Summary
الجهاز الميكعي (VNO) بالكشف عن اشارات كيميائية إختلافات بين الأنواع التي تنقل المعلومات الاجتماعية والإنجابية. لقد أجرينا تجارب التصوير + CA2 الفئران المعدلة وراثيا باستخدام تعبير عن G - CaMP2 في الأنسجة VNO. هذا الأسلوب يتيح لنا لتحليل أنماط استجابة معقدة من الخلايا العصبية الميكعي لأعداد كبيرة من المحفزات فرمون.
Abstract
الجهاز الميكعي (VNO) بالكشف عن إشارات حسي كيميائي التي تحمل معلومات عن الحالة الاجتماعية والجنسية والإنجابية للأفراد داخل 1،2 نفس النوع. هذه الإشارات إختلافات بين الأنواع ، والفيرومونات ، فضلا عن إشارات من بعض الحيوانات المفترسة 3 ، تنشيط الخلايا العصبية الحسية الميكعي (VSNs) مع مستويات عالية من الدقة والحساسية 4. وأعرب ما لا يقل عن ثلاث عائلات مختلفة من المستقبلات بالإضافة G - البروتين ، V1R ، وV2R FPR 14/05 ، في الخلايا العصبية VNO للتوسط في الكشف عن العظة حسي كيميائي. أن نفهم كيف يتم ترميز المعلومات من قبل فرمون VNO ، من المهم جدا لتحليل الأوضاع VSNs استجابة الفرد للمؤثرات المختلفة والتعرف على المستقبلات الخاصة التي تتوسط هذه الاستجابات.
يتم تضمين neuroepithelia من VNO في زوج من العظام الميكعة. هيكل شبه أعمى أنبوبي واحد من VNO نهاية مفتوحة (القناة الميكعي) الاتصالتجويف الأنف. VSNs تمديد التشعبات على جزء من التجويف VNO ، حيث العظة فرمون على اتصال مع المستقبلات التي أعرب عنها في المقابض شجيري. الهيئات خلية من VSNs شكل شبه طبقية طبقات مع V1R V2R وأعرب في الطبقات القاعدية وقمية على التوالي 6-8. وقد تم استخدام عدة تقنيات لرصد ردود VSNs للمؤثرات الحسية 4،12،15-19. من بين هذه التقنيات ، وإعداد شريحة الحاد يوفر مزايا عدة. الأولى ، بالمقارنة مع 3،17 VSNs فصلها ، والأعمال التحضيرية شريحة حفاظ على الخلايا العصبية في التشكل وطنهم والتشعبات للخلايا البقاء متماسكا نسبيا. الثانية ، والهيئات خلية من VSNs يمكن الحصول عليها بسهولة في شريحة الاكليلية من VNO للسماح للدراسات وتجارب التصوير الكهربية بالمقارنة مع ظهارة كله وكامل الاستعدادات لشن 12،20. الثالثة ، يمكن الجمع بين هذه الطريقة مع تقنيات الاستنساخ الجزيئي للسماح بتحديد مستقبل.
تثير الحواس كا 2 + تدفق قوي في VSNs ذلك يدل على تنشيط مستقبلات 4،21. نحن نطور بالتالي الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن G - CaMP2 في الخلايا العصبية الحسية الشمية ، بما في ذلك VSNs 15،22. حساسية وطبيعة وراثية للمسبار يسهل إلى حد كبير كا 2 + تجارب التصوير. وقد ألغت هذه الطريقة عملية التحميل الصبغة المستخدمة في الدراسات السابقة 4،21. نحن نوظف أيضا نظام التسليم التي تمكن من تطبيق يجند من المحفزات المختلفة لشرائح VNO. مزيج من الطريقتين يسمح لنا لرصد الخلايا العصبية متعددة في نفس الوقت استجابة لأعداد كبيرة من المحفزات. أخيرا ، أنشأنا خط أنابيب التحليل شبه الآلي لمساعدة ومعالجة الصور.
Protocol
1. إعداد الحل
- إعداد R1 10X ، R2 R3 10X 10X والحلول وفقا للجدول.
R1المواد الكيميائية ميغاواط (ز / مول) مم (1X) 10X الأسهم (ز / لتر) كلوريد الصوديوم 58.44 125 73.05 بوكل 74.55 2.5 1.86 MgCl 2 1 M الأسهم 1 10 مل CaCl 2 · 2H 2 O 147.02 2 2.94 ناه 2 ص 4 · H 2 O 137.99 1.25 1.72
R2مادة كيميائية ميغاواط (ز / مول) مم (1X) 10X الأسهم (ز / لتر) NaHCO 3 84.01 25 21
R3المواد الكيميائية ميغاواط (ز / مول) مم (1X) 10X الأسهم (ز / لتر) كلوريد الصوديوم 58.44 125 73.05 بوكل 74.55 2.5 1.86 MgCl 2 1 M الأسهم 2 20 مل CaCl 2 · 2H 2 O 147.02 2 2.94 HEPES 1 M الأسهم 5 50 مل - جعل 1 ليتر من السائل الدماغي الشوكي الماوس الاصطناعي (mACSF) في اليوم من التجربة عن طريق خلط 100 مل من R1 10X و 100 مل من R2 10X في الماء المقطر مزدوجة (أحواض دبي الجافة العالمية) ، والإعلاند 1.8 غرام من سكر العنب (النهائي 10 ملم). هذا الأسلوب إعداد يمنع الكالسيوم كربونات هطول الأمطار في درجة الحموضة العالية. والأسمولية mACSF من حوالي 310-315 mOsm / لتر. ضبط الأسمولية مع سكر العنب أو الماء إذا لزم الأمر. تهوية الحل مع Carboxygen الغاز (95 ٪ أكسجين و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون) على الأقل قبل 30 دقيقة من ضبط درجة الحموضة من حل 7،2-7،4.
- جعل 1 ليتر من محلول رينغر في يوم من التجربة عن طريق خلط 100 مل من R2 10X و 100 مل من R3 10X في أحواض دبي الجافة العالمية ، وإضافة 1.8 غرام من سكر العنب (10 ملم). ينبغي أن الأسمولية ودرجة الحموضة من حل رينغر تكون مشابهة لتلك التي mACSF. تهوية الحل مع Carboxygen الغاز.
- إعداد 4 ٪ انخفاض ذوبان agarose (LMA) في أي حل أو mACSF رينغر. قسامة agarose وذاب في أنابيب إيبندورف وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. LMA ، التي تتألف من السكاريد المنقى ، يبقى السائل عند 37 درجة مئوية ، ويتصلب بسرعة في درجة حرارة أقل من 25 درجة مئوية. هذه الخصائص تجعله مثاليا لتضمين VNيا والعيش فيزيولوجيا الأنسجة. المواد النجسة أخرى ، مثل أجار ، لا ينبغي أن يكون الخيار لتجربة الأنسجة الحية والمكونات uncharacterized قد تتداخل مع استجابة الخلايا العصبية.
- تحضير المحفزات فرمون في محلول رينغر. عن البول الماوس ، 1:100 تخفيف تثير ردود قوية.
2. إعداد شريحة VNO
- قبل التضحية الحيوانية ، ووضع أنبوبين من LMA على كتلة الحرارة وضبط درجة الحرارة إلى> 60 درجة مئوية لإذابة agarose. مرة واحدة في جل إسالته ، ونقل الأنابيب إلى كتلة الحرارة ° 37 مئوية.
- قطع رأس ماوس G - CO 2 CaMP2 التالية القتل الرحيم. قطع عظام الفك السفلي مع المقص لإزالة الفك السفلي. انزع مخدد أنسجة الحنك العلوي لكشف التجويف الأنفي (الشكل 1A). فصل عظام الفكين عن طريق إدخال شفرة جراحية بين القواطع اثنين من الجبهة. إزالة بعناية عظام الفكين لفضح VNO. عند هذه النقطة ، يمكن رفع VNO كله صعودا من نالعسل تجويف من خلال عقد على عظم الذيل (الشكل 1B). نقل VNO حل للبرد mACSF الاوكسيجين على الفور.
- تحت نطاق التشريح ، فصل اثنين من VNOs به غيض من ملقط 5 # الشريحة بلطف على طول الجدار الحاجز للعظم (الشكل 1C). قشر بعيدا العظام الميكعة أن يغلف النسيج VNO. رفع بلطف الأنسجة VNO بأكمله من تجويف العظام. يجب توخي الحذر الشديد في هذه الخطوة لا يلحق الضرر الظهارة العصبية. ويجب إزالة بقايا عظام صغيرة تركت على سطح الأنسجة تماما قبل التضمين. يمكن اصطيادها شظايا اليسار على الأنسجة من قبل شفرة القطع لسحب النسيج للخروج من كتلة agarose.
- استخدام ملقط لعقد نهاية الخلفي من النسيج VNO ويغرق برفق في agarose ذاب (1D الشكل). يبرد بسرعة الأنبوب على الجليد لترسيخ agarose. ينبغي لعملية التضمين والتبريد يستغرق أقل من 2 دقيقة.
- VF300 تقطيع الأنسجة (INSTR Precisionaryيستخدم uments ، غرينفيل ، كارولينا الشمالية) لجعل المقاطع. خفض كتلة agarose تحتوي على VNO في الشكل والغراء لصاحب الأنسجة (الشكل 1E وواو). إدراج حامل الأنسجة في اسطوانة معدنية وتملأ الغرفة المتبقية مع LMA إضافية. مرة واحدة في LMA يتصلب على الجليد ، والمضي قدما لsectioning على الفور. العرض mACSF الاوكسيجين الى غرفة باردة sectioning والبدء في قطع سمك 180-200 ميكرون لكل شريحة. ضبط سرعة النهوض وتواتر الاهتزاز بحيث لا يتم ضغط أنسجة خلال sectioning وVNO لا تسقط من agarose. جمع ونقل شرائح مقطوع إلى غرفة الحضانة mACSF (الشكل 2A). الشرائح قابلة للبقاء لمدة 6-8 ساعات في mACSF الاوكسيجين في درجة حرارة الغرفة. الشكل 2B C وعرض الصور ومدينة دبي للإنترنت 2 الفوتون شريحة VNO G - CaMP2 ، على التوالي.
3. مجموعة التصوير الغرفة حتى
- ضع شريحة VNO في منتصف نضحالغرفة (Siskiyou والمنح باس ، أو) ، والاستمرار على شريحة أسفل مع شريحة مرساة (وارنر الآلات ، حمدان ، CT) (الشكل 3A). ينبغي أن خيوط الربط الصحافة فقط ضد جزء من شريحة LMA لكن ليس النسيج VNO. يتم تسليم mACSF الاوكسيجين الى الغرفة من خلال منفذ نضح في مدخل ~ 100 ثانية / ميكروليتر ويتم تصريف السائل من خلال إبرة شفط عبر منفذ منفذ لتوفير تدفق مستمر من mACSF الطازجة (الشكل 3A وباء).
- ملء محقنة 30 مل مع حل رينغر والمشبك الى ضخ حقنة (نيو أنظمة مضخة عصر ، فارمنجديل ، نيويورك). تعيين سرعة مضخة ل300-600 ميكروليتر / دقيقة لتوفير تدفق مستمر من محلول رينغر على شريحة (الشكل 3C).
- توصيل منفذ للفي رينغر إلى حلقة حقن HPLC (Chromtech ، أبل فالي ، MN) (الشكل 3D). يمكن تحديد حجم حلقة مختلفة لمراقبة دقيقة من حجم يجري تسليمها. نحن نستخدم حلقة 20 ميكرولتر في ساور التجارب. التحكم حلقة الحقن وطرق تدفق اثنين (الشكل 3E). في موقف "تحميل" ، يمكن تحميل العينات في حلقة العينة مع حقنة الدقة هاملتون. مخارج عينة الزائدة في الحلقة من خلال منفذ عينة من النفايات. حل رينغر بواسطة مضخة حقن حقنة يتجاوز حلقة العينة ويذهب مباشرة إلى منفذ ، وهذا مرتبط إلى الطرف نضح (الشكل 3A و E). في موقف "الحقن" ، والحل ضخ التدفقات خلال الحلقة العينة ودفع محفزات بمأخذ التيار الكهربائي (الشكل 3E). قبل تجربة التصوير ، ينبغي فقاعات الهواء طردوا لضمان التدفق السلس للنضح السوائل. ويمكن أيضا تجارية أخرى أو العرف أنظمة حقن أدلى تنفذ لتقديم الحوافز.
- ضبط غيض نضح تحت عدسة 5X أو 10X بحيث غيض حوالي 1 ملم بعيدا عن شريحة VNO.
- عندما نضح نظام الجديد هو الإعداد ، فإنه من المستحسن لقياس الوقت وتأخير عينة الدرأوجه مع صبغة الفلورسنت. تحميل 0.1 ٪ صبغة رودامين 6G في حلقة العينة وتبديل صمام لحقن الموقف في 5 ثوان بعد بدء الحصول على الصور (الشكل 3F). يتم الكشف عن إشارة الفلورية بين 10-30 ثانية. منحنى سلس للإشارة الفلورسنت يشير ايضا الى ان هناك القليل الاضطراب ولدت تحت عدسة غمس والتي نضح كافية من الاوكسيجين mACSF تصل إلى شريحة.
4. الفاصل الزمني التصوير
- نستخدم AxioSkope زايس FS2 المجهر مع 10X 20X أو عدسة المياه غمس للتصوير مرور الزمن. يستخدم معيار GFP ممر الموجة فلتر (450 490nm) لG - CaMP2 الاشارات. يتم الحصول على الصور بواسطة كاميرا epifluorescent CCD (HRM زايس) مع 1X1 أو 2X2 binning اعتمادا على مستويات التعبير عن G - CaMP2.
- تعيين سرعة اكتساب الإطار إلى 1 في الثانية الواحدة. ضبط كثافة الضوء لتقليل تبييض الإشارات G - CaMP2 والضرر الصورة إلى الخلايا. لكل السابقينperiment ، ونحن اكتساب عادة كدسة 60 صورة الإطار (~ 60-70 ثانية). تبديل الصمام لموقف الحقن في نقطة زمنية محددة (على سبيل المثال ، 5 الثانية في الشكل 3F) لمجموعة واحدة من الحصول على تجربة زمنية متسقة في جميع المحاكمات.
- إجراء تشغيل اختبار باستخدام حل رينغر كما التحفيز. إعادة ضبط الإعداد نضح إذا أدخل قطعة أثرية الحركة خلال حقن العينة.
- إجراء مراقبة إيجابية تشغيل الماوس مع البول المخفف في 1:100 في محلول رينغر. النموذجية القصوى ΔF / F قيمة G - CaMP2 ردا على البول الماوس نحو 20-40 ٪. إذا لزم الأمر ، يمكن للمرء التأكد من صلاحية شريحة من خلال تقديم 10 ملم في بوكل في رينغر لتحفيز شرائح في نهاية التجارب.
- غسل حقنة هاملتون في حل رينغر ثلاث مرات على الأقل بعد تحميل one التحفيز. غسل حلقة العينة بمحلول رينغر ثلاث مرات على الأقل بين المنبهات المختلفة. هذه الخطوات منع التلوث المتبادل بين احعينات NT.
- انتظر 40-10 دقيقة لVSNs لاسترداد التحفيز قبل تطبيق المقبل.
5. تحليل البيانات
- أداء تسجيل صورة من الصور تم الحصول عليها من كل شريحة واحدة. نستخدم النصي VBA العرف مكتوب في AxioVision (كارل زايس ، وأمريكا الشمالية) لأتمتة هذه العملية. يتم تسجيل جميع إطارات الصور داخل التجربة نفسها ضد الإطار المرجعي المشترك مع تسجيل مرونة اختيار الشكل (4A). مرونة التصنيع ، المعروف أيضا باسم التصنيع غير الخطية ، هي فئة من تقنية التصنيع صورة التأكيد على التحول من صورة الهدف غير جامد إلى صورة مرجع. المستخدمة هنا فإننا من تنفيذ AxioVision.
يتم اختيار هذا الإطار الإشارة بصورة تعسفية من مداخن الصورة. - صورة تنفيذ الطرح لتحديد الخلايا الاستجابة. نحن نستخدم وحدات الماكرو المخصصة مكتوب في ImageJ v1.42 ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ، المعاهد الوطنية للصحةفي بيثيسدا ، دكتوراه في الطب) لأتمتة هذه العملية. يتم إنشاء صورة إسقاط الحد الأدنى لكل المكدس. خلايا الاستجابة تظهر بعد طرح إسقاط الحد الأدنى من مداخن الخام (الشكل 4B).
- تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) من مداخن طرح والحصول على عائد الاستثمار باستخدام إحداثيات متعدد قياس المساعد من ImageJ. معالجة كافة كدسات لتجربة واحدة وحفظ جميع ROI الإحداثيات في قائمة رئيسية دوروا (4C الشكل).
- استخدام قائمة رئيسية لقياس العائد على الاستثمار ردود خلية من مداخن صورة الخام مع العرف مكتوب الماكرو ومتعدد قياس المساعد من ImageJ (الشكل 4D). منحنيات الاستجابة المؤامرة وheatmap في Matlab (Mathworks شركة ، ناتيك ، MA).
6. ممثل النتائج
ويرد مثال للتجربة التصوير VNO باستخدام عينات البول التي تم جمعها من أربعة الفئران الفردية في الشكل 5. شريحة يستجيب لتحفيز البول مع ع متنوعةatterns التنشيط. ويتم تحديد الخلايا نحو 80 ردا على عرض ما لا يقل عن واحد من المحفزات البول واستجابتها ΔF / F يتم رسم القيم في heatmap (الشكل 5A). يتم رسم اثار رد فعل خلايا 1 و 2 و 3 في الشكل 5B تبين تفعيل دوام المحفزات التي البول. الخلية 1 يعرض ردا على كل من عينات البول الإناث ولكن ليس على عينات من الذكور ، في حين أن الخلية 2 يبين عكس أنماط التنشيط ويستجيب إلى كل من عينات الذكور فقط. يتم تنشيط الخلية 3 عينات فردية من جانب كل من الذكور والإناث. الخلايا 1 و 2 استجابة لمنبهات تظهر سمات محددة الجنس في البول 15.
الرقم 1 من التوضيح تخطيطي عملية تشريح VNO ألف الموقع التشريحي للVNO في الرأس الماوس. وقد تم تشريح رئيس ماوس G - CaMP2 وضعت رأسا على عقب مع ر الناعمةقضية إزالة من الحنك لفضح VNO. مدخل يظهر صورة الفلورسنت من الصورة نفسها. وneuroepithelia من VNO خضراء زاهية. باء رأي الجانب من VNO المعزولة التي تم تضمينه في العظام الميكعة (أعلى) وصورة من الفلورسنت VNO نفسه (القاع). جيم رأي الاكليلية من VNO والتشريح العملية. يتم فصل واحد VNO من الحاجز ، ويمكن بعد ذلك تتم إزالة العظام الميكعة لإخراج الظهارة العصبية. D. VNO مضمن في LMA. E. يتم لصقها كتلة مضمنة لصاحب الأنسجة لsectioning. حامل متقدمة في النسيج 180-200 ميكرون في دفع شريحة كتلة agarose للخروج من المعدن لsectioning برميل. يتم وضع شفرة القطع على نحو وثيق برميل معدني. واو عرض جانب من جوانب النظام تقطيع الأنسجة VF300. BV ، الاوعية الدموية. NE ، الظهارة العصبية.
الشكل 3 شكل توضيحي لإعداد النظام نضح ألف ألف غرفة نضح نموذجي مع مدخل ومخرج. يتوضع VNO شريحة في وسط الغرفة والضغط إلى أسفل مع مرساة الأنسجة. تتم إزالة الخيوط المتوسطة من مرساة الأنسجة بحيث لا يتم الضغط على الأنسجة VNO. باء يوضع غرفة نضح على خشبة المسرح تحت مجهر الهدف غمس. يشار إلى مدخل mACSF ، شفط منفذ وغيض التروية. جيم حقنة واحدة للبرميل مضخة يوفر تدفقا مستمرا من خلال لرينغر غيض التروية. دال inje HPLCتم اعتماد نظام ction حلقة مريحة لتحفيز تحميل العينة والحقن. E. التوضيح تخطيطي للاتجاهات تدفق عند التحميل ومواقع الحقن. الجرس ، والأخضر. نموذج التحفيز والأرجواني. تشير الأسهم اتجاه التدفق. واو التأخير ويغسل قياس الوقت لنظام الارواء. يتم تحميل رودامين 6G صبغة الفلورسنت لحلقة العينة ويتم تبديل صمام حقن للموقف في دورتها الثانية 5 ، والتي يشار بسهم. يتم الكشف عن تغيير إشارة الفلورية بين 10-30 ثانية ، ويقلل من بعده.
الرقم 4 أنابيب معالجة الصور. A. يتم تسجيل جميع إطارات الصورة لشريحة واحدة ضد الإطار المرجعي. باء الطرح لإسقاط الحد الأدنى من كومة من الإطارات الخام. خلايا الاستجابة أصبحت تحتل مكانا بارزا بعد الطرح. جيم Rويتم اختيار OIS ويتم تجميع هذه الإحداثيات إلى القائمة الرئيسية. دال قياس عائد الاستثمار باستخدام خلايا الاستجابة قائمة رئيسية من المكدس الخام.
الشكل 5 ممثل G - CaMP2 تجربة التصوير VNO. أ heatmap استجابة ΔF / F من شريحة حفز مع البول الفرد من الذكور والإناث. يتم جمع عينات البول من الفئران الفردية للذكور والإناث. المحور السيني ، والاستجابة الخلايا التي تم تحديدها من شريحة. العمودي ، وعينات البول التي استخدمت في التجربة. شريط لون يدل على قيمة ΔF / F. باء بالطبع وقت الاستجابة من 3 خلايا ممثل ملحوظ في أسهم تشير إلى ألف مرة من تطبيق التحفيز. F - FVB ، الإناث FVB ؛ F - CBA ، الإناث CBA ؛ M - FVB ، الذكور FVB ؛ M - BL6 ، الذكور C57BL / 6.
جدول محدد الكواشف والمعدات :
| اسمالكاشف | شركة | فهرس العدد | تعليق (اختياري) |
| نضح الغرفة | Siskiyou | PC - H | أفقي |
| شريحة عقد لأسفل | نذير الآلات | SHD - 22CL | |
| نضح ميناء حامل | ALA العلمية ، وشركة | MPIOH - S | |
| المحاقن مضخة | نظم عصر مضخة جديدة ، وشركة | NE - 300 | |
| انخفاض ضغط صمام الحقن | Chromtech | V - 451 | |
| PEEK أنابيب | Chromtech | 1531 | 1 / 16 "التطوير التنظيمي ، 0.25mm معرف |
| PEEK عينة حلقة | Chromtech | 1803 | 20 ميكرولتر |
| هاميلتون حقنة | Chromtech | 80630 | 100 ميكرولتر |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
غالبية المستقبلات الميكعي (VRS) تبقى كما مستقبلات اليتيم منذ اكتشافه من قبل Dulac وأكسل 5. ليست ليغاندس فرمون هذه المستقبلات حسي كيميائي ودورها في التوسط في سلوكيات الحيوان مفهومة جيدا. حتى الآن ، تم التعرف زوج واحد فقط من يجند / مستقبلة ، والببتيد ESP1 ومستقبله وما شابه ذلك ، Vmn2r116 (V2Rp5) ، وأظهرت أن أنقل معلومات اجتماعية محددة 19،23. وقد تبين أن مستقبلات أخرى ، V1rb2 ، للرد على heptanone - 2 ، وهو ما يفترض هو المخصب في البول من الفئران الإناث 24. ومع ذلك ، فإن المعلومات التي نقلها محددة يجند هذا لا يزال غير واضح. الطريقة التي قمنا بتطويرها هنا يمكن توصيف الاستجابات العصبية VNO لعدد كبير من المحفزات وتحليل أنماط التنشيط. باستخدام هذا الأسلوب ، وجدنا أن الخلايا تظهر استجابات محددة للالبول ذكرا أو أنثى ، وأنه قد تكون هناك خلايا عمل مخصصة للاعترافالعظة 15 الجنس فرمون محددة. وأعرب عن VR هذه الخلايا لا يزال يتعين تحديدها. وصف أسلوب التصوير هنا لا يسمح للفحص يغاندس فرمون موجودة في البول ، ولكن أيضا تسهيل التعرف على مستقبلات معينة تستجيب لمنبهات فرمون.
وقد استخدمت مجموعة من أجهزة الاستشعار كامب الأسرة الكالسيوم في مجموعة متنوعة من الحيوانات ونظم إشاراتها وقد ثبت أنها تتطابق جيدا مع العابرين الكالسيوم 25-28. استخدام الاستشعار المرمزة وراثيا يوفر قراءات الحساسة من الاستجابات العصبية ويتيح التعبير محددة من أجهزة الاستشعار في الأنسجة المستهدفة ونوع من الخلايا. أجهزة الاستشعار وراثيا ترميز تجعل من الممكن أيضا لتصوير المزمنة في الحيوانات الحية. تقليديا ، استخدمت الأصباغ الاصطناعية الكالسيوم لرصد استجابة الكالسيوم. إجراءات تحميل الصبغة هي حتما الغازية وغالبا ما تسبب تلف الأنسجة. تفاوت التحميل واختراق محدود من الصبغة في tissرق أيضا تؤثر تأثيرا كبيرا على الكشف عن إشارات الكالسيوم.
في تجربتنا باستخدام G - CaMP2 الفئران ، ونجد أن اتساع ردود الفعل على قدم المساواة مع ، أو أفضل من وأساليب تحميل الكالسيوم في صبغ الاستعدادات شريحة. يمكن الحفاظ على شرائح VNO في حالة صحية جيدة لعدة ساعات بعد sectioning بالتالي السماح لتحليل عدد كبير من المحفزات في تجربة واحدة. ومع ذلك ، وأجهزة الاستشعار وراثيا غالبا ما تحتوي على ترميز البروتين المجالات التي يمكن أن تتفاعل مع المكونات الخلوية من المحتمل أن يغير أنماط استجابة أو حتى تؤثر على التطور الطبيعي للكائن. يجب على المرء أن يكون حذرا عند تقديم جهاز استشعار جديدة في النظام. مطلوب دراسة متأنية من الأنسجة المستهدفة. في دراساتنا السابقة ، وقد درسنا الفئران G - CaMP2 عن تصرفاتهم فطرية ، والخصائص الكهربية للخلايا العصبية VNO الإسقاط وأنماط من الخلايا العصبية الحسية الشمية 15. تتأثر أي من هذه الجوانب في G -CaMP2 الفئران. ومع ذلك ، باستخدام حيوانات معدلة وراثيا لا تتكبد تكاليف إضافية لصيانة الحيوانية والتنميط الجيني. بالإضافة إلى ذلك ، تقتصر التجارب لإنشاء خطوط المتاحة. هذه هي العوامل التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند تصميم التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر اندريا موران مع أعضاء لحيوانات المختبر مرفق الخدمة (LASF) في معهد نيفيز لدعمهم ممتازة على تربية الحيوانات والخدمات التقنية. ويدعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة والمعهد نيفيز في (NIDCD 008003) في البكاء. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى أو المعاهد الوطنية للصحة. الولايات المتحدة لبراءات الاختراع في انتظار الفئران tetO - G - CaMP2 لمعهد نيفيز ، والبكاء وLM.
References
- Birch, M. C. Pheromones. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
- Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).
- Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141, 692-703 (2010).
- Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
- Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
- Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
- Ryba, N. J., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Neuron. 19, 371-379 (1997).
- Pantages, E., Dulac, C. A novel family of candidate pheromone receptors in mammals. Neuron. 28, 835-845 (2000).
- Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies. Genomics. 83, 802-811 (2004).
- Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
- Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors. Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).
- He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ. Science. 320, 535-538 (2008).
- Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
- Chamero, P. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450, 899-902 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437, 898-901 (2005).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
- Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
- He, J. Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).
- Haga, S. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466, 118-122 (2010).
- Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).
- Hendel, T. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in. 28, 7399-7411 (2008).
- Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators. J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).
- Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
