Summary
ऑटो गर्भाशय के ऊतकों की आंतों अन्त्रपेशी की धमनी झरना के प्रत्यारोपण द्वारा चूहों और चूहों में endometriosis के प्रेरण शल्य चिकित्सा का वर्णन.
Abstract
Endometriosis एक पुरानी, दर्दनाक रोग एटियलजि जिसका अनजान बनी हुई है. इसके अलावा, endometriosis के उपचार घावों की लेप्रोस्कोपिक हटाने, और / या दर्द और बांझपन के लक्षण की पुरानी दवा प्रबंधन की आवश्यकता कर सकते हैं. एक संयुक्त राज्य अमेरिका में 22 अरब डॉलर प्रति वर्ष पर endometriosis के साथ जुड़े लागत का अनुमान लगाया गया है . इस रहस्यमय बीमारी अंतर्निहित तंत्र की हमारी समझ को आगे करने के लिए, पशु मॉडल नियोजित किया गया है. Primates अनायास endometriosis के विकास और इसलिए रहनुमा मॉडल सबसे निकट महिलाओं में इस रोग के समान है. कृंतक मॉडल, तथापि, और अधिक लागत प्रभावी और आसानी से 2 उपलब्ध हैं . मॉडल है कि हम यहाँ वर्णन आंतों अन्त्रपेशी (चित्रा 1) गर्भाशय ऊतक के एक ऑटोलॉगस हस्तांतरण शामिल है और पहले 3 चूहे में विकसित किया गया था और बाद में 4 माउस को हस्तांतरित . शल्य चिकित्सा प्रेरित endometriosis के ऑटोलॉगस कृंतक मॉडल के लक्ष्य की नकल हैमहिलाओं में इस रोग. हम और दूसरों को पहले से पता चला है कि चूहों या चूहों दर्पण है कि 5,6 रोग के साथ महिलाओं में मनाया से endometriotic घावों में बदल जीन अभिव्यक्ति पैटर्न मनाया. माउस में सर्जरी प्रदर्शन करने का एक लाभ यह है कि ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों की बहुतायत उपलब्ध विशिष्ट घटकों की स्थापना और endometriosis के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका का निर्धारण करने में शोधकर्ताओं सहायता कर सकते हैं. जिसमें excised मानव एंडोमेट्रियल टुकड़े immunocompromised चूहों के peritoneum के लिए शुरू कर रहे हैं एक वैकल्पिक मॉडल भी व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है लेकिन जो endometriosis के 2,7 में महत्वपूर्ण माना जाता है एक सामान्य प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी के द्वारा सीमित है. महत्वपूर्ण बात है, शल्य चिकित्सा प्रेरित endometriosis के माउस मॉडल एक बहुमुखी मॉडल है कि अध्ययन कैसे प्रतिरक्षा प्रणाली 8, 9,10 हार्मोन और पर्यावरणीय कारकों 11,12 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फ़र्ट पर endometriosis endometriosis के प्रभाव को प्रभावित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है13 ility और 14 दर्द.
Protocol
1. रहते पशु शल्य चिकित्सा के लिए योजना
- सुनिश्चित करें कि उपयुक्त अनुमोदन प्रयोगशाला जानवरों के साथ काम करने के लिए प्राप्त किया गया है.
- आदेश चूहों और अपने नए वातावरण के लिए दशानुकूलन के कम से कम एक सप्ताह की अनुमति देते हैं.
- स्त्री पुरुष pheromones के लिए जोखिम के अभाव में रखे चूहों साइकिल चालन रोक सकता है, एक घटना Whitten 15,16 प्रभाव के रूप में संदर्भित. चूहों साइकिल चालन के मूत्र से लथपथ हस्तांतरण पुरुष बिस्तर महिला पिंजरे हर पांच दिन रखने के लिए. वैकल्पिक रूप से, अगर खुले टॉप पिंजरों का इस्तेमाल कर रहे हैं, पुरुषों के दो पिंजरों के बीच महिला पिंजरे करने के लिए महिलाओं को नियमित रूप से साइकिल चालन रखने की जगह है.
- सुनिश्चित करें चूहों कि योनि कोशिका विज्ञान का विश्लेषण करके साइकिल चालन कर रहे हैं कम से कम एक सप्ताह के लिए दैनिक सर्जरी से पहले (1 टेबल ) 17.
- एक मोम पेंसिल का प्रयोग करें एक गिलास स्लाइड पर आठ विभाजन बनाना इतना है कि कई चूहों से योनि स्मीयरों एकत्र किया जा सकता है.
- 0.2-0.25 एमएल सामान्य खारा या आसुत जल का उपयोग कर एक eyedropper के साथ योनि फ्लश. रहो एसयोनि मुहाना में eyedropper के साथ गर्भाशय ग्रीवा उत्तेजना के रूप में eyedropper जगह ure pseudopregnancy का कारण बन सकता है. सेल प्रकार के विश्लेषण के लिए गिलास स्लाइड पर योनि lavage रखें. स्लाइड्स ताजा पढ़ा जा सकता है (गीला) या वैकल्पिक तरीकों की एक संख्या से तय और एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप 17 का उपयोग कर जांच की.
- इकट्ठा, साफ और एक सफल सड़न रोकनेवाला सर्जरी के लिए सभी आवश्यक सर्जिकल उपकरण (सामग्री अनुभाग देखें) 18 बाँझ.
- पीबीएस में analgesia बाँझ तकनीक का उपयोग करने के लिए 0.2 मिलीग्राम / किग्रा अंतिम खुराक देने के लिए buprenorphine समाधान तैयार. buprenorphine समाधान की एकाग्रता .०,३३३ मिलीग्राम / मिलीलीटर यह सोचते हैं कि औसत वयस्क C57BL 6 / माउस लगभग 0.025 किलो और माउस प्रति 0.15 मिलीलीटर की एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन की मात्रा वजन होना चाहिए. Buprenorphine समय से आगे तैयार किया जा सकता है और aliquots के रूप में संग्रहीत. ध्यान दें कि buprenorphine एक अनुसूची III नियंत्रित पदार्थ की आवश्यकता होती है एक डीईए लाइसेंस और विस्तृत सूची लॉग है.
- (100 यू / एमएल) पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / एमएल) के साथ बाँझ पीबीएस तैयार करें.
- महिला पिंजरों 72 घंटे के लिए मूत्र से लथपथ पुरुष बिस्तर 15 प्रेरण से पहले स्थानांतरित द्वारा कामोंमाद चक्र सिंक्रनाइज़ करें .
2. जीना पशु शल्य चिकित्सा के लिए शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार
- शल्य चिकित्सा के क्षेत्र के रूप में पहले 18 में वर्णित तैयार.
- बाहर बिजली के कतरनी, नेत्र मरहम, और शल्य चिकित्सा scrubs की सेटिंग के द्वारा तैयारी क्षेत्र तैयार.
- शल्य चिकित्सा क्षेत्र पर एक recirculating गर्म पानी हीटिंग पैड रखने के लिए सर्जरी के पूरे शरीर का तापमान बनाए रखने के द्वारा शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार. Recirculating गर्म पानी हीटिंग पैड पर एक बाँझ पनरोक पैड रखें. शल्य चिकित्सा उपकरणों, सीवन, बाँझ कांच पेट्री डिश, बायोप्सी पंच, बाँझ धुंध, घाव क्लिप और घाव बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र पर क्लिप applicator व्यवस्थित.
- Recirculating गर्म पानी हीटिंग आधे रास्ते und पैड रखकर वसूली क्षेत्र तैयारएर एक खाली पिंजरे चूहों गर्मी से दूर स्थानांतरित करने के लिए यदि हां, तो वांछित अनुमति.
3. Anesthetize और शल्य चिकित्सा के लिए माउस को तैयार
- रिकार्ड माउस के वजन और योनि कोशिका विज्ञान के मूल्यांकन के द्वारा कामोंमाद मंच का निर्धारण.
- संज्ञाहरण के अधिष्ठापन के लिए, एक खाली संज्ञाहरण कक्ष (ठोस isoflurane के लिए पोर्टल युक्त ढक्कन के साथ खाली पिंजरे) में माउस जगह है. Isoflurane गैर rebreathing संवेदनाहारी सिस्टम पर मुड़ें और 4 isoflurane% (0.5 से 1 एल / मिनट की एक ऑक्सीजन का प्रवाह दर के साथ) vaporizer सेट.
- जब माउस संज्ञाहरण के तहत isoflurane एक शंकु के लिए प्रवाह (30-60 मिलीलीटर सिरिंज म्यान) और तैयारी मेज पर शंकु में जगह है माउस नाक और मुंह स्विच. पर्याप्त संज्ञाहरण सर्जरी (~ isoflurane 2.5-3.5%) के शेष भर में isoflurane की एक कम एकाग्रता के साथ बनाए रखा जा सकता है. संज्ञाहरण के पर्याप्त गहराई पैर के अंगूठे चुटकी उत्तेजना के लिए एक नकारात्मक प्रतिक्रिया से निर्धारित किया जाना चाहिए.
- नेत्र मरहम टी लागूओ सर्जरी के दौरान आंखों के सूखने से बचें.
- छोटे विद्युत क़ैंची का प्रयोग, सर्जरी साइट दाढ़ी.
- कीटाणुरहित और chlorhexidine हाथ धोने के तीन बारी swipes और 70% इथेनॉल के साथ सर्जरी साइट तैयार.
- एक बाँझ क्षेत्र के साथ पशु कपड़ा.
4. गर्भाशय ligation
- 1.0 सेमी योनि खोलने के लिए विजय - स्तम्भ - एक छोटी सी (~ 1 सेमी) midline या तो छोटे कैंची या एक स्केलपेल 0.5 समाप्त ब्लेड का उपयोग कर चीरा बनाओ.
- ऐसी है कि ब्लेड के शरीर दीवार और पेट की दीवार के बीच हैं खोलने में बंद कैंची डालें. धीरे धीरे उद्घाटन और समापन ऐसी है कि पेट की दीवार पर्याप्त त्वचा से अलग है कैंची से चीरा के आसपास क्षेत्र टुकड़े करना कुंद. पेट चीरा साइट के चारों ओर दीवार और त्वचा के बीच शेष दिखाई adhesions ध्यान snipped किया जा सकता है. पर्याप्त रूप से चीरा साइट टुकड़े करना कुंद करने में विफलता पेट की दीवार और अधिक मुश्किल बंद कर देगा.
- छोटे च का उपयोगorceps, धीरे बाईं गर्भाशय सींग का पता लगाने. गर्भाशय आंत है, जो है क्या आप पहले चीरा साइट में प्रवेश करने पर देखेंगे पृष्ठीय है. कुछ उदाहरणों में यह आसान है पहले अंडाशय और जुड़े डिम्बग्रंथि वसा पैड का पता लगाने. धीरे गर्भाशय सींग पर खींचने के लिए और इसे नीचे एक खुला संदंश स्लाइड retractor के रूप में सेवा. अगर वांछित, इस समय अंडाशय और गर्भाशय के अतिरिक्त प्रेरण पर कामोंमाद मंच (1 टेबल) के बारे में जानकारी के लिए उपस्थिति ध्यान दें.
- धीरे बढ़ाकर गर्भाशय सींग नीचे दो 6-8 5-0 काला लट रेशम सीवन (एक सुई के बिना) के सेमी टुकड़े स्लाइड.
- सुरक्षित जंक्शन utero-tubual (बस फैलोपियन ट्यूब के लिए दुम का) और utero - ग्रीवा (सिर्फ गर्भाशय ग्रीवा के लिए विजय - स्तम्भ) जंक्शन प्रत्येक स्थान पर एक वर्ग गाँठ का उपयोग सींग कटी घमनी को बांधना. पल के लिए सीवन की छोर छोड़ो.
- दो ligations के बीच गर्भाशय सींग की धारा बाहर कट और एक बाँझ गिलास पेट्री डिश conta में ऊतक जगह~ पीबीएस युक्त (100 यू / एमएल) पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / एमएल) की 100 μL ining. रेशम सीवन पिछले समाप्त होता है कट. यदि सीवन ढीला या वहाँ खून बह रहा है की बात आती है, स्टंप खोजने के लिए और दूसरा गाँठ बाँध.
5. Excised गर्भाशय से endometriotic प्रत्यारोपण की तैयारी
- जबकि excised गर्भाशय चालाकी से किया जा रहा है, बाँझ धुंध के साथ पेट को कवर और बाँझ पीबीएस युक्त पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के रूप में की जरूरत के साथ जलयोजन बनाए रखने.
- वसा के excised गर्भाशय सींग पट्टी.
- अगर वांछित, excised गर्भाशय सींग तौलना.
- लुमेन में एक छोटी कैंची की ब्लेड (14 मिमी ब्लेड लंबाई) डालने और धीरे गर्भाशय सींग नीचे फिसलने कैंची जबकि संदंश के साथ सींग पकड़े द्वारा गर्भाशय सींग खोलें.
- कांच पेट्री डिश में, एक 2 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करने के लिए तीन बराबर आकार के प्रत्यारोपण में कटौती.
6. Peritoneal गुहा में endometriotic प्रत्यारोपण suturing
- प्लेस sterilचीरा साइट और अच्छी तरह से बाँझ पीबीएस युक्त पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ गीला ऊपर तुरंत ई धुंध.
- छोटे के साथ, चिकनी संदंश धीरे अंधान्त्र पाते हैं और छोटी आंत साथ rostrally बढ़ने. आंत का एक छोटा सा (4-5 सेमी) अनुभाग कि अंधान्त्र से कम से कम दो धमनियों दूर है और यह पूर्व गीला धुंध पर एक प्रशंसक की तरह व्यवस्था इतनी है कि आंतों अन्त्रपेशी की धमनी झरना स्पष्ट रूप से दिखाई देता है बाहर खींचो. सभी समय बाँझ खारा के साथ मल नम रखना सुनिश्चित करें. नोट: चूहा - दांतेदार संदंश उपयोग नहीं करते हुए मल से निपटने करते हैं.
- एक पी-1, 11 मिमी, 3 / 8 चक्र के साथ 6-0 काले ethilon सिवनी का प्रयोग करें, काटने सुई रिवर्स करने के लिए धीरे से मल से लगभग 0.5 सेमी धमनी के लिए एक प्रत्यारोपण सीवन.
- नोट: आंतों अन्त्रपेशी peritoneum के एक पतली परत के द्वारा कवर किया जाता है. इस परत के माध्यम से एक साफ पास बना जबकि धमनी के आसपास suturing सावधान रहें. धीरे से और ध्यान के माध्यम से सीवन खींचो के रूप में आँसू नहीं पेरिटोनियम या टूटनाधमनी.
- एक की पूरी दो समुद्री मील प्रत्येक फेंक, नहीं सिवनी बहुत मुश्किल कस सावधान किया जा रहा है के रूप में ऐसा करने रक्त प्रवाह और आंत और मृत्यु के बाद परिगलन की हानि में परिणाम कर सकते हैं. प्रत्यारोपण के 2 मिमी के भीतर सीवन छाँटो. गीले आंत्र फिर अगले समाविष्ट करने के लिए पर जाने से पहले जलयोजन बनाए रखने के लिए जारी रखने के लिए.
- एक विजय - स्तम्भ दिशा में चल रहा है, आंत के अगले 3-4 सेमी बाहर खींच और धीरे से अनुभाग है कि पहले से ही एक प्रत्यारोपण शामिल की जगह. पिछले प्रत्यारोपण साइट से एक या दो धमनियों छोड़ें और अगले प्रत्यारोपण सीवन. तीसरे प्रत्यारोपण के लिए दोहराएँ.
- आंत्र के सभी उदर गुहा में बदलें.
7. शाम सर्जरी
- शाम सर्जरी सिवाय कि कोई ऊतक आंतों अन्त्रपेशी sutured है endometriosis सर्जरी के रूप में एक ही चरणों का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं.
- उत्पाद शुल्क के रूप में चरण 4 में छोड़ दिया गर्भाशय सींग.
- Endometriotic प्रत्यारोपण (कदम 5) नकली सर्जरी में तैयार नहीं हैं.excised गर्भाशय सींग या खारिज किया जा सकता है और अन्य प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता अगर वांछित.
- Sutures, लेकिन कोई ऊतकों, तीन धमनियों के आसपास चरण 6 में के रूप में आंतों अन्त्रपेशी की धमनी झरना में रखा जाता है.
8. सर्जिकल घाव बंद
- सुनिश्चित करें कि सभी अंगों के लगभग उनकी शारीरिक स्थिति के लिए वापस आ रहे हैं.
- एक गैर - इंटरलॉकिंग निरंतर सिलाई में 5-0 लेपित vicryl सिवनी का प्रयोग बंद करने के पेट की दीवार.
- 9 मिमी घाव क्लिप का उपयोग करने के लिए त्वचा के करीब है.
9. पशु पुनर्प्राप्त
- 0.15 ml/25 जी माउस पर 0.2 मिलीग्राम / किलो की एक खुराक के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से 0.33 मिलीग्राम / मिलीलीटर buprenorphine प्रशासन. Buprenorphine बाद operatively प्रशासित किया जाता है आगे हृदय / श्वसन अवसाद है कि वसूली की प्रक्रिया को लंबा कर सकते हैं को रोकने.
- धीरे kimwipes या कागज तौलिए अगर यह सर्जरी के दौरान गीला हो गया है के साथ माउस सूखी.
- पिंजरे पी में प्लेस जानवर वेंट्रल नीचे की ओरartially recirculating गर्म पानी पैड जब तक पशु बरामद किया है और sternal अवलंबन (inhalant चतनाशून्य करनेवाली औषधि जल्दी बंद पहनता है के रूप में पांच मिनट के भीतर) आ ऊपर.
10. पोस्ट ऑपरेटिव परवाह
- चूहे हर 15 मिनट में मनाया जाना चाहिए जब तक वे sternal अवलंबन, तो प्रति घंटा बनाए रखने के लिए जब तक वे सर्जरी के बाद अपने सामान्य व्यवहार पाने में सक्षम हैं.
- चूहे सर्जरी के 24 घंटे के भीतर सामान्य दिखाई देनी चाहिए. चूहे वसूली और अच्छे स्वास्थ्य के लक्षण के लिए सात से दस दिनों के लिए दैनिक निगरानी करनी चाहिए.
- संकेत है कि एक जानवर गरीब स्वास्थ्य, दर्द या संकट में है कम गतिविधि, आत्म विईतीकरण, ungroomed उपस्थिति, या hunched मुद्रा शामिल हैं.
- यदि एक जानवर सर्जरी के 24 घंटे के भीतर अच्छे स्वास्थ्य में दिखाई नहीं देता, या तो buprenorphine (0.2 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन या जानवर euthanize. यदि पशु पूरक buprenorphine जानवर shoul प्रशासन के 8 घंटे के भीतर सुधार नहीं करता हैघ के रूप में आंत्र परिगलन की संभावना है euthanized हो.
- घाव क्लिप निकालें 7-10 के बाद प्रेरण दिन.
- योनि कोशिका विज्ञान की परीक्षा द्वारा प्रयोग की अवधि के लिए मद cyclicity की निगरानी जारी रखें. मद चक्र महिला पिंजरों के लिए मूत्र से लथपथ पुरुष बिस्तर के हस्तांतरण के रूप में 1.3 चरण में वर्णित संग्रह करने के लिए 72 घंटे पहले सिंक्रनाइज़ करें.
11. चीर - फाड़ और ऊतक छांटना
- शव - परीक्षा के समय विशेष रूप से अनुसंधान के सवाल पर निर्भर है और आगे प्रतिनिधि परिणाम और चर्चा में चर्चा की है.
- कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation द्वारा माउस euthanize.
- हृदय एक 1cc सिरिंज पर एक 23 गेज सुई का उपयोग पंचर द्वारा रक्त लीजिए (अगर वांछित).
- एक योनि कोशिका विज्ञान स्मियर जमा के रूप में ऊपर वर्णित करने के लिए संग्रह 17 के समय में कामोंमाद चरण निर्धारित.
- Utero-ट्यूबल जंक्शन शेष गर्भाशय सींग कट और गर्भाशय ग्रीवा में चर्बी हटाने, वजन, और प्रक्रिया के रूप मेंवांछित (11.14 और 11.15 देखें).
- Endometriotic घावों के आसपास काले sutures का पता लगाएँ. तस्वीर बरकरार endometriotic अगर घावों वांछित.
- ध्यान से एक छोटी सी कैंची और संदंश के साथ endometriotic घावों के आसपास adhesions टुकड़े करना, नहीं लांस घावों के लिए सावधान किया जा रहा है. जल्दी और सावधानी से काम करने के लिए शाही सेना क्षरण को रोकने के.
- उपाय और endometriotic नली का व्यास का उपयोग घावों की लंबाई और चौड़ाई रिकॉर्ड.
- आबकारी endometriotic और घावों एक कागज तौलिया पर जगह पीबीएस के साथ सिक्त. घावों से किसी भी गैर endometriotic ऊतक निकालें. एक विदारक माइक्रोस्कोप या आवर्धक कांच स्टैंड विच्छेदन में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- सीवन को हटाने से पहले तीन द्रव भरा endometriotic घावों वजन.
- धीरे endometriotic घावों से सिवनी को हटा दें.
- मैं ऊतक विज्ञान के लिए, formalin तय दो तीन तीस मिनट पीबीएस washes और अंतिम भंडारण के द्वारा पीछा किया घंटे के लिए एक तरल पदार्थ endometriotic घाव भराn 70% इथेनॉल. निर्जलीकरण और आयल एम्बेड.
- लांस endometriotic घावों के दो. इन फिर से वजन. के बाद से चक्रीय हार्मोनल परिवर्तन पुटी तरल पदार्थ की मात्रा में परिवर्तन कर सकते हैं, इस पुटी के वजन से अधिक तरल पदार्थ के रूप में 11.10 में मापा के अलावा वजन - गीला ऊतक का एक उपाय देता है.
- आरएनए अलगाव और जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए, तुरंत lysis बाध्यकारी समाधान और दुकान में lanced endometriotic (या ~ 20 μg गर्भाशय ऊतक) -80 पर घावों के एक डिग्री सेल्सियस के रूप में RNAqueous (Ambion) किट या अन्य विधि के साथ भविष्य में शाही सेना के अलगाव के लिए homogenize वांछित.
- शाही सेना डीएनए या प्रोटीन के भविष्य के अलगाव के लिए, तुरंत दूसरा lanced endometriotic घाव तस्वीर फ्रीज (या ~ 20 गर्भाशय ऊतक μg) -80 में तरल नाइट्रोजन और दुकान में डिग्री सेल्सियस
प्रतिनिधि परिणाम
शल्य चिकित्सा प्रेरित endometriosis के माउस मॉडल में Endometriotic घावों आकृति विज्ञान और histologically में मनाया उन जैसे लगते हैंमहिलाओं. दोनों महिलाओं और माउस मॉडल में endometriosis के histological विश्लेषण दर्शाता है कि endometriotic घावों एंडोमेट्रियल ग्रंथियों और stroma (2A चित्रा) होते हैं. चूहों में Endometriotic घावों को भी hemosiderin से लदी मैक्रोफेज है, जो महिलाओं में एक endometriosis के आम बानगी (चित्रा 2B) 19 होते हैं .
Endometriotic चूहों से हटा घावों तीन बाद प्रेरण दिनों में सूजन और रक्तस्रावी (चित्रा 3A) दिखाई देते हैं. माउस मॉडल में विकास endometriotic घावों के दो से चार सप्ताह के बाद पुटी की तरह, तरल पदार्थ भरा और peritoneal adhesions से घिरा (आंकड़े 3B और 3C) कर रहे हैं. प्रेरण पर घाव वजन की तुलना में, तरल पदार्थ भरा घावों 306% थे और 862% एक बड़ा और दो पोस्ट प्रेरण महीने और lanced घावों 51% और 172% बड़ा, क्रमशः (आंकड़े 4A और 4B) थे. हम संगत भरा और endometriotic घाव वजन lanced बाद प्रेरण एक महीने में पांच अलग प्रयोगों (चित्रा 5) से अधिक तरल पदार्थ प्राप्त किया है. बाद में एक महीने मेंduction द्रव (7.44 ± 3.75 मिलीग्राम) भरा और lanced (2.92 ± 1.23 मिलीग्राम) endometriotic घाव वजन काफी (Pearson सहसंबंध गुणांक = 0.669, 0.001 <पी) सहसंबद्ध थे.
माउस की आयु उम्र के तीन और दस महीने के बीच चूहों के लिए घाव आकार को प्रभावित नहीं किया. न तो भरा एक महीने में या endometriotic घाव वजन lanced द्रव - प्रेरण के बाद काफी जानवर की उम्र के साथ सहसंबद्ध था (आर -0.136 =, पी = 0.380 और = r -0.063, = 0.698 पी, क्रमशः).
माउस गर्भाशय के आकार में परिवर्तन, द्रव प्रतिधारण, सेल प्रसार और उपस्थिति मद चक्र के दौरान स्टेरॉयड हार्मोन के प्रभाव के कारण आए. हम अलग - अलग कामोंमाद चरणों में जानवरों से शेष बरकरार गर्भाशय सींग का वजन करने के लिए endometriotic घाव वजन की तुलना में. हम गर्भाशय वजन और तरल पदार्थ भरा है या lanced endometriotic एल के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध नहीं मिलाएक महीने के बाद शामिल (r = -0.046, पी = .765 और आर = 0.232, पी = .155, क्रमशः) पर esion वजन.
जीन अभिव्यक्ति चूहों के endometriotic घावों में मनाया पैटर्न निकट दर्पण है कि 5 रोग के साथ महिलाओं में सूचना दी. तीन दिन बाद प्रेरण बाह्य मैट्रिक्स remodeling, कोशिका आसंजन, और angiogenesis को विनियमित जीन के अत्यधिक upregulated हैं और विकास के एक महीने के माध्यम से इन जीनों के कई upregulated रहते हैं.
आंकड़े और तालिकाओं
चित्रा 1 autologus माउस में गर्भाशय ऊतक हस्तांतरण द्वारा endometriosis के सर्जिकल प्रेरण. बाईं गर्भाशय सींग ligated excised, और longitudinally खोला अंतर्गर्भाशयकला बेनकाब. तीन 2 मिमी 2 बायोप्सी तैयार कर रहे हैं और आंतों mesente की धमनी झरना में प्रत्येक एक धमनी sutured हैry. एक महीने बाद प्रेरण endometriotic घावों हैं तरल पदार्थ भरा और adhesions से घिरा हुआ है.
चित्रा 2 Hematoxylin और लाल भामसान रंग endometriosis के माउस मॉडल से एक महीने बाद प्रेरण एंडोमेट्रियल घाव के दाग खंड प्रदर्शन (ए) एंडोमेट्रियल ग्रंथियों और की उपस्थिति stroma, पैमाने बार = 50 सुक्ष्ममापी और (बी) hemosiderin से लदी मैक्रोफेज, जिनमें से कुछ तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं, पैमाने बार = 20 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3 इच्छामृत्यु निम्नलिखित माउस मॉडल में Endometriotic घावों, या तो तीन दिन (ए) के बाद प्रेरण या एक महीने के बाद प्रेरण (बी और सी).
चित्रा 4 चूहों से Endometriotic घावों शल्य चिकित्सा एन है प्रेरित.dometriosis और excised - प्रेरण के बाद एक या दो महीने में तौला गया. डेटा औसत ± SEM. डेटा बदल लॉग इन कर रहे थे और विभिन्न पत्र के बाद एक तरफा है फिशर के कम से कम महत्वपूर्ण अंतर एकाधिक तुलना द्वारा एक पैनल के भीतर एक तरह से एनोवा द्वारा महत्व का संकेत है. (ए) की तरह, तरल पदार्थ भरा endometriotic घावों पुटी (N = 10, 7 या 5 प्रेरण, एक महीने या दो महीने के बाद प्रेरण, क्रमशः के लिए). (बी) lanced endometriotic घावों (एन = 8 10, या प्रेरण, एक महीने या दो महीने के बाद प्रेरण क्रमशः के लिए 7).
5 चित्रा Endometriotic तरल पदार्थ के साथ घाव गीला वजन और एक महीने के बाद पांच अलग - अलग प्रयोगों से प्रेरण lanced. डेटा औसत ± SEM. चूहे = एन 10, 6, 8, 7 और तरल पदार्थ भरा घावों और 0, 7 के लिए 7, 10, 8, और प्रयोग 1, 2, 3, 4, और 5, क्रमशः में lanced घावों के लिए 8.
तालिका 1. कामोंमाद स्टेज योनि कोशिका विज्ञान और अंडाशय और गर्भाशय और प्रेरण के दृश्य रूप से अवलोकन.
अंडाशय और गर्भाशय के रूप में समय निर्भर हो जाएगा. निम्नलिखित लगभग 8:00 प्रत्येक चक्र के दिन की सुबह हूँ बलिदान पर आधारित हैं. इसके अलावा, टिप्पणियों व्यक्तिपरक हैं और अंडाशय और गर्भाशय के सींग की तुलना केवल गर्भाशय सींग की तुलना में एक बेहतर अनुमान हो जाएगा. इन टिप्पणियों के लिए दैनिक योनि कोशिका विज्ञान रीडिंग से प्राप्त जानकारी के पूरक के लिए होती हैं.
तालिका 2. सर्जरी के माउस और चूहा तुलना.
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Discussion
वहाँ कई महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि ध्यान दिया जाना चाहिए, जबकि चूहों में endometriosis के सर्जिकल प्रेरण प्रदर्शन कर रहे हैं. सबसे पहले, endometriosis एक एस्ट्रोजन निर्भर रोग है और यह ऐसी सर्जरी के रूप में बरकरार पशुओं में या वैकल्पिक रूप से 20 एस्ट्रोजेन के साथ पूरक ovariectomized जानवरों में प्रदर्शन किया जाना चाहिए. दूसरा, धमनी झरना एंडोमेट्रियल बायोप्सी suturing चरम देखभाल के साथ किया जाना चाहिए. हमने पाया है कि एक के साथ केवल दो अपेक्षाकृत ढीली समुद्री मील का उपयोग कर फेंक प्रत्येक जगह में बायोप्सी रहता है, जबकि आंत्र और बाद ऊतक परिगलन और जानवरों की मौत के लिए रक्त की आपूर्ति की ligation को रोकने. हम दृढ़ता से कई चूहों पर अभ्यास वास्तविक करने के लिए सुनिश्चित करें कि sutures सुरक्षित पर्याप्त है कि ऊतक खो नहीं है रखा जाता है प्रयोग करने के लिए पहले की सिफारिश, लेकिन के रूप में आंत्र परिगलन के कारण तंग भी नहीं है. तीसरा, यह बहुत महत्वपूर्ण है के दौरान आंत्र ऊतक बाँझ पीबीएस युक्त पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ hydrated रखने केurgery. चौथा प्रयासों, करने के लिए सुनिश्चित करें कि endometriotic प्रत्यारोपण आकार अनुरूप है लिया जाना चाहिए. इस आशय के लिए हम एक 2 मिमी का उपयोग बायोप्सी पंच excised गर्भाशय ऊतक से लगातार आकार endometriotic प्रत्यारोपण बनाने के लिए.
वहाँ कई संशोधनों है कि इस प्रोटोकॉल के लिए बनाया जा सकता है व्यक्तिगत शोधकर्ता की जरूरत है और वैज्ञानिक सवाल के अनुरूप हैं. जानवर के हार्मोन प्रोफ़ाइल के लिए एक संभावित संशोधन संबंधित. जीन और endometriotic घावों में प्रोटीन अभिव्यक्ति, शेष बरकरार गर्भाशय सींग और प्रतिरक्षा प्रणाली को सीधे मद चक्र चरण के संबंध में संग्रह के समय से प्रभावित हो सकता है. संग्रह के समय में कामोंमाद चरण के लिए नियंत्रण के कई दृष्टिकोण, अपने फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक रहे हैं. उदाहरण के लिए, बरकरार, साइकिल चालन जानवरों महिला पिंजरे में मूत्र से लथपथ पुरुष बिस्तर प्रेरण या संग्रह है कि ऐसे जानवरों के लिए तीन दिन पहले स्थानांतरित द्वारा सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है है शल्य चिकित्सा कर रहे हैं इंदुced और एक ही मद 15 चरण के दौरान एकत्र. यदि बरकरार साइकिल चालन जानवरों का इस्तेमाल किया जाता है, मद cyclicity योनि 17 कोशिका विज्ञान की परीक्षा द्वारा दैनिक निगरानी करनी चाहिए . यह अधिक physiologically प्रासंगिक होने का लाभ है, लेकिन प्राप्त करने के चक्र synchronicity 100% सफल नहीं है. वैकल्पिक रूप से, अक्षत जानवरों exogenous जननग्रंथिपोषी 21,22 प्रशासन द्वारा सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है. जबकि कुछ अधिक सटीक, इस विधि उच्च एस्ट्रोजन का स्तर सामान्य से बनाता है. एक अन्य दृष्टिकोण जानवरों ovariectomize और एक silastic कैप्सूल, मिनी आसमाटिक पंप, या दैनिक इंजेक्शन 4,8 के माध्यम से वापस exogenous हार्मोन की एक निरंतर स्तर दे या तो किया गया है. यह विधि कई जानवरों भर में एक समान हार्मोन प्रोफ़ाइल प्राप्त करने का लाभ है, लेकिन हानिकर है क्योंकि जानवरों साइकिल चालन नहीं रहे हैं.
शाम सर्जरी के लिए आकलन किया जा सकता है जो प्रभाव प्रभाव attributab बनाम सर्जरी के दौर से गुजर के परिणाम हैंendometriosis के लिए ले. नकली सर्जरी में छोड़ दिया गर्भाशय सींग हटा दिया है और sutures के धमनियों के आसपास आंतों अन्त्रपेशी की धमनी झरना में रखा जाता है लेकिन कोई endometriotic प्रत्यारोपण 5,8,23 sutured हैं . वैकल्पिक रूप से, excised गर्भाशय सींग से हटा वसा आंतों अन्त्रपेशी 3,14 करने के लिए sutured किया जा सकता है. हम हाल ही में खबर दी है कि वहाँ नकली गर्भाशय और शल्य चिकित्सा के लिए 5 endometriosis प्रेरित जानवरों से बरकरार शेष गर्भाशय सींग के बीच सीडीएनए माइक्रोएरे द्वारा मापा के रूप में जीन अभिव्यक्ति में अपेक्षाकृत कुछ मतभेद हैं. इसके अलावा, सात endometriosis से संबंधित जीन के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करते हुए, हमने पाया है कि केवल haptoglobin अभिव्यक्ति नकली और endometriosis के चूहों की ग्रीवा में काफी अलग था. ली एट अल. तथापि, endometriosis दिखावा 23 नियंत्रण के लिए तुलना में प्रेरित चूहों से गर्भाशय में पांच जीनों के अंतर अभिव्यक्ति की सूचना दी. यह पता चलता है कि endometriotic lesio की उपस्थितिएनएस eutopic गर्भाशय में बदल जीन की अभिव्यक्ति हो सकता है.
शल्य चिकित्सा के लिए endometriosis है प्रेरित चूहों के संग्रह के समय विशेष रूप से अनुसंधान प्रश्न द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. संग्रह चूहों के तीन बाद प्रेरण दिनों एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक न्युट्रोफिल और machrophage घुसपैठ और cytokine उत्पादन के रूप में 8 पहले सूचित किया गया है सहित endometriosis के स्थापना में जल्दी घटनाओं का आकलन करने के लिए अनुमति देता है. हम पता चला है कि endometriotic घावों तीन बाद प्रेरण दिनों छोटे, hemorraghic एकत्र, और काफी शेष गर्भाशय सींग 4 रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति बदल दिया . दो सप्ताह तक के बाद प्रेरण endometriotic घावों को अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं और अक्सर पुटी संरचनाओं की तरह का गठन. माउस में, endometriotic घावों के आकार में वृद्धि के रूप में भरा द्रव का वजन द्वारा मूल्यांकन और घाव लंबाई, चौड़ाई, और heig द्वारा निर्धारित मात्रा से (आंकड़ा 4) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से lanced घावों जारीदो महीने के माध्यम से पोस्ट - प्रेरण 9 ht माप.
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, endometriosis के शल्य चिकित्सा मॉडल पहले चूहे में विकसित किया गया था और अभी भी बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया 3. जब चूहे में इस सर्जरी प्रदर्शन हम प्रोटोकॉल करने के लिए निम्न संशोधन करने, के रूप में तालिका 2 में सारांशित है. चूहे में प्रयुक्त sutures के सभी 4-0 आकार के होते हैं और किया जाना चाहिए सकता है और अधिक मजबूती से बंधा है. इसके अतिरिक्त, हम peritoneal गुहा के आंतों अन्त्रपेशी में छह 5 मिमी 2 endometriotic प्रत्यारोपण सिवनी .
इस प्रोटोकॉल में हम एक साँस चतनाशून्य करनेवाली औषधि के उपयोग का वर्णन, isoflurane. वैकल्पिक रूप से, संयुक्त इंजेक्शन संवेदनाहारी ketamine और Domitor (medetomidine हाइड्रोक्लोराइड) या एक और अल्फा दो agonist इस्तेमाल किया जा सकता है से बना है, हालांकि वसूली समय कुछ रह गया है. Ketamine, 75 मिलीग्राम / किलो intraperiotneal इंजेक्शन द्वारा प्रशासित, न्यूनतम तीव्र दर्द के साथ एक अलग करनेवाला संवेदनाहारी एजेंट गुण एक राहत हैएन डी एक अनुसूची III दवा एक डीईए लाइसेंस और विस्तृत दवा सूची की आवश्यकता है. Domitor, 1 मिलीग्राम / किग्रा प्रशासित, एक अल्फा-2 एड्रीनर्जिक agonist है और Antisedan प्रशासन (atipamezole हाइड्रोक्लोराइड) के साथ आसानी से उलट है. Domitor एक शामक है कि मांसपेशी छूट और दर्द से राहत प्रदान करता है. Domitor और ketamine पीबीएस संयोजन में बाँझ तकनीक का उपयोग में समय से आगे तैयार कर सकते हैं. Antisedan, Domitor के लिए पीछे एजेंट, buprenorphine साथ संयोजन में पीबीएस में तैयार किया जा सकता है और मिलीग्राम / किग्रा बाद operatively 1 प्रशासित किया जाना चाहिए. Buprenorphine भी है एक अनुसूची III दवा और विकल्प गैर स्टेरायडल विरोधी inflammatories (flunixin meglumine) banamine और ketoprofen शामिल हैं.
सभी मॉडलों के साथ वहाँ कुछ सीमाएं हैं कृन्तकों में endometriosis के सर्जिकल प्रेरण के साथ जुड़े. अग्रणी है कि एक मासिक धर्म चक्र कृन्तकों नहीं है और इसलिए अनायास endometriosis विकसित नहीं है. एक कृंतक आधुनिक बनाने के प्रयास मेंएल अधिक physiologically मनुष्यों में हालत कुछ शोधकर्ताओं के लिए ऑटोलॉगस या मुताबिक़ 24,25 suturing बिना सीधे syngenic जानवरों से गर्भाशय ऊतक टुकड़े peritoneal गुहा में इंजेक्षन करने के लिए चुना है के लिए इसी तरह की. चूहों में, इंजेक्शन पुटी जैसे ऊतक endometriotic घावों रूपों, तथापि, प्रेरण के इंजेक्शन विधि चूहों में काम के रूप में ऊतकों को देते हैं और peritoneal गुहा में 3 आक्रमण विफल रहता है प्रतीत नहीं होता.
कृंतक मॉडल बड़े पैमाने पर किया गया है एटियलजि, विकृति, और 2,8,26-29 endometriosis के जोखिम वाले कारकों के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपन्यास चिकित्सा विज्ञान 14,30-34 का पता लगाने का अध्ययन किया. शल्य चिकित्सा द्वारा प्रेरित endometriosis के कृंतक मॉडल मानव में रोग के लिए कई समानताएं प्रजनन क्षमता में कमी और उपजाऊपन और बदल जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति 5,6,35,36 सहित, को दर्शाता है. एक साथ ले लिया, उनकी अपेक्षाकृत कम लागत और तैयार की उपलब्धता, शल्य चिकित्सा इंदु के कृंतक मॉडल के साथced endometriosis महिलाओं में endometriosis के लिए एक शानदार मॉडल है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
अनुकूलन में उनकी सहायता के लिए क्रिस Kassotis और इस पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए ऑड्रे बेली और डॉ. स्कॉट Korte, यूसुफ Beeman, एलिसन Curfman, पॉल Kimball, Bridget Neibreggue, याकूब Redel, एमी Schröder, Maija स्टाइनबर्ग, और स्टेसी Winkeler के लिए विशेष धन्यवाद हमारी प्रयोगशाला में इस मॉडल की. अनुदान क्लिनिकल Biodetectives प्रशिक्षण (T90 NIH) के अनुदान (KEP), मिसौरी लाइफ साइंसेज के विश्वविद्यालय के अंडर ग्रेजुएट रिसर्च अवसर कार्यक्रम, म्यू अनुसंधान परिषद, म्यू अनुसंधान बोर्ड अनुदान और NIH R21HD056441 (SCN) द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax pencil | Fisher Scientific | NC9954135 | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-433 | |
| Eyedropper | Fisher Scientific | S79383 | |
| Standard light microscope for evaluating vaginal cytology smears | |||
| Buprenorphine HCL c3 (CARJET) 10X1ml | Butler Animal Health Supply | 022891 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14040-117 | |
| 10,000U/ml Penicillin, 10,000μg/ml Streptomycin in 0.85% NaCl | Hyclone | SV30010 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane non-rebreathing anesthetic system | |||
| Recirculating hot water heating pad | |||
| 30 ml syringe sheath | Fisher Scientific | 14-823-16G | |
| Powder free sterile gloves | Fisher Scientific | 19020558 | |
| Ophthalmic ointment | Major Pharmaceuticals | 10033691 | |
| Small electrical clippers | Wahl Clipper Corp. | 9861-600 | |
| Chlorhexidine scrub | Fisher Scientific | NC9863042 | |
| 70% Ethanol | |||
| Polylined sterile field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Size 3 scalpel | Fisher Scientific | 22-079-657 | |
| Number 10 scalpel blades | Fisher Scientific | 22-079-681 | |
| Small surgical scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5850 | |
| Small serrated semi-curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 5-0 black braided silk suture | Ethicon Inc. | K870H | |
| Sterilized pyrex glass Petri dishes | Corning | 70160-101 | |
| 2 mm biopsy punch | Miltex Inc. | 33-31 | |
| Sterile gauze | Kendall | 1806 | |
| 6-0 black monofilament ethilon nylon suture | Ethicon Inc. | 697G | |
| Needle drivers (optional) | World Precision Instruments, Inc. | 500023 | |
| 5-0 undyed braided coated vicryl suture | Ethicon Inc. | J490G | |
| 9mm Autoclip wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Autoclip applier & remover | BD Biosciences | 427630 | |
| 23G needle | BD Biosciences | 305193 | |
| 1cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 5X magnifying glass stand (optional) | Fisher Scientific | 14-648-23 | |
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Calipers | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6466 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 15-197-700A | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| RNAqueous RNA isolation kit | Ambion | AM1912 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Snap cap microcentrifuge flat top tube | Fisher Scientific | 02-681-240 | |
| Ketamine (optional) | Sigma-Aldrich | K4138 | |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) (optional) | Tocris Bioscience | 2023 | |
| Antisedan (atipamezole) (optional) | Sigma-Aldrich | A9611 |
References
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