Summary
En beskrivelse af den kirurgiske induktion af endometriose hos mus og rotter ved auto-transplantation af uterine væv til arterielle kaskade af den intestinale mesenterium.
Abstract
Endometriose er en kronisk, smertefuld sygdom, hvis ætiologi er fortsat ukendt. Desuden kan behandlingen af endometriose kræver laparoskopisk fjernelse af læsioner, og / eller kroniske farmaceutiske behandling af smerter og infertilitet symptomer. Omkostningerne forbundet med endometriose er blevet anslået til 22 milliarder dollars om året i USA 1. For yderligere at vores forståelse af mekanismerne bag denne gådefulde sygdom, har dyremodeller været ansat. Primater spontant udvikler endometriose og derfor primater modeller nærmest ligner sygdommen hos kvinder. Gnaver modeller, er dog mere omkostningseffektive og let tilgængelige 2. Den model, som vi beskriver her, indebærer en autolog overførsel af uterin væv til tarmenes mesenterium (Figur 1) og blev første gang udviklet i rotter 3 og senere overført til musen 4. Målet med autologe gnaver model af kirurgisk induceret endometriose er at efterlignesygdommen hos kvinder. Vi og andre har tidligere vist, at den ændrede genekspression mønster observeret i endometriotic læsioner fra mus eller rotter, spejle, der blev observeret hos kvinder med sygdommen 5,6. En fordel ved at udføre operationen i musen er, at den overflod af transgene mus stammer ledigt. kan støtte forskere til at bestemme betydningen af specifikke komponenter vigtig i etablering og vækst af endometriose. En alternativ model, hvor fjernet menneskelige endometrie fragmenter bliver introduceret til bughinden af immunkompromitterede mus er også meget anvendt, men er begrænset af manglen på et normalt immunforsvar, som menes at være vigtigt i endometriose 2,7. Vigtigere er det, musemodel af kirurgisk induceret endometriose er en alsidig model, der er blevet brugt til at studere, hvordan immunsystemet 8, hormoner 9,10 og miljømæssige faktorer 11,12 påvirker endometriose samt virkningerne af endometriose på Fertility 13 og smerte 14.
Protocol
1. Planlægning af levende dyr operation
- Sikre, at relevante godkendelse er modtaget for at arbejde med forsøgsdyr.
- Bestil mus og giver en frist på mindst en uge af Akklimatisering til deres nye omgivelser.
- Hunmus til huse i mangel af eksponeringen for mandlige feromoner kan stoppe cykling, et fænomen kaldet Whitten effekt 15,16. For at holde mus cykling transfer urin-gennemblødt mandlige sengetøj til den kvindelige buret hver fem dage. Alternativt, hvis open-top-bure skal placere kvindelige buret mellem to bure af mænd til at holde hunnerne cykling regelmæssigt.
- Sørg for, at mus er cykling ved at analysere vaginal cytologi dagligt i mindst en uge før kirurgi (Tabel 1) 17.
- Brug en voks blyant til at oprette otte partitioner på en glasplade, så vaginal udstrygninger fra flere mus kan indsamles.
- Skyl skeden med 0,2-0,25 ml normalt saltvand eller destilleret vand med en pipette. Vær sURE at placere pipetten lige ved vaginal blænde, som livmoderhalskræft stimulation med pipetten kan forårsage pseudopregnancy. Placer vaginal udskylning på objektglas til analyse af celletyper. Slides kan læses frisk (våd) eller alternativt fastsat ved en række metoder og undersøgt ved hjælp af en standard lysmikroskop 17.
- Indsamle, rengøre og sterilisere alle nødvendige kirurgisk udstyr for en vellykket aseptisk operation (se Materiale afsnit) 18.
- Forbered buprenorphin løsning til analgesi i PBS ved hjælp af steril teknik til at levere 0,2 mg / kg sidste dosis. Koncentrationen af buprenorphin opløsning bør 0,0333 mg / ml, forudsat at den gennemsnitlige voksne C57BL / 6 mus vejer ca 0,025 kg og en subkutan injektion på 0,15 ml per mus. Buprenorphin kan tilberedes i forvejen og gemt som prøver. Bemærk, at buprenorphin er en liste III kontrolleret stof, der kræver en DEA-licens og detaljeret opgørelse log.
- Forbered steril PBS med penicillin (100 E / ml) og streptomycin (100 mg / ml).
- Synkroniser estrus cykler ved at overføre urin-gennemblødt mandlige sengetøj til den kvindelige bure 72 timer inden induktion 15.
2. Forbered den kirurgiske område for levende dyr operation
- Forbered den kirurgiske område, som tidligere beskrevet 18.
- Forbered udarbejdelse området ved at beskrive elektriske klippere, oftalmologiske salve, og kirurgisk scrubs.
- Forbered den kirurgiske område ved at placere en recirkulerende varmt vand varmepude på den kirurgiske område for at opretholde kroppens temperatur under hele operationen. Placer en steril vandtæt pad over recirkulerende varmt vand varmepude. Arranger kirurgiske instrumenter, sutur, sterile glas petriskål, biopsi punch, steril gaze, sår klip og sår klip applikator på det sterile kirurgiske felt.
- Forbered opsving område ved at placere recirkulation varmt vand varmepuder halvvejs undis et tomt bur, så mus til at bevæge sig væk fra varmen, hvis dette ønskes.
3. Bedøver og forberede musen for kirurgi
- Man noterer vægten af musen og bestemme estrus scenen ved at evaluere vaginal cytologi.
- Til induktion af anæstesi, placeres musen i et tomt anæstesi kammer (tomme bur med fast låg indeholdende portal for isofluran). Tænd isofluran ikke-genåndingssystem anæstesisystemet og sæt vaporizer til 4% isofluran (med ilt flow på 0,5 til 1 l / min).
- Når musen er under anæstesi skifte isofluran flow til en kegle (30-60 ml sprøjte kappe) og placere musens næse og mund i keglen om forberedelse bordet. Tilstrækkelige anæstesi kan opretholdes med en lavere koncentration af isofluran i hele den resterende del af operationen (~ 2,5-3,5% isofluran). Passende dybde af anæstesi bør bestemmes af et negativt svar til tå knibe stimulus.
- Anvend oftalmologiske salve to undgå udtørring af øjnene under operationen.
- Ved hjælp af små elektriske klippere, kirurgi webstedet barbering.
- Desinficere og forberede operationsstedet med tre vekslende aflæser af chlorhexidin krat og 70% ethanol.
- Drapere dyr med en steril felt.
4. Uterin ligering
- Lav en lille (~ 1 cm) midterlinjen incision ved hjælp af enten en lille saks eller en skalpel kniv sluttede 0,5 til 1,0 cm rostralt for skedeåbningen.
- Indsæt lukket saksen ind i åbningen, således at vingerne er mellem kroppen væg og bugvæggen. Forsigtigt stump dissekere området omkring såret ved langsomt at åbne og lukke saksen sådan måde, at bugvæggen er tilstrækkeligt adskilt fra huden. Resterende synlige sammenvoksninger mellem bugvæggen og huden omkring incisionssted kan forsigtigt klippede. Ikke i tilstrækkelig grad stumpt dissekere de incisionssted vil gøre lukning af bugvæggen vanskeligere.
- Ved hjælp af små forceps, forsigtigt lokalisere venstre uterin horn. Livmoderen er dorsal til tarmen, hvilket er, hvad du ser, når vedkommende først at indtaste incisionssted. I nogle tilfælde er det nemmest først at lokalisere æggestokken og de tilknyttede æggestokkene fedt pad. Træk forsigtigt op på uterin horn og slide en åben tang nedenunder for at tjene som en retractor. Hvis det ønskes, vær opmærksom på udseendet af æggestokkene og livmoderen på dette tidspunkt for at få yderligere oplysninger om estrus scenen på induktion (Tabel 1).
- Skub forsigtigt to 6-8 cm stykker 5-0 sort flettet silke sutur (uden nål) under den strakte livmoderen horn.
- Sikker ligate hornet på utero-tubual krydset (lige caudale til æggelederen) og på utero-cervikale krydset (lige rostralt for livmoderhalsen) ved hjælp af en knude på hver lokalitet. Lad enderne af sutur for øjeblikket.
- Klip den del af livmoderen horn mellem de to ligations og placere vævet i et sterilt glas petriskål contalingen ~ 100 μL af PBS indeholdende penicillin (100 E / ml) og streptomycin (100 mg / ml). Skær enderne af silke sutur sidste. Hvis suturen løsner sig eller der er blødning, finde den stump, og binde en anden knude.
5. Forbered endometriotic implantater fra fjernet livmoderen
- Mens fjernet livmoderen er ved at blive manipuleret, dække maven med steril gaze og opretholde væskebalancen med steril PBS indeholdende penicillin og streptomycin efter behov.
- Strip den fjernet livmoderen horn af fedt.
- Hvis det ønskes, vejer den fjernet livmoderen horn.
- Åbn livmoder horn ved at stikke en kniv af en lille saks (14 mm bladlængde) ind i lumen, og forsigtigt at skyde den saksen ned i livmoderen hornet, mens du holder hornet med en pincet.
- I glasset petriskål, bruger en 2 mm biopsi punch til at skære tre lige store implantater.
6. Suturering endometriotic implantater i bughulen
- Placer Sterile gaze umiddelbart over incisionssted og grundigt våd med steril PBS indeholdende penicillin og streptomycin.
- Med små, forsigtigt glatte pincet finde coecum og flytte rostrally langs tyndtarmen. Træk en lille (4-5 cm) del af tarmen, der er mindst to arterier væk fra coecum og arrangere det som en fan på den præ-fugtede gaze, så den arterielle kaskade af den intestinale mesenterium er klart synlig. Vær sikker på at holde tarmen fugtig på alle tidspunkter med sterilt saltvand. Bemærk: Brug ikke rotte-tandede pincet, mens håndtering af tarmen.
- Brug 6-0 sorte ethilon sutur med en P-1, 11 mm, 3 / 8 cirkel, omvendt skærende nål til forsigtigt sutur et implantat til en arterie ca 0,5 cm fra tarmen.
- Bemærk: Tarmens mesenterium er dækket af et tyndt lag af bughinden. Vær omhyggelig med at lave en ren passere gennem dette lag, mens suturering omkring arterie. Træk suturen gennem langsomt og forsigtigt for ikke at rive bughinde eller brudarterien.
- Fuldføre to knob på et kast hver, og pas på ikke at stramme suturen meget hårdt, da dette kan resultere i tab af blodgennemstrømningen og efterfølgende nekrose af tarmen og død. Trim suturen inden for 2 mm af implantatet. Wet tarm igen for at fortsætte med at opretholde væskebalancen før man går videre til næste implantat.
- Bevæger sig i en rostralt retning, trækkes ud de næste 3-4 cm af tarmen og forsigtigt erstatte den sektion, der allerede indeholder et implantat. Springe en eller to arterier fra den tidligere implantatstedet og sutur den næste implantatet. Gentag for den tredje implantat.
- Udskift alle af tarmen i bughulen.
7. Sham operationer
- Sham operationer udføres ved hjælp af de samme trin som endometriose indgreb bortset fra at ingen væv er syet til tarmenes mesenterium.
- Excise venstre uterine horn som i trin 4.
- Endometriotic implantater (trin 5) er ikke forberedt på simuleret kirurgi. Denfjernet livmoder horn kan kasseres eller anvendes til andre formål, hvis det ønskes.
- Sutur, men ingen væv, er placeret omkring tre arterier i den arterielle kaskade af den intestinale mesenterium som i trin 6.
8. Lukning af kirurgiske sår
- Sørg for, at alle organer er omtrent tilbage til deres anatomiske position.
- Brug 5-0 belagt vicryl sutur i en ikke-sikringsanlæg kontinuerlig sting for at lukke bugvæggen.
- Brug 9 mm såret klip for at lukke huden.
9. Recover dyr
- Administrer 0,33 mg / ml buprenorphin til 0,15 ml/25 g mus ved subkutan injektion til en dosis på 0,2 mg / kg. Buprenorphin indgives postoperativt for at undgå yderligere kardiovaskulær / respiratorisk depression, der kan forlænge helingsprocessen.
- Forsigtigt tør musen med kimwipes eller køkkenrulle hvis det har fået vådt under operationen.
- Placer dyret ventrale nedad i bur partially oven på et recirkulerende opvarmet vand pad, indtil dyret er inddrevet, og har genvundet brystleje (inden for fem minutter, da de inhalationskapsler bedøvende hurtigt aftager).
10. Postoperativ pleje
- Mus skal observeres hver 15 minutter, indtil de er i stand til at opretholde brystleje, derefter hver time indtil de genvinder deres normale adfærd efter operationen.
- Mus skal vises normalt inden for 24 timer efter operationen. Mus skal overvåges dagligt i syv til ti dage for tegn på opsving og et godt helbred.
- Tegn på, at et dyr er i dårligt helbred, smerte eller lidelse omfatter nedsat aktivitet, selv-lemlæstelse, ungroomed udseende, eller krum stilling.
- Hvis et dyr ikke synes at være ved godt helbred inden for 24 timers operation, enten administrere buprenorphin (0,2 mg / kg) eller aflive dyret. Hvis dyret ikke bliver bedre inden for 8 timer af supplerende buprenorphin administration dyret skuldred aflives, fordi tarm nekrose er sandsynlig.
- Fjern sår clips 7-10 dage efter induktion.
- Fortsætte med at overvåge estrus cyclicity ved undersøgelse af vaginal cytologi for varigheden af eksperimentet. Synkroniser estrus cykler 72 timer før indsamlingen ved at overføre urin-gennemblødt mandlige sengetøj til den kvindelige bure som beskrevet i trin 1.3.
11. Obduktion og væv excision
- Timingen af obduktion er afhængig af den enkelte forskningsspørgsmål og drøftes yderligere i de repræsentative resultater og diskussion.
- Aflive musen ved kuldioxid kvælning.
- Saml blod ved hjerte-punktering med en 23 gauge nål på en 1ml sprøjte (hvis det ønskes).
- Saml en vaginal cytologi smear som beskrevet ovenfor for at bestemme estrus scenen på tidspunktet for indsamlingen 17.
- Skær de resterende livmoder horn på utero-tubal krydset og på livmoderhalsen, fedt fjerne, vejer, og processen somønskede (se 11,14 og 11,15).
- Find den sorte suturer omkring endometriotic læsioner. Foto intakt endometriotic læsioner, hvis det ønskes.
- Forsigtigt dissekere de sammenvoksninger omkring endometriotic læsioner med en lille saks og pincet og være omhyggelig med ikke at Lance læsioner. Arbejd hurtigt og omhyggeligt for at forhindre RNA nedbrydning.
- Måle og registrere længden og bredden af endometriotic læsioner med calipre.
- Udskaer endometriotic læsioner og sted på et stykke køkkenrulle fugtet med PBS. Fjern alle ikke-endometriotic væv fra læsioner. En dissektionsmikroskop eller lup stativ kan bruges til at støtte i dissektion.
- Afvej de tre væskefyldte endometriotic læsioner forud for fjernelse af sutur.
- Fjern forsigtigt sutur fra endometriotic læsioner.
- For histologi, en væske formalin fix fyldt endometriotic læsion i to timer efterfulgt af tre 30 minutter PBS vasker og endelig opbevaring in 70% ethanol. Dehydrer og paraffin integrere.
- Lance to af de endometriotic læsioner. Afvejes disse igen. Siden cykliske hormonelle forandringer kan ændre mængden af cyste væske, dette giver et mål for vævet våd vægt ud over vægten af cyste plus væske målt i 11.10.
- For RNA isolation og genekspression undersøgelser, homogenisere straks en af de skaaret endometriotic læsioner (eller ~ 20 mikrogram uterin væv) i lysering bindende løsning og opbevares ved -80 ° C til senere RNA isolering med RNAqueous kit (Ambion) eller en anden metode som ønskede.
- For fremtidige isolering af RNA, DNA eller protein, umiddelbart snap-fryse den anden skaaret endometriotic læsion (eller ~ 20 mikrogram uterin væv) i flydende kvælstof og opbevares ved -80 ° C.
Repræsentative resultater
Endometriotic læsioner i musemodel af kirurgisk induceret endometriose morfologisk og histologisk ligner dem observeret ikvinder. Histologisk analyse af endometriose hos både kvinder og mus model indikerer, at endometriotic læsioner indeholder endometrie kirtler og stroma (Figur 2A). Endometriotic læsioner i mus indeholder også hemosiderin-lastet makrofager, som er en fælles kendetegnende for endometriose hos kvinder (Figur 2B) 19.
Endometriotic læsioner fjernes fra mus tre dage efter induktion synes betændte og blødende (figur 3A). Efter to til fire uger af vækst endometriotic læsioner i musemodel er cyste-lignende, væskefyldte og omgivet af bughinde (figur 3B og 3C). Sammenlignet med læsion vægt på induktion, blev væskefyldt læsioner 306% og 862% større i den ene og to måneder efter induktion og skaaret læsioner var 51% og 172% større, henholdsvis (figur 4A og 4B). Vi har fået konsekvent væskefyldte og skaaret endometriotic læsion vægte på en måned efter induktion over fem forskellige eksperimenter (Figur 5). Til en måned efter ition væskefyldte (7,44 ± 3,75 mg) og skaaret (2,92 ± 1,23 mg) endometriotic læsion vægt var signifikant korreleret (Pearsons korrelationskoefficient = 0,669, p <0,001).
Age of musen påvirkede ikke læsion størrelse for mus mellem tre og ti måneder. Hverken væskefyldte eller skaaret endometriotic læsion vægt til en måned efter induktion var signifikant korreleret med dyrets alder (r = -0,136, p = 0,380 og r = -0,063, p = 0,698, henholdsvis).
Musen livmoderen undergår forandringer i størrelse, væskeophobning, celledeling og udseende på grund af påvirkning af steroid hormoner i løbet af estrus cyklus. Vi sammenlignede endometriotic læsion vægt til vægten af de resterende intakt livmoder horn fra dyr i forskellige estrus etaper. Vi kunne ikke finde en signifikant sammenhæng mellem uterus vægt og væskefyldte eller skaaret endometriotic lesion vægt på en måned efter induktion (r = -0,046, p = 0,765 og r = 0,232, p = 0,155, henholdsvis).
Den genekspression mønster observeret i endometriotic læsioner af mus tæt spejle, der rapporteret hos kvinder med sygdommen 5. Ved tre dage efter induktion gener, der regulerer ekstracellulær matrix remodellering, celle adhæsion og angiogenese er meget opreguleres og mange af disse gener forbliver opreguleres gennem en måned vækst.
Tal og tabeller
Figur 1. Kirurgisk induktion af endometriose ved autologus uterin væv overførsel i mus. Den venstre livmoderen horn er ligated, fjernet, og åbnet i længderetningen at eksponere endometriet. Tre 2 mm 2 biopsier er forberedt, og hver er syet til en arterie i den arterielle kaskade af tarmens mesenteRy. Med en måned efter induktion af endometriotic læsioner er væskefyldte og omgivet af sammenvoksninger.
Figur 2 Hematoxylin og eosin farvede udsnit af et endometrie læsion fra muse model af endometriose til en måned efter induktion viser (A) forekomst af endometrie kirtler og stroma;. Skalalinjen = 50 m og (B) hemosiderin-belæsset makrofager, hvoraf nogle er markeret med pile; skalalinjen = 20 μm.
Figur 3. Endometriotic læsioner i musemodel følgende dødshjælp, enten tre dage efter induktion (A) eller en måned efter induktion (B og C).
Figur 4. Endometriotic læsioner fra mus kirurgisk induceret til at have endometriosis blev skåret ud og vejet på en eller to måneder efter induktion. Data er gennemsnit ± SEM. Data er log transformeret og forskellige bogstaver angiver signifikans i hver panel af én-vejs ANOVA efterfulgt af ensidet Fishers mindste signifikante forskel Mulitple sammenligninger. (A) cyste kan lide, væskefyldt endometriotic læsioner (N = 10, 7 eller 5 til induktion, en måned eller to måneder efter induktion, henholdsvis). (B) skaaret endometriotic læsioner (N = 10, 8 eller 7 til induktion, en måned eller to måneder efter induktion henholdsvis).
Figur 5. Endometriotic læsion vådvægt med væske og skaaret til en måned efter induktion fra fem forskellige eksperimenter. Data er gennemsnit ± SEM. Mus N = 10, 6, 8, 7 og 7 for væskefyldte læsioner og 0, 7, 10, 8 og 8 for skaaret læsioner i eksperiment 1, 2, 3, 4 og 5, hhv.
Tabel 1. Observation af Estrus Stage ved vaginal cytologi og udseendet af æggestokke og livmoder og induktion.
Udseende af æggestok og livmoder vil være tidsafhængig. Det følgende er baseret på at ofre omkring 8:00 om morgenen af hver cyklus dag. Desuden observationer er subjektive og sammenligne æggestok og livmoder horn vil være et bedre estimat end uterin horn alene. Disse observationer er beregnet til at supplere oplysningerne fra daglige vaginal cytologi behandlinger.
Tabel 2. Sammenligning af kirurgi i mus og rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske parametre, der bør bemærkes, mens de udfører de kirurgiske induktion af endometriose hos mus. Først endometriose er en østrogenafhængige sygdom, og som sådan denne operation skal udføres i intakte dyr eller alternativt i ovariectomized dyr suppleret med østrogener 20. For det andet skal suturering endometrie biopsier til arterielle kaskade udføres med største omhu. Vi har konstateret, at med kun to forholdsvis løs knob med én smide hver holder biopsi på plads, og samtidig forhindre ligatur af blodforsyningen til tarmen og efterfølgende vævsnekrose og dyrs død. Vi anbefaler kraftigt at øve på flere mus forud for den faktiske eksperiment at sikre, at suturerne er placeret sikkert nok, at vævet ikke går tabt, men ikke for stramt, at den forvolder tarm nekrose. For det tredje er det meget vigtigt at holde tarmen væv hydreret med steril PBS indeholdende penicillin og streptomycin i løbet af surgery. For det fjerde bestræbelser bør tages skridt til at sikre, at endometriotic implantat størrelse er konsistent. Til dette formål bruger vi en 2 mm biopsi punch til at skabe konsekvent mellemstore endometriotic implantater fra skåret uterin væv.
Der er flere ændringer, der kan gøres for at denne protokol så de passer til individuelle behov og videnskabelige spørgsmål forskeren. Én potentiel ændring vedrører den hormonelle profil af dyret. Gen og protein udtryk i endometriotic læsioner, resterende intakt uterus horn og immunsystemet kan være direkte påvirket af timingen af kollektionen i forhold til de estrus cyklus scenen. Der er flere tilgange til kontrol for estrus scenen på tidspunktet for indsamlingen, hver med sine egne fordele og ulemper. For eksempel kan intakt, cykling dyr skal synkroniseres ved at overføre urin-gennemblødt mandlige sengetøj i den kvindelige buret tre dage før induktion eller opkrævning sådan, at dyrene er kirurgisk INDUCED og indsamlet i løbet af samme estrus fase 15. Hvis intakt cykling dyr er anvendt, skal estrus cyclicity monitoreres dagligt ved undersøgelse af vaginal cytologi 17. Dette har den fordel at være mere fysiologisk relevante, men at opnå cyklus synkronicitet er ikke 100% vellykket. Alternativt kunne intakt dyr, der skal synkroniseres ved eksogene gonadotropin administration 21,22. Mens noget mere præcist, skaber denne metode højere østrogen niveau end normalt. En anden tilgang har været at ovariectomize dyr og give tilbage et konstant niveau af eksogene hormoner enten gennem en silastic kapsel, mini-osmotisk pumpe, eller daglige indsprøjtninger 4,8. Denne metode har den fordel, at opnå en ensartet hormon profil på tværs af mange dyr, men det er til ulempe, fordi dyrene ikke er cykling.
Sham operationer kan udføres for at vurdere, hvilke effekter er resultatet af under operationen sammenholdt med virkningen attributable til endometriose. I simuleret operationer venstre livmoderens horn er fjernet og suturer er placeret rundt omkring i arterier i det arterielle kaskade af den intestinale mesenterium men ingen endometriotic implantater er sutureres 5,8,23. Alternativt kan fedt fjernes fra fjernet livmoderen hornet være sutureres til tarmenes mesenterium 3,14. Vi har for nylig rapporteret, at der er relativt få forskelle i genekspression som målt ved cDNA microarray mellem humbug livmoderen og den intakte tilbageværende livmoder horn fra dyr kirurgisk induceret at have endometriose 5. Desuden bruger kvantitativ real-time PCR for syv endometriose-relaterede gener, fandt vi, at det kun haptoglobin udtryk var signifikant forskellig i de uteri af shampoo og endometriose mus. Lee et al. Imidlertid rapporterede differentieret ekspression af fem gener i livmoderen fra mus induceres til at have endometriose i forhold til sham kontrol 23. Dette tyder på, at tilstedeværelsen af endometriotic lesions kan forårsage ændret genekspression i eutopic livmoderen.
Tidspunktet for indsamling af mus kirurgisk induceret at have endometriose bør afgøres af den særlige problemstilling. Indsamling af mus tre dage efter induktion gør det muligt at vurdere de kritiske, tidlige begivenheder i etableringen af endometriose herunder den oprindelige neutrofil og machrophage infiltration og cytokin produktion som er blevet rapporteret tidligere 8. Vi har vist, at endometriotic læsioner indsamlet tre dage efter induktion er små, hemorraghic, og har markant ændret genekspression i forhold til de resterende uterin horn 4. Ved to uger efter induktion endometriotic læsioner er veletablerede og har ofte dannet cyste-lignende strukturer. I mus, fortsætter endometriotic læsioner at vokse i størrelse, som vurderet af vægten af de fyldte væske og skaaret læsioner (Figur 4) samt ved læsion volumen bestemmes af længde, bredde og height målinger gennem to måneder efter induktion 9.
Som nævnt ovenfor blev den kirurgiske model af endometriose først udviklet i rotter og er stadig flittigt brugt 3. Når du udfører denne operation i rotter vi foretage følgende ændringer til protokollen, som er sammenfattet i tabel 2. Hos rotter, er alle af den anvendte suturer 4-0 størrelse og kan og bør være bundet mere stramt. Desuden har vi sutur seks 5 mm 2 endometriotic implantater ind i tarmen mesenterium fra bughulen.
I denne protokol beskriver vi brug af en inhaleret bedøvelsesmiddel, isofluran. Alternativt, kombineret injicerbare bedøvelse består af ketamin og Domitor (medetomidinhydrochlorid) eller en anden alpha-2-agonist kan bruges, selv om restitutionstid er noget længere. Ketamin, administreret ved 75 mg / kg ved intraperiotneal injektion, er en dissociativ narkosemiddel med minimal akut smertestillende Properties And er en liste III stof, der kræver en DEA-licens og detaljeret stof opgørelse. Domitor, administreret ved 1 mg / kg, er en alfa-2-adrenerg agonist, og er let vendes med Antisedan (atipamezolhydrochlorid) administration. Domitor er et beroligende middel, der giver muskel afslapning og smertelindring. Domitor og ketamin kan være forberedt i god tid i kombination med PBS ved hjælp af steril teknik. Antisedan, ved baglænskørsel agent for Domitor, kan tilberedes i PBS i kombination med buprenorphin og bør administreres på 1 mg / kg efter operationen. Buprenorphin er også en liste III stof og alternative finansieringsmetoder omfatter non-steroide anti-inflammatoriske banamine (Flunixin meglumin) og ketoprofen.
Som med alle modeller der er visse begrænsninger forbundet med den kirurgiske induktion af endometriose hos gnavere. Først og fremmest er, at gnavere ikke har en menstruationscyklus, og derfor ikke spontant udvikler endometriose. I et forsøg på at gøre gnaver modEl mere fysiologisk ligner tilstanden hos mennesker nogle forskere har valgt at injicere autolog eller homologe uterin væv fragmenter fra syngenic dyr ind i bughulen direkte uden suturering 24,25. Hos mus, danner injicerede væv cyste-lignende endometriotic læsioner, dog forudsat injektion metode til induktion ikke ud til at arbejde i rotter som vævet undlader at vedhæfte og invadere i bughulen 3.
Den gnaver model har været flittigt brugt til at studere ætiologi, patologi, og risikofaktorer for endometriose 2,8,26-29 samt til at udforske nye lægemidler 14,30-34. Den gnaver model af kirurgisk induceret endometriose viser mange ligheder med sygdommen hos mennesker, herunder nedsat fertilitet og frugtbarhed og ændrede gen og protein udtryk 5,6,35,36. Taget sammen med deres relativt lave omkostninger og klar tilgængelighed, de gnaver model af kirurgisk INDUCED endometriose er en fremragende model for endometriose hos kvinder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Særlig tak til Chris Kassotis og Audrey Bailey til kritisk revision af dette manuskript og til Dr. Scott Korte, Joseph Beeman, Alison Curfman, Paul Kimball, Bridget Neibreggue, Jacob Redel, Amy Schroder, Maija Steinberg, og Stacey Winkeler for deres assistance i optimering af denne model i vores laboratorium. Finansieringen kom fra Klinisk Biodetectives Training Grant (NIH T90) (KEP), University of Missouri Life Sciences Undergraduate Research Muligheder Program, MU Forskningsråd, MU Research Board tilskud og NIH R21HD056441 (SCN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax pencil | Fisher Scientific | NC9954135 | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-433 | |
| Eyedropper | Fisher Scientific | S79383 | |
| Standard light microscope for evaluating vaginal cytology smears | |||
| Buprenorphine HCL c3 (CARJET) 10X1ml | Butler Animal Health Supply | 022891 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14040-117 | |
| 10,000U/ml Penicillin, 10,000μg/ml Streptomycin in 0.85% NaCl | Hyclone | SV30010 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane non-rebreathing anesthetic system | |||
| Recirculating hot water heating pad | |||
| 30 ml syringe sheath | Fisher Scientific | 14-823-16G | |
| Powder free sterile gloves | Fisher Scientific | 19020558 | |
| Ophthalmic ointment | Major Pharmaceuticals | 10033691 | |
| Small electrical clippers | Wahl Clipper Corp. | 9861-600 | |
| Chlorhexidine scrub | Fisher Scientific | NC9863042 | |
| 70% Ethanol | |||
| Polylined sterile field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Size 3 scalpel | Fisher Scientific | 22-079-657 | |
| Number 10 scalpel blades | Fisher Scientific | 22-079-681 | |
| Small surgical scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5850 | |
| Small serrated semi-curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 5-0 black braided silk suture | Ethicon Inc. | K870H | |
| Sterilized pyrex glass Petri dishes | Corning | 70160-101 | |
| 2 mm biopsy punch | Miltex Inc. | 33-31 | |
| Sterile gauze | Kendall | 1806 | |
| 6-0 black monofilament ethilon nylon suture | Ethicon Inc. | 697G | |
| Needle drivers (optional) | World Precision Instruments, Inc. | 500023 | |
| 5-0 undyed braided coated vicryl suture | Ethicon Inc. | J490G | |
| 9mm Autoclip wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Autoclip applier & remover | BD Biosciences | 427630 | |
| 23G needle | BD Biosciences | 305193 | |
| 1cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 5X magnifying glass stand (optional) | Fisher Scientific | 14-648-23 | |
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Calipers | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6466 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 15-197-700A | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| RNAqueous RNA isolation kit | Ambion | AM1912 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Snap cap microcentrifuge flat top tube | Fisher Scientific | 02-681-240 | |
| Ketamine (optional) | Sigma-Aldrich | K4138 | |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) (optional) | Tocris Bioscience | 2023 | |
| Antisedan (atipamezole) (optional) | Sigma-Aldrich | A9611 |
References
- Simoens, S., Hummelshoj, L., D'Hooghe, T. Endometriosis: cost estimates and methodological perspective. Hum. Reprod. Update. 13, 395-404 (2007).
- Grummer, R.
- Vernon, M. W., Wilson, E. A. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat. Fertil. Steril. 44, 684-694 (1985).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Induction of endometriosis in mice: a new model sensitive to estrogen. Reprod. Toxicol. 9, 233-238 (1995).
- Pelch, K. E. Aberrant gene expression profile in a mouse model of endometriosis mirrors that observed in women. Fertil. Steril. 93, 1615-1627 (2010).
- Flores, I. Molecular profiling of experimental endometriosis identified gene expression patterns in common with human disease. Fertil. Steril. 87, 1180-1199 (2007).
- Giudice, L. C., Kao, L. C.
- Lin, Y. J., Lai, L. ei, Y, H., Wing, L. Y. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 147, 1278-1286 (2006).
- Fang, Z. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil. Steril. 82, 673-678 (2004).
- Fang, Z. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 3460-3466 (2002).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L., Birnbaum, L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: time-dose dependence and species comparison. Toxicol. Appl. Pharmacol. 138, 131-139 (1996).
- Foster, W. G. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: application to toxicology. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75, 1188-1196 (1997).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effect of surgically induced endometriosis on pregnancy and effect of pregnancy and lactation on endometriosis in mice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 212, 332-337 (1996).
- Lu, Y., Nie, J., Liu, X., Zheng, Y., Guo, S. W. Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor, reduces lesion growth and hyperalgesia in experimentally induced endometriosis in mice. Hum. Reprod. 25, 1014-1025 (2010).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitten, W. K., Bronson, F. H., Greenstein, J. A. Estrus-inducing pheromone of male mice: transport by movement of air. Science. 161, 584-585 (1968).
- Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth. Defects. Res. B. Dev. Reprod. Toxicol. 80, 84-97 (2007).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586-e2586 (2011).
- Moen, M. H., Halvorsen, T. B. Histologic confirmation of endometriosis in different peritoneal lesions. Acta. Obstet. Gynecol. Scand. 71, 337-342 (1992).
- Cummings, A. M. Methoxychlor as a model for environmental estrogens. Crit. Rev. Toxicol. 27, 367-379 (1997).
- Fowler, R. E., Edwards, R. G. Induction of superovulation and pregnancy in mature mice by gonadotrophins. J. Endocrinol. 15, 374-384 (1957).
- Wilson, E. D., Zarrow, M. X. Comparison of superovulation in the immature mouse and rat. J. Reprod. Fertil. 3, 148-158 (1962).
- Lee, B., Du, H., Taylor, H. S. Experimental murine endometriosis induces DNA methylation and altered gene expression in eutopic endometrium. Biol. Reprod. 80, 79-85 (2009).
- Somigliana, E. Endometrial ability to implant in ectopic sites can be prevented by interleukin-12 in a murine model of endometriosis. Hum. Reprod. 14, 2944-2950 (1999).
- Hirata, T. Development of an experimental model of endometriosis using mice that ubiquitously express green fluorescent protein. Hum. Reprod. 20, 2092-2096 (2005).
- Story, L., Kennedy, S. Animal studies in endometriosis: a review. Ilar. J. 45, 132-138 (2004).
- Cummings, A. M., Hedge, J. M., Birnbaum, L. S. Effect of prenatal exposure to TCDD on the promotion of endometriotic lesion growth by TCDD in adult female rats and mice. Toxicol. Sci. 52, 45-49 (1999).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effects of estrogen, progesterone, and methoxychlor on surgically induced endometriosis in rats. Fundam. Appl. Toxicol. 27, 287-290 (1995).
- Sharpe-Timms, K. L. Endometriotic lesions synthesize and secrete a haptoglobin-like protein. Biol. Reprod. 58, 988-994 (1998).
- Yavuz, E., Oktem, M., Esinler, I., Toru, S. A., Zeyneloglu, H. B. Genistein causes regression of endometriotic implants in the rat model. Fertil. Steril. 88, 1129-1134 (2007).
- Dmitrieva, N.
- Efstathiou, J. A. Nonsteroidal antiinflammatory drugs differentially suppress endometriosis in a murine model. Fertil. Steril. 83, 171-181 (2005).
- Becker, C. M. Endostatin inhibits the growth of endometriotic lesions but does not affect fertility. Fertil. Steril. 84, Suppl 2. 1144-1155 (2005).
- Becker, C. M. Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and endometriosis in a mouse model. Fertil. Steril. 85, 71-77 (2006).
- Sharpe-Timms, K. L. Using rats as a research model for the study of endometriosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 955, 318-327 (2002).
- Stilley, J. A., Woods-Marshall, R., Sutovsky, M., Sutovsky, P., Sharpe-Timms, K. L. Reduced Fecundity in Female Rats with Surgically Induced Endometriosis and in Their Daughters: A Potential Role for Tissue Inhibitors of Metalloproteinase 1. Biol. Reprod. 80, (2009).
