Summary
תיאור אינדוקציה הניתוח של אנדומטריוזיס בעכברים וחולדות על ידי השתלת אוטומטית של רקמת הרחם אל מפל העורקים של mesentery המעי.
Abstract
אנדומטריוזיס היא מחלה כרונית, כואב שאת האטיולוגיה נותר עלום. יתר על כן, טיפול של אנדומטריוזיס יכולים לדרוש הסרת לפרוסקופי של נגעים, ו / או הנהלת תרופות כרונית של כאבים ותסמינים פוריות. העלות הקשורים אנדומטריוזיס הוערך ב 22 מיליארד דולר בשנה בארצות הברית 1. כדי להמשיך את הבנתנו את המנגנונים המחלה המסתורית, במודלים של בעלי חיים היו מועסקים. יונקים באופן ספונטני אנדומטריוזיס לפתח מודלים הפרימטים ולכן רוב דומים המחלה אצל נשים. מודלים מכרסמים, לעומת זאת, הן בעלות יותר יעיל וזמין 2. המודל המתואר כאן כרוך העברת עצמיים של רקמת הרחם לפדר המעי (איור 1) ו - פותחה לראשונה בשנת החולדה 3 והועבר מאוחר יותר אל העכבר 4. מטרת המודל מכרסם עצמיים של אנדומטריוזיס בניתוח המושרה הוא לחקותהמחלה אצל נשים. אנו ואחרים הראו בעבר כי שינו את דפוס ביטוי הגנים שנצפה נגעים endometriotic מ עכברים או חולדות מראות כי נצפו בנשים עם מחלה 5,6. אחד היתרונות של ביצוע ניתוח העכבר הוא כי שפע של זנים עכבר מהונדס זמין יכול לסייע לחוקרים לקבוע את התפקיד של רכיבים ספציפיים חשוב בהקמת וצמיחה של אנדומטריוזיס. מודל חלופי שבו נכרת שברי רירית הרחם אדם פוגש הצפק של עכברים immunocompromised הוא גם בשימוש נרחב, אך הוא מוגבל על ידי חוסר של מערכת חיסונית תקינה אשר נחשב חשוב אנדומטריוזיס 2,7. חשוב לציין כי במודל עכבר של אנדומטריוזיס בניתוח המושרה הוא מודל צדדי, שבו נעשה שימוש כדי ללמוד איך המערכת החיסונית 8, הורמונים 9,10 11,12 וגורמים סביבתיים משפיעים על אנדומטריוזיס, כמו גם את ההשפעות של אנדומטריוזיס על Fertלאח 13 וכאב 14.
Protocol
1. תכנון ניתוח ביצורים חיים
- ודא כי האישור המתאים התקבל לעבוד עם חיות מעבדה.
- עכברים סדר ולאפשר לפחות שבוע של הסתגלות לסביבה החדשה שלהם.
- עכברים נקבה שוכנו בהעדר חשיפה פרומונים זכר יכול לעצור אופניים, תופעה המכונה אפקט ויטן 15,16. כדי לשמור על עכברים להעביר אופניים הספוג בשתן מצעים הזכר לכלוב הנקבה כל חמישה ימים. לחילופין, אם לפתוח כלובים העליונה משמשים, המקום בכלוב הנקבה בין שני כלובים של גברים לשמור על הנקבות רכיבה על אופניים באופן קבוע.
- ודא כי עכברים הם רכיבה על אופניים על ידי ניתוח ציטולוגיה הנרתיק ביום למשך שבוע אחד לפחות לפני הניתוח (טבלה 1) 17.
- השתמש עיפרון שעווה כדי ליצור מחיצות eight בשקופית זכוכית כך מריחות הנרתיק מעכברים מרובות ניתן לאסוף.
- רוקן את הנרתיק עם תמיסת מלח או 0.2-0.25 נורמלי מ"ל מים מזוקקים באמצעות הטפטפת. הייה sיור למקום הטפטפת רק על פתח הנרתיק, כמו גירוי צוואר הרחם עם טפטפת עלול לגרום pseudopregnancy. מניחים את שטיפה וגינלית בשקופית זכוכית עבור ניתוח של סוגי תאים. שקופיות ניתן לקרוא טריים (רטוב), או לחילופין קבועה על ידי מספר שיטות לבחון באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל 17.
- אסוף, נקי לעקר את כל הציוד הדרוש לניתוח כירורגי aseptic מוצלח (ראה סעיף חומר) 18.
- הכן פתרון עצירות עבור שיכוך כאבים ב PBS באמצעות טכניקה סטרילית כדי לספק 0.2 מ"ג / ק"ג המינון הסופי. ריכוז של הפתרון צריך להיות עצירות 0.0333 מ"ג / מ"ל בהנחה C57BL המבוגר הממוצע / 6 העכבר שוקל כ 0.025 ק"ג נפח הזרקה תת עורית של 0.15 מ"ל לכל עכבר. עצירות ניתן להכין מראש ולאחסן כמו aliquots. שים לב, עצירות הוא חומר III בתוספת מבוקר המחייב רישיון ה-DEA והיכנס המלאי מפורט.
- הכן PBS סטרילי עם פניצילין (100 U / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל).
- סנכרון מחזורי ייחום על ידי העברת ספוג שתן מצעים זכר כלובי נקבה 72 שעות לפני הגיוס 15.
2. הכן את השטח כירורגית לניתוח החיה לחיות
- הכינו את אזור הניתוח כפי שתואר לעיל 18.
- הכן את השטח כהכנה ידי הגדרת החוצה קוצץ חשמלי, משחה עיניים, ורופאים מנתחים.
- הכינו את אזור הניתוח על ידי הנחת כרית הסירקולציה המחודשת חם לחימום מים על האזור כירורגית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח. הניחו כרית עמיד למים סטרילי על הסירקולציה המחודשת כרית חימום מים חמים. סידור מכשירי ניתוח, תפר, פטרי צלחת זכוכית סטרילית, ביופסיה, גזה סטרילית, קליפים הפצע קליפ פצע המוליך על המגרש כירורגי סטרילי.
- הכן באזור התאוששות ידי הצבת הסירקולציה המחודשת חם כריות חימום מים באמצע undאה כלוב ריק כדי לאפשר עכברים להתרחק מהחום אם תרצה כך.
3. הרדימי ולהכין את העכבר לניתוח
- הקלט את משקל העכבר, לקבוע בשלב ייחום על ידי הערכת ציטולוגיה הנרתיק.
- עבור אינדוקציה של הרדמה, במקום את העכבר בתא ריק הרדמה (כלוב ריק עם מכסה מוצק המכיל פורטל isoflurane). הפעל את מערכת isoflurane הרדמה שאינם rebreathing ולהגדיר את מאדה 4% isoflurane (עם קצב זרימת החמצן ל 0.5-1 / min).
- כאשר סמן העכבר נמצא תחת הרדמה לעבור את זרימת isoflurane אל חרוט (30-60 מזרק נדן מ"ל) ואת האף של העכבר במקום הפה חרוט על השולחן בהכנה. הרדמה הולם יכול להישמר עם ריכוז נמוך יותר של isoflurane בכל שאר הניתוח (~ 2.5-3.5% isoflurane). עומק נאותה של הרדמה צריך להיקבע על ידי תגובה שלילית לגירוי קמצוץ הבוהן.
- החל משחה לא עינייםo למנוע התייבשות של העיניים במהלך הניתוח.
- בעזרת קוצץ חשמלי קטן, לגלח את אתר הניתוח.
- לחטא ולהכין את אתר הניתוח עם שלושה swipes לסירוגין שיחים chlorhexidine ואתנול 70%.
- הנח חיה עם שדה סטרילי.
4. קשירת הרחם
- לעשות חתך קטן (~ 1 ס"מ) קו האמצע או באמצעות מספריים קטנים או להב סכין המנתחים סיום 0.5-1.0 ס"מ מקורי אל פתח הנרתיק.
- הכנס מספריים סגורות לתוך פתח כזה הלהבים הם בין הקיר הגוף דופן הבטן. בעדינות בוטה לנתח את האזור סביב החתך על ידי פתיחה וסגירה לאט את המספריים כך את דופן הבטן מנותק מספיק מן העור. הידבקויות נותרים גלויים בין הקיר עור הבטן סביב האתר החתך יכול להיות וגזרתי בזהירות. אי כראוי בוטה לנתח את האתר חתך יגרום סגירת דופן הבטן קשה יותר.
- שימוש ו קטןorceps, בעדינות לאתר את קרן הרחם השמאלית. הרחם הוא הגבי למעי, וזה מה שתראה על נכנסים לראשונה באתר החתך. במקרים מסוימים היא הקלה ביותר תחילה לאתר את השחלה ואת השומן הקשורים כרית השחלות. משוך בעדינות על קרן הרחם והחלק מלקחיים לפתוח מתחתיו לשמש מפשק. אם תרצה, תוכל לציין את המראה של השחלות והרחם בשלב זה לקבל מידע נוסף לגבי השלב ייחום ב אינדוקציה (טבלה 1).
- החלק בעדינות two 6-8 חתיכות ס"מ תפר 5-0 קלוע משי שחור (בלי מחט) מתחת צופר הרחם נמתח.
- מאובטח ולקשור קרן בצומת ברחם-tubual (הזנב רק כדי החצוצרות) ו בצומת ברחם, בצוואר הרחם (מקורי רק צוואר הרחם) באמצעות קשר מרובע במיקום זה. השאירו את הקצוות של תפר לרגע.
- חותכים את החלק של קרן הרחם בין שתי ligations והמקום רקמות סטרילית זכוכית צלחת פטרי containing ~ 100 μL של PBS המכיל פניצילין (100 U / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל). חותכים את הקצוות של תפר המשי שעברה. אם תפר מגיע רופף או יש דימום, למצוא את הגדם ולקשור קשר אחר.
5. הכן שתלים endometriotic מהרחם נכרת
- בעוד הרחם נכרת מתבצעת מניפולציה, לכסות את הבטן עם גזה סטרילית ולשמור על לחות עם סטרילית PBS המכיל פניצילין וסטרפטומיצין כנדרש.
- רצועת קרן הרחם נכרת של שומן.
- אם תרצה, לשקול את קרן הרחם נכרת.
- פתח את קרן הרחם על ידי החדרת להב אחד של מספריים קטנים (אורך להב 14 מ"מ) לתוך לומן מחליק בעדינות את המספריים כלפי מטה קרן הרחם בעת החזקת קרן עם מלקחיים.
- בצלחת זכוכית פטרי, להשתמש 2 מ"מ ביופסיה לגזור על שלושה שתלים בגודל שווה.
6. תפירת שתלים endometriotic בתוך חלל הצפק
- המקום sterilדואר גזה מיד מעל האתר חתך ורטוב היטב סטרילי PBS המכיל פניצילין וסטרפטומיצין.
- עם קטן, מלקחיים חלקה בעדינות למצוא את cecum ולעבור rostrally לאורך המעי הדק. משוך קטע קטן (4-5 ס"מ) של המעי שהוא לפחות שני עורקים ממנו cecum ולסדר אותו כמו מניפה על גזה מראש הרטובות, כך מפל של עורקי mesentery המעי נראה בבירור. הקפד לשמור על לחות המעי בכל עת עם תמיסת מלח סטרילית. הערה: אין להשתמש עכברוש שיניים מלקחיים בזמן הטיפול המעי.
- השתמש 6-0 תפר ethilon שחור עם P-1 מ"מ 11, 3 / 8 עיגול, הפוך מחט חיתוך בעדינות כדי תפר one השתל לעורק כ 0.5 ס"מ מהמעי.
- הערה: mesentery המעי מכוסה על ידי שכבה דקה של הצפק. תיזהר לעשות לעבור דרך שכבת נקי זאת תוך תפירת סביב העורק. משוך תפר באמצעות לאט ובזהירות שלא לקרוע את הצפק או קרעאת העורק.
- השלם שני קשרים של אחד לזרוק כל, נזהרים לא להדק את תפר מאוד קשה, מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן של זרימת הדם בעקבות נמק של המעי ומוות. חתוך את תפר בתוך 2 מ"מ של השתל. מעי רטוב שוב להמשיך לשמור על הידרציה לפני שעבר השתל הבא.
- העברת בכיוון מקורי, לשלוף את 3-4 ס"מ של המעי הבא בעדינות להחליף את סעיף שכבר מכיל השתל. דילוג על אחד או שניים העורקים מהאתר השתל הקודם תפר את השתל הבא. חזור על הפעולה עבור השתל השלישי.
- החלף את כל המעי בחלל הבטן.
7. שאם הניתוחים
- ניתוחים שאם מבוצעים באמצעות השלבים זהה ניתוחים אנדומטריוזיס אלא שאף הוא רקמה sutured לפדר מעיים.
- קרן והבלו הרחם נשאר כמו בשלב 4.
- שתלים Endometriotic (שלב 5) לא ערוכים הניתוח מזויף.קרן הרחם נכרת יכול להיות מושלך או לשמש למטרות אחרות אם רוצים.
- Sutures, אך לא ברקמות, ממוקמות סביב שלושה צירי במפל העורקים mesentery של המעי כמו בשלב 6.
8. סגירת פצע כירורגי
- ודא שכל האיברים חוזרים כ למיקום האנטומי שלהם.
- השתמש 5-0 תפר vicryl מצופה תפר שאינם שלובים רציף לסגור את דופן הבטן.
- השתמש 9 הפצע קליפים מ"מ כדי לסגור את העור.
9. שחזור חיים
- ניהול 0.33 מ"ג / מ"ל עצירות על העכבר 0.15 גרם ml/25 באמצעות הזרקה תת עורית במינון של 0.2 מ"ג / ק"ג. עצירות ניתנת שלאחר הניתוח, כדי למנוע עוד דיכאון לב וכלי דם / נשימה שיכולים להאריך את תהליך ההחלמה.
- יבש בעדינות את העכבר עם kimwipes או מגבות נייר אם זה נעשה רטוב במהלך הניתוח.
- חיה מקום בצד הגחון למטה בכלוב partially על גבי משטח הסירקולציה המחודשת מים מחוממים עד החי הוא התאושש והוא חזר שעינת חזה (בתוך חמש דקות כמו נשימתית ההרדמה פגה במהירות).
10. הטיפול שלאחר הניתוח
- עכברים צריך לשמור כל 15 דקות עד שהם מסוגלים לשמור על שעינת חזה, שעה לאחר מכן עד שהם להחזיר התנהגות נורמלית שלהם לאחר הניתוח.
- עכברים נורמליים אמור להופיע תוך 24 שעות של ניתוח. עכברים יש לעקוב מדי יום במשך שבעה עד עשרה ימים על סימני התאוששות ובריאות טובה.
- אינדיקציות כי היא חיה בבריאות כאב עניים, או מצוקה כוללים ירידה בפעילות, פגיעה עצמית, מראה ungroomed, או יציבה כפופה.
- אם בעל חיים לא נראה במצב בריאותי טוב תוך 24 שעות של ניתוח, או לנהל עצירות (0.2 מ"ג / ק"ג) או להרדימו. אם החיה אינה משפרת בתוך 8 שעות של עצירות משלים הממשל שמוט בעלי חייםד להיות מורדמים כמו נמק המעי סביר.
- הסרת קליפים פצע 7-10 ימים לאחר הגיוס.
- המשך לעקוב אחר מחזוריות ייחום על ידי בדיקת ציטולוגיה הנרתיק למשך הניסוי. סנכרון מחזורי ייחום 72 שעות לפני איסוף שתן על ידי העברת ספוג מצעים זכר נקבה כלובי כמתואר בשלב 1.3.
11. Necropsy ו כריתה רקמה
- העיתוי של necropsy תלויה שאלת המחקר בפרט נדון נוסף בתוצאות נציג לדיון.
- להרדים את העכבר על ידי מחנק פחמן דו חמצני.
- איסוף דם על ידי הלב לנקב באמצעות מחט מד 23 על מזרק 1cc (אם רוצים).
- איסוף כתם ציטולוגיה הנרתיק כפי שתואר לעיל כדי לקבוע בשלב ייחום בזמן של אוסף 17.
- גזור קרן הרחם הנותרים בצומת ברחם, חצוצרות ועל צוואר הרחם, להסיר שומן, משקל, תהליך כמוהרצוי (ראה 11.14 ו - 11.15).
- אתר את התפרים שחור סביב נגעים endometriotic. שלם צילום נגעים endometriotic אם תרצה בכך.
- בזהירות לנתח את הידבקויות סביב נגעים endometriotic עם מספריים מלקחיים קטנים, נזהרים שלא רומח נגעים. עבודה במהירות ובזהירות כדי למנוע השפלה RNA.
- מדוד ורשום את אורך ורוחב של נגעים endometriotic באמצעות מחוגה.
- והבלו נגעים endometriotic ומניחים על מגבת נייר טבולה PBS. הסר את כל הרקמה הלא endometriotic מן הנגעים. מנתחים במיקרוסקופ או זכוכית מגדלת עומדים יכול לשמש כדי לסייע לנתיחה.
- לשקול את שלושת מלא נוזל נגעים endometriotic לפני הסרת תפר.
- בעדינות להסיר את תפר מן הנגעים endometriotic.
- עבור היסטולוגיה, לתקן פורמלין זורמת אחת מלא הנגע endometriotic שעתיים ואחריה שלוש וחצי דקות שוטף PBS ואחסון הסופי in 70% אתנול. מייבשים ונפט להטביע.
- לאנס שני נגעים endometriotic. אלה לשקול שוב. מאז שינויים הורמונליים מחזורית יכול לשנות את כמות הנוזלים ציסטה, זה נותן מידה של משקל רטוב רקמת בנוסף משקל ציסטה בתוספת נוזל, כפי שהיא נמדדת ב 11.10.
- עבור בידוד RNA ו ביטוי במחקרים הגן, מיד homogenize אחד נגעים endometriotic פילח (או ~ רקמת הרחם 20 מיקרוגרם) בתמיסה תמוגה חנות מחייב ב -80 ° C עבור בידוד RNA בעתיד עם ערכת RNAqueous (Ambion) או כל שיטה אחרת כמו הרצוי.
- עבור בידוד העתיד של RNA, DNA, או חלבון, מיד Snap-להקפיא את הנגע second endometriotic פילח (או ~ 20 מיקרוגרם רקמת הרחם) בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C.
נציג תוצאות
נגעים Endometriotic במודל עכבר של אנדומטריוזיס המושרה בניתוח מורפולוגית ו בהיסטולוגיה דומות לאלו שנצפונשים. ניתוח היסטולוגית של אנדומטריוזיס הן נשים המודל העכבר עולה כי נגעים endometriotic מכילים בלוטות רירית הרחם stroma (איור 2A). נגעים Endometriotic בעכברים מכילים גם hemosiderin עמוס מקרופאגים, המהווים סימן היכר משותף של אנדומטריוזיס בנשים (תרשים 2B) 19.
הנגעים הוסרו Endometriotic מעכברים שלושה ימים לאחר אינדוקציה להופיע דלקתי מדמם (איור 3A). לאחר שבועיים עד ארבעה שבועות של נגעים צמיחה endometriotic במודל עכבר הן ציסטה דמוי נוזל מלא ומוקף הידבקויות הצפק (איורים 3 ב ו - 3C). לעומת משקל הנגע בבית אינדוקציה, נגעים מלא נוזל היו 306% ו 862% יותר בשעה אחת וחודשיים לאחר אינדוקציה נגעים פילח היו 51% ו 172% יותר, בהתאמה (איורים 4 א ו - 4B). השגנו נוזל עקבי מלא ו פילח משקולות הנגע endometriotic באחת חודשים לאחר הגיוס במשך חמישה ניסויים שונים (איור 5). באותו חודש שלאחר בנוזל duction מלא (7.44 ± 3.75 מ"ג) פילח (2.92 ± 1.23 מ"ג) משקל הנגע endometriotic היו בקורלציה משמעותית (מקדם המתאם של פירסון = 0.669, p <0.001).
גיל של העכבר לא השפיע על גודל הנגע לעכברים בין שלוש עשרה חודשים של גיל. אף נוזל או מלא פילח משקל הנגע endometriotic על חודש אחד לאחר אינדוקציה היה בקורלציה משמעותית עם הגיל של החיה (r = -0.136, p = 0.380 ו r = -0.063, p = 0.698, בהתאמה).
הרחם העכבר עובר שינויים בגודל, אגירת נוזלים, התפשטות תאים והמראה בשל השפעתם של הורמונים סטרואידים במהלך מחזור ייחום. השווינו את המשקל הנגע endometriotic משקל של קרן הנותרים הרחם שלמים מבעלי חיים בשלבי ייחום שונים. לא מצאנו קשר מובהק בין משקל נוזל הרחם מלאים או l endometriotic פילחesion משקל אינדוקציה ואחת לחודש שלאחר (r = -0.046, p = 0.765 ו r = 0.232, p = 0.155, בהתאמה).
ביטוי גנים דפוס שנצפתה נגעים endometriotic של עכברים מקרוב מראות כי דיווחו נשים עם המחלה 5. עד שלושה ימים לאחר אינדוקציה ויסות הגנים שיפוץ תאי מטריקס, הידבקות התא אנגיוגנזה הם שהוגברו מאוד רבים של הגנים האלה יישארו שהוגברו דרך חודש של צמיחה.
איורים וטבלאות
באיור 1. אינדוקציה כירורגי של אנדומטריוזיס על ידי העברת autologus רקמת הרחם בתוך העכבר. קרן הרחם השמאלית ligated, נכרת, ופתח longitudinally לחשוף את רירית הרחם. שלוש 2 מ"מ 2 ביופסיות מוכנים וכל אחד מהם sutured אל עורק במפל העורקים של mesente המעיר"י. עד חודש אחד לאחר הזירוז נגעים endometriotic הם נוזל מלא ומוקף הידבקויות.
איור 2 Hematoxylin ו eosin סעיף מוכתם של הנגע רירית הרחם ממודל העכבר של אנדומטריוזיס על חודש שלאחר הוכחת אינדוקציה (א) את נוכחותם של בלוטות רירית הרחם stroma;. בהיקף בר = 50 מיקרומטר ו (ב) hemosiderin עמוס מקרופאגים, חלקם מסומנים על ידי חצים; בר בקנה מידה = 20 מיקרומטר.
באיור 3. נגעים Endometriotic במודל עכבר הבאים המתת חסד, או שלושה ימים לאחר אינדוקציה (א) או אחד בחודש שלאחר אינדוקציה (B ו-C).
איור 4. נגעים Endometriotic מעכברים המושרה בניתוח יש endometriosis הוסתרו ומשקלו בבית אחד או שניים חודשים לאחר הגיוס. הנתונים הם ממוצע ± SEM. הנתונים היו יומן הפך ומכתבים שונים מצביעים על משמעות בתוך כל לוח ידי ANOVA חד כיווני ואחריו הפחות משמעותי חד צדדי של פישר השוואות Mulitple הפרש. (א) כמו ציסטה, נוזל נגעים endometriotic מלא (N = 10, 7 או 5 לזירוז, חודש אחד, או שניים בחודש שלאחר אינדוקציה, בהתאמה). (ב) נגעים endometriotic פילח (N = 10, 8 או 7 לזירוז, חודש או חודשיים לאחר הגיוס בהתאמה).
איור 5. Endometriotic משקל רטוב הנגע עם נוזלים פילח על חודש אחד לאחר גיוס של חמישה ניסויים נפרדים. הנתונים הם ממוצע ± SEM. עכברים N = 10, 6, 8, 7 ו - 7 עבור נגעים מלא נוזלים 0, 7, 10, 8, ו - 8 עבור נגעים פילח ב 1 בניסוי, 2, 3, 4, ו 5, בהתאמה.
טבלה 1. תצפית של שלב ייחום על ידי ציטולוגיה וגינלי המראה החזותי של השחלות והרחם וכן אינדוקציה.
מראה של השחלה והרחם יהיה תלוי זמן. להלן מבוסס על הקרבה סביב 8:00 בבוקר כל יום מחזור. יתר על כן, התצפיות הן סובייקטיביות ומשווה את השחלה וקרניים הרחם יהיה להעריך טוב יותר קרניים הרחם בלבד. תצפיות אלו נועדו להשלים את המידע המתקבל יומי קריאות ציטולוגיה הנרתיק.
טבלה 2. השוואה בין ניתוח עכבר וחולדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר פרמטרים קריטיים כי יש לציין בעת ביצוע הגיוס כירורגי של אנדומטריוזיס בעכברים. ראשית, אנדומטריוזיס היא מחלה תלוי אסטרוגן והן בניתוח זה כזה יש לבצע בבעלי חיים שלמים או לחילופין בבעלי חיים ovariectomized בתוספת אסטרוגנים 20. שנית, תפירת ביופסיות רירית הרחם אל מפל העורקים חייב להתבצע בזהירות רבה. מצאנו כי רק באמצעות שני קשרים רופפים יחסית זה עם זה לזרוק כל שומר על ביופסיה במקום תוך מניעת קשירת של אספקת הדם אל המעי ונמק ברקמות הבאות ומוות של בעלי חיים. אנו ממליצים להתאמן על עכברים אחדים לפני הניסוי בפועל על מנת להבטיח כי התפרים ממוקמים בצורה מאובטחת מספיק רקמת הוא לא איבד, אבל לא חזק מדי כדי לגרום נמק המעי. שלישית, חשוב מאוד לשמור על רקמת המעי hydrated עם סטרילית PBS המכיל פניצילין וסטרפטומיצין במהלך surgery. רביעית, יש לנקוט מאמצים על מנת להבטיח כי גודל השתל endometriotic עקבית. ברוח זו אנו משתמשים 2 מ"מ ביופסיה כדי ליצור שתלים בגודל endometriotic בעקביות מרקמת הרחם נכרת.
ישנם מספר שינויים שניתן לעשות בפרוטוקול זה כדי להתאים לצרכי הפרט שאלות מדעיות של החוקר. אחת השינוי מתייחס פוטנציאל לפרופיל הורמונלי של החיה. מערכת גנים וביטוי חלבונים נגעים endometriotic, שנותרו בקרן הרחם שלם החיסון עשוי להיות מושפע ישירות על ידי התזמון של איסוף ביחס לשלב מחזור ייחום. ישנן כמה גישות לשלוט לשלב ייחום בזמן איסוף, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלה. לדוגמה, תמים, חיות רכיבה ניתן לסנכרן ידי העברת ספוג שתן מצעים הזכר לכלוב הנקבה שלושה ימים לפני הגיוס או אוסף כזה שבעלי חיים הם בניתוח induCED ואסף בשלב ייחום אותו 15. אם חיות רכיבה שלם משמשים, מחזוריות הייחום יש לעקוב מדי יום על ידי בדיקה של הנרתיק ציטולוגיה 17. זו יש את היתרון של להיות יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, אבל סינכרוניות מחזור בהשגת לא 100% מוצלחים. לחילופין, בעלי חיים שלם יכול להיות מסונכרן על ידי אקסוגניים גונדוטרופין הממשל 21,22. בעוד קצת יותר מדויק, שיטה זו יוצרת רמות האסטרוגן גבוה מהרגיל. גישה נוספת הייתה ovariectomize חיות להחזיר על רמה קבועה של הורמונים אקסוגניים או באמצעות קפסולת silastic, מיני האוסמוטי משאבה או זריקות יומיות 4,8. שיטה זו יש את היתרון של קבלת פרופיל הורמונלי אחיד על פני בעלי חיים רבים, אך הוא נחות, כי החיות אינן רכיבה על אופניים.
ניתוחים שאם ניתן לבצע כדי להעריך את ההשפעות אשר הם תוצאה של העוברים את הניתוח לעומת תופעות attributable על אנדומטריוזיס. בשנת ניתוחים דמה קרן הרחם השמאלית להסיר תפרים ממוקמים סביב העורקים במפל העורקים mesentery של המעי, אך לא שתלים endometriotic הם sutured 5,8,23. לחילופין, להסיר שומן קרן הרחם נכרת ניתן sutured את mesentery מעיים 3,14. אנחנו דיווחה לאחרונה כי ישנם הבדלים מעטים יחסית ביטוי גנים, כפי שהיא נמדדת על ידי cDNA microarray בין הרחם דמה ואת קרן שלם הרחם הנותרים מחיות המושרה בניתוח יש אנדומטריוזיס 5. יתר על כן, באמצעות כמותי בזמן אמת PCR שבע אנדומטריוזיס גנים הקשורים, מצאנו כי הביטוי haptoglobin רק היה שונה באופן משמעותי uteri של זיוף ועכברים אנדומטריוזיס. Lee et al. עם זאת, דיווחו ביטוי ההפרש של חמישה גנים ברחם מעכברים המושרה יש אנדומטריוזיס בהשוואה לקבוצת הביקורת דמה 23. הדבר מצביע על נוכחות של lesio endometrioticns יכול לגרום ביטוי גנים שונה ברחם eutopic.
העיתוי של אוסף של עכברים גרמו בניתוח יש אנדומטריוזיס צריך להיקבע על ידי שאלת המחקר בפרט. אוסף של עכברים שלושה ימים לאחר הגיוס מאפשר להעריך את קריטי, אירועים בתחילת הקמתה של אנדומטריוזיס כולל נויטרופילים הראשוני חדירה machrophage ייצור ציטוקינים כפי שכבר דווח בעבר 8. הראינו כי נגעים endometriotic אספו שלושה ימים לאחר אינדוקציה הם קטנים, hemorraghic ו שינו באופן משמעותי את ביטוי הגנים ביחס קרן הרחם 4 הנותרים. עד שבועיים לאחר הגיוס נגעים endometriotic מבוססים היטב יצרו לעתים קרובות ציסטה מבנים דמויי. בשנת העכבר, נגעים endometriotic להמשיך להגדיל את שטחו, כפי שנבחנו על ידי משקל של נוזל מלא ו פילח נגעים (איור 4), וכן לפי נפח הנגע נקבע על ידי רוחב אורך, heigמדידות ht דרך חודשיים לאחר הגיוס 9.
כאמור, מודל הניתוח של אנדומטריוזיס פותחה לראשונה בשנת החולדה והיא עדיין בשימוש נרחב 3. בעת ביצוע ניתוח זה בחולדה אנחנו עושים את השינויים הבאים הפרוטוקול, לסכם בטבלה 2. בשנת החולדה, כל התפרים בהם נעשה שימוש הם בגודל 4-0 ואת יכולה וצריכה להיות קשור באופן הדוק יותר. בנוסף, אנו תפר six 5 מ"מ 2 שתלים endometriotic mesentery לתוך המעי של חלל הצפק.
בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של הרדמה נשאפים, isoflurane. לחילופין, זריקות הרדמה בשילוב מורכב קטמין ו Domitor (hydrochloride medetomidine) או אחר אלפא 2 אגוניסט יכול לשמש, אם כי זמן ההחלמה היא מעט יותר. קטמין, מנוהל על 75 מ"ג / ק"ג בהזרקה intraperiotneal, הוא סוכן הרדמה דיסוציאטיבית עם כאב אקוטי להקלה על נכסים מינימליnd היא תרופה השלישי בתוספת הדורשים רישיון ה-DEA ומלאי התרופות מפורט. Domitor, מנוהל על 1 מ"ג / ק"ג, הוא אגוניסט אלפא 2 adrenergic ו מתהפך בקלות עם הממשל (hydrochloride atipamezole) Antisedan. Domitor היא תרופת הרגעה המספק להרפיית שרירים להקלה על הכאב. Domitor ו קטמין יכול להיות מוכן מראש בשילוב של PBS באמצעות טכניקה סטרילית. Antisedan, הסוכן היפוך עבור Domitor, אפשר להכין PBS בשילוב עם עצירות ואת צריכה להינתן על 1 מ"ג / ק"ג שלאחר הניתוח. עצירות היא גם III בתוספת סמים חלופות כוללות את סטרואידיות נוגדות דלקות banamine (flunixin meglumine) ו ketoprofen.
כמו עם כל הדגמים יש מגבלות מסוימות הקשורות אינדוקציה הניתוח של אנדומטריוזיס במכרסמים. בראש ובראשונה הוא מכרסמים אין המחזור ולכן לא ספונטני לפתח אנדומטריוזיס. במאמץ להפוך את mod מכרסםיותר דומה מבחינה פיזיולוגית למצב בבני אדם כמה חוקרים העדיפו להזריק עצמיים או הומולוגיים שברי רקמת הרחם מחיות syngenic לתוך חלל הצפק ישירות ללא תפירת 24,25 אל. בעכברים, רקמת מוזרק צורות ציסטה כמו נגעים endometriotic, לעומת זאת, שיטת הזרקה של אינדוקציה לא נראה כמו עבודה בחולדות רקמה לא מצליח לצרף לפלוש בתוך חלל הבטן 3.
המודל מכרסם כבר נעשה שימוש נרחב לחקור את האטיולוגיה, הפתולוגיה, וגורמי סיכון של אנדומטריוזיס 2,8,26-29 וכן לחקור רומן הרפוי 14,30-34. המודל מכרסם של אנדומטריוזיס המושרה בניתוח מדגים קווי דמיון רבים למחלה בבני אדם, כולל פוריות פוריות מופחתת ואת הגן שינו וביטוי חלבון 5,6,35,36. יחדיו, עם עלויות נמוכות יחסית שלהם, זמינותם, את המודל של מכרסם בניתוח induאנדומטריוזיס CED הוא מודל מצוין אנדומטריוזיס בנשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
תודה מיוחדת כריס Kassotis ואודרי ביילי לבחינה ביקורתית של כתב היד הזה, ד"ר סקוט Korte, יוסף Beeman, אליסון Curfman, פול קימבל, ברידג'ט Neibreggue, יעקב Redel, איימי שרודר, Maija שטיינברג, וסטייסי Winkeler על עזרתם אופטימיזציה של מודל זה במעבדה שלנו. המימון ניתן על ידי Biodetectives הדרכה קלינית גרנט (NIH T90) (קפ), אוניברסיטת מיזורי מדעי החיים הזדמנויות תוכנית מחקר לתואר ראשון, MU מועצת המחקר, ועדת המחקר MU מענקים NIH R21HD056441 (SCN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax pencil | Fisher Scientific | NC9954135 | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-433 | |
| Eyedropper | Fisher Scientific | S79383 | |
| Standard light microscope for evaluating vaginal cytology smears | |||
| Buprenorphine HCL c3 (CARJET) 10X1ml | Butler Animal Health Supply | 022891 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14040-117 | |
| 10,000U/ml Penicillin, 10,000μg/ml Streptomycin in 0.85% NaCl | Hyclone | SV30010 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane non-rebreathing anesthetic system | |||
| Recirculating hot water heating pad | |||
| 30 ml syringe sheath | Fisher Scientific | 14-823-16G | |
| Powder free sterile gloves | Fisher Scientific | 19020558 | |
| Ophthalmic ointment | Major Pharmaceuticals | 10033691 | |
| Small electrical clippers | Wahl Clipper Corp. | 9861-600 | |
| Chlorhexidine scrub | Fisher Scientific | NC9863042 | |
| 70% Ethanol | |||
| Polylined sterile field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Size 3 scalpel | Fisher Scientific | 22-079-657 | |
| Number 10 scalpel blades | Fisher Scientific | 22-079-681 | |
| Small surgical scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5850 | |
| Small serrated semi-curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 5-0 black braided silk suture | Ethicon Inc. | K870H | |
| Sterilized pyrex glass Petri dishes | Corning | 70160-101 | |
| 2 mm biopsy punch | Miltex Inc. | 33-31 | |
| Sterile gauze | Kendall | 1806 | |
| 6-0 black monofilament ethilon nylon suture | Ethicon Inc. | 697G | |
| Needle drivers (optional) | World Precision Instruments, Inc. | 500023 | |
| 5-0 undyed braided coated vicryl suture | Ethicon Inc. | J490G | |
| 9mm Autoclip wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Autoclip applier & remover | BD Biosciences | 427630 | |
| 23G needle | BD Biosciences | 305193 | |
| 1cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 5X magnifying glass stand (optional) | Fisher Scientific | 14-648-23 | |
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Calipers | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6466 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 15-197-700A | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| RNAqueous RNA isolation kit | Ambion | AM1912 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Snap cap microcentrifuge flat top tube | Fisher Scientific | 02-681-240 | |
| Ketamine (optional) | Sigma-Aldrich | K4138 | |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) (optional) | Tocris Bioscience | 2023 | |
| Antisedan (atipamezole) (optional) | Sigma-Aldrich | A9611 |
References
- Simoens, S., Hummelshoj, L., D'Hooghe, T. Endometriosis: cost estimates and methodological perspective. Hum. Reprod. Update. 13, 395-404 (2007).
- Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Hum. Reprod. Update. 12, 641-649 (2006).
- Vernon, M. W., Wilson, E. A. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat. Fertil. Steril. 44, 684-694 (1985).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Induction of endometriosis in mice: a new model sensitive to estrogen. Reprod. Toxicol. 9, 233-238 (1995).
- Pelch, K. E. Aberrant gene expression profile in a mouse model of endometriosis mirrors that observed in women. Fertil. Steril. 93, 1615-1627 (2010).
- Flores, I. Molecular profiling of experimental endometriosis identified gene expression patterns in common with human disease. Fertil. Steril. 87, 1180-1199 (2007).
- Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364, 1789-1799 (2004).
- Lin, Y. J., Lai, L. ei, Y, H., Wing, L. Y. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 147, 1278-1286 (2006).
- Fang, Z. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil. Steril. 82, 673-678 (2004).
- Fang, Z. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 3460-3466 (2002).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L., Birnbaum, L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: time-dose dependence and species comparison. Toxicol. Appl. Pharmacol. 138, 131-139 (1996).
- Foster, W. G. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: application to toxicology. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75, 1188-1196 (1997).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effect of surgically induced endometriosis on pregnancy and effect of pregnancy and lactation on endometriosis in mice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 212, 332-337 (1996).
- Lu, Y., Nie, J., Liu, X., Zheng, Y., Guo, S. W. Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor, reduces lesion growth and hyperalgesia in experimentally induced endometriosis in mice. Hum. Reprod. 25, 1014-1025 (2010).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitten, W. K., Bronson, F. H., Greenstein, J. A. Estrus-inducing pheromone of male mice: transport by movement of air. Science. 161, 584-585 (1968).
- Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth. Defects. Res. B. Dev. Reprod. Toxicol. 80, 84-97 (2007).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586-e2586 (2011).
- Moen, M. H., Halvorsen, T. B. Histologic confirmation of endometriosis in different peritoneal lesions. Acta. Obstet. Gynecol. Scand. 71, 337-342 (1992).
- Cummings, A. M. Methoxychlor as a model for environmental estrogens. Crit. Rev. Toxicol. 27, 367-379 (1997).
- Fowler, R. E., Edwards, R. G. Induction of superovulation and pregnancy in mature mice by gonadotrophins. J. Endocrinol. 15, 374-384 (1957).
- Wilson, E. D., Zarrow, M. X. Comparison of superovulation in the immature mouse and rat. J. Reprod. Fertil. 3, 148-158 (1962).
- Lee, B., Du, H., Taylor, H. S. Experimental murine endometriosis induces DNA methylation and altered gene expression in eutopic endometrium. Biol. Reprod. 80, 79-85 (2009).
- Somigliana, E. Endometrial ability to implant in ectopic sites can be prevented by interleukin-12 in a murine model of endometriosis. Hum. Reprod. 14, 2944-2950 (1999).
- Hirata, T. Development of an experimental model of endometriosis using mice that ubiquitously express green fluorescent protein. Hum. Reprod. 20, 2092-2096 (2005).
- Story, L., Kennedy, S. Animal studies in endometriosis: a review. Ilar. J. 45, 132-138 (2004).
- Cummings, A. M., Hedge, J. M., Birnbaum, L. S. Effect of prenatal exposure to TCDD on the promotion of endometriotic lesion growth by TCDD in adult female rats and mice. Toxicol. Sci. 52, 45-49 (1999).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effects of estrogen, progesterone, and methoxychlor on surgically induced endometriosis in rats. Fundam. Appl. Toxicol. 27, 287-290 (1995).
- Sharpe-Timms, K. L. Endometriotic lesions synthesize and secrete a haptoglobin-like protein. Biol. Reprod. 58, 988-994 (1998).
- Yavuz, E., Oktem, M., Esinler, I., Toru, S. A., Zeyneloglu, H. B. Genistein causes regression of endometriotic implants in the rat model. Fertil. Steril. 88, 1129-1134 (2007).
- Dmitrieva, N. Endocannabinoid involvement in endometriosis. Pain. 151, 703-710 (2010).
- Efstathiou, J. A. Nonsteroidal antiinflammatory drugs differentially suppress endometriosis in a murine model. Fertil. Steril. 83, 171-181 (2005).
- Becker, C. M. Endostatin inhibits the growth of endometriotic lesions but does not affect fertility. Fertil. Steril. 84, Suppl 2. 1144-1155 (2005).
- Becker, C. M. Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and endometriosis in a mouse model. Fertil. Steril. 85, 71-77 (2006).
- Sharpe-Timms, K. L. Using rats as a research model for the study of endometriosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 955, 318-327 (2002).
- Stilley, J. A., Woods-Marshall, R., Sutovsky, M., Sutovsky, P., Sharpe-Timms, K. L. Reduced Fecundity in Female Rats with Surgically Induced Endometriosis and in Their Daughters: A Potential Role for Tissue Inhibitors of Metalloproteinase 1. Biol. Reprod. 80, (2009).
