拡径フィラメントのシリーズです。それらは前述のように足引っ込め閾値を測定するための電子ダイナミック足·フォン·フレイの角膜知覚計^、4の代替として使用することができます。エレクトロニック·フォン·フレイaesthesiometers（例えばIITC、アメリカ、Somedic、スウェーデン）のいくつかの代替メーカーもあります。

負傷したと無傷の両方hindpaから機械的な撤退のしきい値を記録フォークリフト、順番にWS、。このデバイスは、足に圧力を適用し、撤退の反応時にシステムが自動的に記録し、（グラム）を適用し最大の力を表示します。あいまいな応答（歩行やグルーミングの場合はIE）が発生した場合、刺激を繰り返してしきい値を記録します。ブーツまたは後足に続く刺激の揺れは、痛みに関連付けられた動作の兆候です。
刺激の間に約5分の間隔で機械的な刺激を3回繰り返して、しきい値を記録し、足撤退のしきい値の平均値を計算します。

4。熱の撤退の待ち時間

足底のテスト機器の赤外線（IR）の熱強度が実験を開始する前に調整する必要があります。私たちの研究室では、ナイーブなラットでは約10秒間の平均足撤退の待ち時間を与えるために、IRの強度を調整し、我々は組織のダムを避けるために、20秒でカットオフ遅延時間を設定する足の削除に失敗した場合の年齢。

テストの日に、場所の15〜30分の待ち時間を測定する前に、ガラス床のテストケージにラットでは、ケージの探査を可能にし、停止するための活動をグルーミングし、ラットはリラックスして静止になっています。
熱足鎮痛装置（ウーゴ·バジーレ、イタリア）を使用して、直接、後足の半ばに底表面の下に赤外線源を配置し、スタートキーを押します。これは透明なガラス表面からの放射熱のビームに後足の足底表面を公開しています。熱足鎮痛機器（例えばIITC、アメリカ、Stoelting、アメリカ）の代替メーカーもあります。
フォークリフト、の順序で、負傷したと無傷の両方の後肢からの撤退の待ち時間を記録します。このデバイスは自動的に熱源から足の撤退への熱刺激の発症から（秒単位）にかかった時間を記録します。あいまいな応答が発生した場合（ambulaの場合、すなわちる、またはグルーミング）、刺激を繰り返して待ち時間を記録します。ブーツまたは後足に続く刺激の揺れは、痛みに関連付けられた動作の兆候です。
熱刺激の刺激の間に約5分の間隔で少なくとも3回繰り返し、レイテンシを記録し、足撤退の待ち時間の平均値を計算します。

4。代表的な結果

Wistarラットの同側（負傷）と対（無傷の）足の機械逃避閾値と熱回収の遅延の例は、 図3A、図3Bに示すように前（ベースライン）および2-12日CCIした後に発生します。これらの図から、それはCCIは、機械的および熱的疼痛過敏症の存在を示す、機械的な撤退のしきい値と同側の後足の熱離脱レイテンシの両方で有意な減少を引き起こしていることが分かる慢性神経因性疼痛の両方の機能。

図1。CCIモデルの字の位置を示す概略図。神経因性疼痛のこの動物モデルは半ば腿レベルでの坐骨神経の4つの緩いクロム腸の字の配置が含まれます。これは、後足の足とその後の疼痛過敏に行く求心性の一部のみを負傷し、その結果。

図2痛みのテストに使用後足エリアの図。ように赤い点線の円で示された足蹠にちょうど後部半ばに底表面は、痛みのテストに使用されています。この領域は、坐骨神経の末端の枝で主に支配されています。かかとと足蹠は、差動皮膚の感度のために避けるべきである。

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ラットの坐骨神経の慢性収縮以下の図3。疼痛過敏。無傷の（反対）後足（P <0.01反復測定2に比べて（B）負傷した（同側）後足の熱刺激に対するCCI後、足引っ込め閾値の有意な減少は、機械的な刺激（）と足撤退の待ち時間にあります一方向ANOVA）。データは平均±SEM、n = 7のWistarラットを示しています。

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Discussion

CCIは、慢性神経因性疼痛の広く使われている末梢神経損傷モデルです。それは、実行するのは比較的簡単であり、受傷後少なくとも1ヶ月堅牢で安定した疼痛過敏を生成します。 CCIに続いて、ラット（つま先が一緒に開催し、足底、屈曲と足がeverted）負傷した後足の異常な姿勢を示し、同様に、振とう保護したり、自発痛⁹の存在を示唆して負傷した後足をなめることを繰り返す。感覚障害に加えて、いくつかの研究者はCCIがそのような中断社会的相互作用、睡眠障害、うつのようなと行動^10月13日不安などの行動障害を連想させることが示されているが、これはそのような行動の障害を見つけるために失敗とは対照的である他人^14,15によって。 CCIは、したがって、一般的に神経因性疼痛の治療のための病態生理学、および潜在的な治療薬の両方を調査するために使用されています。

我々DESCR左坐骨神経の一方的な収縮をIBE、しかし、それは多くの実験者が同じような痛みと行動の結果で、右側の坐骨神経のCCIを実行したことに留意すべきである。一部の研究者はそれが簡単に利き手のために特定の側面に手術を行うに見つけることができ、しながら他の人は、任意のバイアスを排除するための実験の中で両側を切り替えている。それは神経^16,17の周りには2合字を使用して、プレーンガットとポリグラクチン（vicryl）ラットの^18,19としてクロム腸以外の縫合材料の使用を含め、元のプロシージャには、いくつかのバリエーションが報告されていることは注目に値する。さらに、CCIモデルも手順はクロムガット、ナイロン、プロレン^15,20,21を含む様々な縫合材料と2から3合字の使用を除き、同一である場合、マウスで使用するために変更されました。

このモデルのいずれかの制限がvariabiliによるCCIを受けたラットの間でばらつきの程度であり、縫合糸で結び目を結ぶことによって生成された狭窄の気密性のTY。これは部分的に一貫した方法で手術を行う経験豊かな研究者を持つことによって克服することができます。さらに、神経を結紮するために使用される縫合糸材料の種類にもばらつきに貢献することができ、それはクロム腸からの化学物質がこのモデル^19,22で観察された行動や神経の影響の一部を仲介すると考えられている。特別な配慮は、ラットの性別（男性対女性^）23歳（若い対歳^）24,25、ダイエット^26日と大幅にCCI次の疼痛過敏の開発に影響を与えることができる株の^27日の選択に与えられるべきである。

エレクトロニック·フォン·フレイ角膜知覚計または機械的な撤退のしきい値および熱回収の遅延のために足底の鎮痛（ハーグリーブス）メータのマニュアル·フォン·フレイ毛を使用して、疼痛過敏テストは、十分に確立され、再されている小動物の疼痛過敏症の責任を定量的に測定します。その使用は、神経因性疼痛のモデルとの組み合わせで、普及していると別の治療法の選択肢間で、ラットの異なる株の間の機械的および熱刺激に対する足感度の直接比較を可能にします。このようなピンプリックテストと冷たいアロディニアなどの他の行動のアッセイは、また、CCI誘発疼痛過敏症^8をテストするために使用されていることに留意すべきである。

機械的または熱刺激から反射的撤退の使用はこのモデルと他の神経因性疼痛の主要な指標であるが、それは最近、ヒトの症状とかなりの実験者のバイアス²⁸の関与との低い相関のために批判されてきた。したがって、このような痛み²⁹オペラント対策と自発的に放出挙動³⁰追加のパラダイムの使用が有益であろう。

それにもかかわらず、DESこれらの制限をピーテ、疼痛過敏を測定するためのCCIモデルと足撤退のテストでは、神経因性疼痛のメカニズムを理解し、新しい鎮痛薬のターゲットを識別するための極めて重要です。当研究室では、我々は日常的にCCIを実行し、どのように神経免疫相互作用を理解するために、機械的な足撤退のしきい値と熱足撤退の待ち時間を測定する神経因性疼痛³¹に貢献し、疼痛過敏を軽減する変調免疫システムの可能性を評価します。

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Disclosures

動物実験は、ニューサウスウェールズ州、オーストラリアの大学の動物のケアと倫理委員会によって承認され、痛みの研究のための国際協会によって発行されたガイドラインに従った。

Acknowledgments

著者らは、ベネットと謝（1988）によってCCIモデルの元の説明を確認したいと思います。

この作品は、GMTに科学と医学研究のための国民健康、オーストラリアの医学研究評議会（ID＃568637）とNSW事務局からの補助金によって部分的にサポートされていました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic gut	Ethicon Inc.	G-211	4-0 thickness
Isoflurane	Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW	n/a
Mersilk	Ethicon Inc.	W-580	5-0 thickness
Autoclip	BD Biosciences	427631	9 mm stainless steel
Riodine	Orion	R1000802F	1% w/v iodine
Thermal plantar analgesia instrument	Ugo Basile	37370
Dynamic plantar aesthesiometer	Ugo Basile	37400