カエル精子の化学誘引を検出するためのアッセイの二種類

Summary

卵の周り卵と細胞外コーティングは、頻繁に精子と通信することにより、受精を促進する卵にそれらを導くためにいるペプチド、タンパク質と低分子化合物を放出する。精子の蓄積アッセイと精子のトラッキングアッセイ - 我々は精子の化学誘引を検出するために使用されるアッセイの二つのクラスを記述し、比較するカエルの精子を使用した。

Abstract

無脊椎動物における精子の化学誘引は1つが精子懸濁液に魅力的なペプチドを含むピペットを配置し、顕微鏡下でピペット約¹精子の蓄積を可視化できることが十分に堅牢にすることができます。このようなカエル、齧歯類やヒトなどの脊椎動物における精子の化学誘引は、検出することがより困難であると定量的なアッセイが必要です。化学誘引物質の源、いわゆる精子の蓄積アッセイ、および実際に個々の精子の遊泳軌跡を追跡アッセイするために精子の動きを定量アッセイ - そのようなアッセイは、二つの主要な種類があります。

精子の蓄積アッセイは、それによって用量応答曲線と時間のコースが比較的迅速に実施できるように一日で行われるアッセイの比較的急速にできるように、数十から数百、です。アッセイのこれらのタイプは、多くの確立された化学誘引システムを特徴付けるために広く使用されている - 例えば、好中球の走化性細菌に卵胞液に生じたすべてのペプチドと精子走化性。精子の追跡アッセイは、集中的に多くの労働力であるがchemoattractanctsが実際に精子がかかること水泳のパスを変更する方法に関する追加データを提供することができます。このタイプのアッセイは、chemoattrractantグラデーション軸に相対的な精子の運動の方向を示すために、特徴的ターンや卵に近い精子をもたらすの向きの変化を視覚化するために必要です。

ここでは、アッセイのこれらの2つのタイプのそれぞれに使用方法を説明します。利用精子の蓄積アッセイは、"二チャンバー"アッセイと呼ばれています。両生類の精子は12μmの直径の孔を有するポリカーボネートフィルターの床を持つ組織培養プレートのインサートに配置されます。精子とのインサートは、バッファと慎重に床、壁を（図1参照）を満たしているウェル底にピペットchemoatttractantを含む組織培養プレートのウェルに配置されます。インキュベーション後、精子の貯水池を含む最上位の挿入は慎重にRです。emoved、と膜を通過した下部チャンバー内の精子は、削除ペレット化し、血球計またはフローサイトメーターでカウントされます。

精子の追跡アッセイは、もともとは好中球の走化性を観察するために開発されたとGiojalasや同僚^2,3によって精子の観察用に修正Zigmondチャンバーを採用しています。チャンバーは2つの垂直方向の谷が機械加工されているに厚いガラスのスライドで構成されています。これらは、1 mm幅の観測プラットフォームで区切られます。カバーガラスの塗布後、精子は他に化学誘引剤、一つの谷にロードされ、個々の精子の動きはビデオ顕微鏡により視覚化した。ビデオ映像は、各精子の軌道を形成する時間（XYTデータセット）の関数としてxy平面における2次元セルの動きを識別するためのソフトウェアを用いて分析される。

Protocol

1。材料と使用されるバッファ

1. 卵母細胞のリンゲル緩衝液（1.5 × OR2は）124 mMのNaCl、3.75 mMの塩化カリウム、1.5mMのCaCl _2を 、1.5mMのMgCl _2、1.5mMののNa ₂ HPO _4、10mMのHepesを、含まれています pHは7.8。受精のバッファ（F - 1）は41.25 mMのNaCl、1.25 mMの塩化カリウム、0.25mMのCaCl _2で 、0.06 mMのMgCl _2、0.5mMののNa ₂ HPO _4、2.5 mMのHepes緩衝液、pH 7.8が含まれています。
2. アフリカツメガエルの卵の水は、杉山らにより製造される^。4。簡潔に説明した、新鮮な生成されたゼリー状のカエルの卵は、F - 1 30分間のバッファとマイクロピペットで除去順化培地の小さな体積で旋回している。 "卵水"と呼ばれるこの培地は、、また精製allurin、このゼリーの抽出物中の主要な化学誘引物質を準備するために使用することができます。精子は、商業的に飼育アフリカツメガエルやアフリカツメガエルトロピカから取得されます。
3. tに必要な特定の項目のための材料の表を参照してください。彼アッセイ。

2。カエルの精子の走化性の2つのチャンバーアッセイ

1. 0.07パーセントベンゾカインを含んでいる水に浸漬することによってカエルを麻酔、安楽死を確保するためにカーボランダム研がれたハサミ、そして二重髄を使用して首を切る。離れて筋肉を公開するために腹部の皮膚を切り取ります。腹部の筋肉の正中線と横方向のカットを行い、リトラクト。ゆっくりと腸と白、豆の形を精巣を明らかにするために脂肪を引っ込める。血管に注意しながら微細なハサミを用いて結合組織を切り落とす。 1.5 × OR2バッファを使用して血液を洗い流す、精巣を除去し、余分なバッファと小さな接着血管を削除し、1.5 × OR2バッファー0.2 mlのプラスチックピトレ皿の中に精巣を配置するろ紙上の精巣をロールバックします。 1.5 × OR2緩衝液2 mlと5 mlのシリンジを埋める、優しく、一方の端で面のほぼ全体にわたり精巣に10〜20の穴を突く反対側の端に針を挿入し、ゆっくりと精液を洗い流すためにバッファーを注入する。あるいは、精子を吐き出すのに出口の穴を突っついている間のバッファを注入することができます。氷上でマイクロ遠心チューブや場所にカットオフ先端（精子のせん断を避ける）でマイクロピペットを用いて精子懸濁液を移す。
2. 1.5 × OR - 2で精子1:100に希釈し、混合した精子懸濁液20μlのサンプルを採取し、血球計算板と大規模な1 MM ²領域を用いて細胞数をカウントすることによって得られるカエルの精子の数を見積もります。血球計数とサンプリング比率を使用すると、精子の密度と収穫精子の総数を計算する。この合計は、通常2 -約2mlの容積で6 × 10 ⁷精子の両方の精巣が使用されるとき。 2 × 10 ⁷ / mlの精子の密度を得るために1.5 × OR2バッファを使用して株式の精子懸濁液を希釈する。準備の2〜3時間以内にアッセイのための精子を使用してください。 F - 1のバッファと位相コントラスト光学系を用いて可視化する動きと精子の1:10の5μlを希釈することにより精子の運動性を評価する。精子の少なくとも40％〜50％運動でなければなりません。ても適切な準備が未熟であるほとんどが動けない精子の数が多いが含まれます。
3. 各ウェルにF1バッファー700μlをmicropipettingして、新しい24ウェルプラスチック製組織培養プレートを準備します。各ウェルには、下部の直径は約15mmにする必要があります。
4. 浸透圧ショックによる精子運動を活性化するためにマイクロ遠心チューブに（° C 23約21）、室温でF1バッファー900μlで精子懸濁液100μlを希釈することによってアッセイのシリーズを開始します。たびに新鮮な精子がこの方法で活性化され、精子は1〜2分以内に使用しなければなりません。
5. に12μmの多孔性インサート（12 mm外径）に置きますバッファを充填しただけでなく、挿入位置が片側にスペースを残してオフセンターであることを確認してください。すぐにカットオフ先端を持つマイクロピペットでウェル内に精子を活性化運動の400μlを移す。フィルタ挿入の壁に精子懸濁液を適用し、それが目の下部にフィルター上にダウンを実行することができますeが挿入、精子懸濁液をフィルター上に直接ピペッティングしてはいけません。
6. よく、オフセンターフィルター挿入の間にスペースのウェルに化学誘引剤の慎重にマイクロピペットを50μl。一つは、ウェルの側面と底面は、システムへの外乱のないピペットを満たすと撤退ドロップを預けるように注意する必要があります。特に、マイクロピペットでプランジャーが完全にサンプルがない気泡を排出するように最初のピットストップにのみプッシュされるはず。
7. 起動した最初の検定は50分間インキュベートするまで、必要に応じて多くのアッセイとして起動するには、上記の手順2.5と2.6を繰り返してから、プレートをインキュベートする。典型的には、アッセイの各45〜60秒を開始することができます。アッセイは、経験豊富な人で、または一緒に作業を2人で合理化できることに注意してください。このケースでは、アッセイの1つまたは2つの行は、運動性精子の大きい株式で開始することができ、その精子を提供する高速なピペッティングは常に1〜2分以内に使用されています活性化。
8. 開始シーケンス内の各アッセイを停止します。慎重にマイクロピペットでまたはパスツールピペットで吸引して、最もまたは、上部チャンバー内の精子懸濁液の全削除片手で、他のとフィルターインサート最初、慎重に着実に。すぐに、細かいピンセットを使用して、フィルタの挿入及び廃棄を引き出します。ケアは、残りの精子を人工的に精子の通過のために値を上げるフィルターを襲ったことが、少なくとも、この段階で使用されている必要があります。
9. 各ウェルプレートから、マイクロ遠心チューブに全体の精子懸濁液を移す。精子が底に沈降する傾向があるので、撤退する前によくで精子懸濁液を混合することが重要です。 0.5パーセントV / Vの最終濃度を25％ホルムアルデヒドの15μlを加え、精子の数が同じ日に行われていない場合、冷蔵する。
10. ペレット2000 × gでの最高速度を有するパーソナル遠心機で10秒のプッシュボタンのスピンを使用して、各チューブ内精子supernatのすべてが、100μlを削除する各チューブから蟻は、そのボリュームでペレットを再懸濁します。 、精子懸濁液20μlを取る蒸留水で1:10に希釈し、正立顕微鏡で40倍対物レンズを用いて血球計算盤で精子を数える。各アッセイでフィルターを通過した精子の総数を計算するためにカウントし、希釈倍率を使用してください。

3。 Zigmondチャンバーを用いてカエルの精子のトラッキング分析

1. ビデオ撮影用倒立顕微鏡のワークステーションを準備します。我々は、ソニーDXC - 390 3チップカラーアナログビデオカメラまたは浜松ORCA - 03Gモノクロデジタルカメラのどちらかを装備したニコンElipse TE300倒立顕微鏡を使用してください。 Zigmondチャンバースライドは、22x40 mmのカバーガラスに対応するために、ステージの板で十分な開口部と上下逆ステージ上で休む必要があります。この配列は、カエルの精子が重力に逆らって泳ぐことができないという事実によって余儀なくされる。両者の間実行されている展望台のいずれか4倍または10倍対物レンズをフォーカス谷。
2. カメラが焦点と展望台を中心にされていることを確認するテストします。ソニーのカメラが使用されている場合、出力はビデオモニターに、ビデオ信号から毎秒7フレームをデジタル化できるA / Dコンバータ（フレームグラバー）に送信されます。デジタルストリームは、4 GBのRAMまたはそれ以上、好ましくは3 GHz以上で動作するコンピュータを使用して処理されます。私たちはサイオンCG - 7フレームグラバを制御するサイオンの画像ソフト（NIH ImageのカスタムWindows版）を使用していますが、これらの製品は使用できなくなりました。現在のソリューションは、アナログビデオカメラキャプチャ用のVirtualDubプラグインで画像Jソフトウェアを使用することです。浜松のカメラが使用されている場合は、そのデジタル出力は、オリンパスcellSensのソフトウェアによって処理され、コンピュータのモニタ上に表示されます。どちらの場合も、データは8ビットのTIFFスタックとして内部または外部ハードドライブに保存されます。サイオンImageソフトウェアの使用は、イメージを使用してスタックへのTIFF画像シーケンスの変換を必要とJ.
3. F1バッファで適切な濃度で化学誘引物質を準備します。前述のようにアフリカツメガエルの精子を準備し、使用するまで氷上に1.5 × OR2バッファに格納します。
4. Zigmondチャンバーを組み立てます。乾いた清潔な容器で始まります。マイクロピペットの位置5からmmと各トラフの外側の縁に平行な約シリコーンオイルのライン（4μl）を使用する。シリコーンオイルは、均等に各トラフの外縁に広めるためにできるようにチャンバーの上に22x40 mmのカバーガラスを置きます。予備実験では、その精子の付着が問題であることを示す場合ファブロらによって提案されたとして、一つはニトロセルロースでコーティングカバーガラスをする必要がある場合があります^。3。 Alternatively、（例えば1％BSA）で使用するバッファのタンパク質が追加されたことで精子の付着を減らすことができます。
5. カバーガラスは、ステージとの接触をしないことに注意しながら顕微鏡のステージに円形の切り欠き上室と場所を反転。この反転構成では、プラットフォーム上にトラフからアフリカツメガエルの精子を持参する必要があります。哺乳類の精子とは異なり、 アフリカツメガエルの精子は、プラットフォームに到達するために重力に逆らって泳ぐのに十分強いものではありません。
6. 室温でF1バッファーと混合1：10で1.5 × OR2バッファでアフリカツメガエルの精子の20μlを活性化する。カットチップ付きマイクロピペットを使用して、すぐに谷に運動性活性化精子の70μlを移す。これは、低角度でマイクロピペットを保持し、トラフの側面開口部の先端を置くことによって達成されます。取り出された細胞懸濁液は、毛細管現象によりトラフと橋を埋める。次に、chemoatttractantソリューションを使用して、同じ方法で反対の谷を埋める。
7. 3分以内にビデオテープに録画を開始（ アフリカツメガエルの精子が限られた運動性の寿命を持っている）し、5分間続ける。ビデオ撮影の終わりには、チャンバーを分解し、加圧された水の流れと噴霧ボトルからエタノールでのトラフと展望台を洗う。展望台と谷を汚染しないように注意してペーパータオルで上面からシリコンオイルを削除します。
8. 必要に応じて、TIFF画像シーケンスまたは画像Jソフトウェアを使用してスタックにキャプチャされたビデオデータを変換します。その後、追跡するために50精子つまで選択（3秒）画像Jと最初の21フレームでファイルを開きます。バイアスを避けるために、観察視野のすべての地域からと、その軌跡のデータの知識がなくても精子を選んだ。ポイントして、各精子のための時間の機能（XYTデータセット）としてxy平面における2次元セル軌跡をキャプチャし、イメージJ.可視化軌道用MtrackJプラグインモジュールを使用してマウスのクリックや軌道を計算する距離、MtrackJ内軸成分と速度。また、Microsoft ExcelにXYTデータセットをインポートすることによって、これらの操作および今後の数値解析（例えば方向性、走化性​​のパラメータとパラメータのヒストグラム）行う。
9. 直線、曲線、および円形のパターンだけでなく、ターンなどの機能を含む運動の全体的なパターンを検出するためにExcelの各精子のためのプロットの軌跡。とY軸、およびグラデーション軸の相対移動の平均角度のような方向パラメータ - XYTのデータを利用するには、平均的な曲線速度、Xに沿ってネット旅行（勾配）を計算するために設定します。

4。代表的な結果：

twoチャンバーアッセイにおける重要な技術的パラメータは、サイズと室の形状、膜の気孔率、およびインキュベーションの長さです。精子を保持し、上部チャンバーの大きさは、精液の大量を必要とするように直径のように大きくすべきではありません（プリferably 0.5ミリリットル以下）も上室には、細胞懸濁液（<1 cm）の高い列を作成するように深いはずです。上部チャンバインサートを囲む下部チャンバーのバッファーの量は正確になるよう人為的に膜を介して精子を強制する膜貫通型静水圧を作成しないようにインサートに細胞懸濁液のレベルを一致させる必要があります。ローディング中にメンブレンを通過するから精子を防ぐ最初の上向き静水圧の精子ロード結果に続いて最初のウェル底部に空の挿入、の配置。膜の孔径の選択は、精子の大きさ、および多孔質膜インサートの商業的利用可能性によって決定されます。私たちは12μmの細孔がより正確な計数を可能に精子の高い数値の通過のために提供するものの、カエルの精子のアッセイは、8または12μmの直径の孔を利用できることがわかります。 12μmのより大きい細孔径は、市販のように表示されません。 TIを使用する代わりにssue培養用インサート96ウェルプレートの走化性アッセイのために設計されたNeuroprobe膜の使用です。これらは、潜在的に優れたスループットおよび細孔径のより広い範囲を提供します。大きな哺乳類の精子は、より大きな孔径を必要とするように見えるかもしれないが、我々が正常に12μmの孔（バーネット、未発表の観察）でインサートを使用して、マウスの精子走化性を検定している。我々はまだこの可能性をテストしていないものの、これとは対照的に、より小さい細孔サイズが小さく精子（例：ウニ）には十分かもしれません。

説明する2つのチャンバーアッセイの一つの欠点は、このように必然的にこのようにバックグラウンド比の信号を減​​少させる、重力によって、いくつかの精子の通路で、その結果上部チャンバー内に配置される精子です。これは、 アフリカツメガエルの精子は、哺乳類の精子はそのまま重力に逆らって泳ぐことがその運動に十分な活発ではないという事実によって余儀なくされる。 アフリカツメガエルの精子をアッセイすることで別の難しさは、その運動のlという事実であるIFEの時間は短いです - 5〜15分間活性化した後。この制限は、精子、複数のアッセイを行う毎に2〜3分の新しいバッチをアクティブにするために必要とするための基礎です。その結果、時間の経過の研究はそのほとんどの精子の通路は、アッセイ⁵の最初の20分以内に発生が示されている。我々は50分の潜伏期間を使用していますが、この期間はおそらく20〜30分に短絡することができます。対照的に、時間の運動性維持のマウス精子のために、我々は良い結果（バーネット、未発表の観察）を用いたアッセイの2時間の期間まで使用している。

カエルの精子を使用して、2つのチャンバーアッセイでは、多孔質膜を介して精子の通過の合計数は通常10〜20千人の上側のチャンバーインサートに配置された精子の約1〜2％です。下部チャンバーの誘引物質勾配の存在は、4〜10倍程度と精子の通路を増やすことができます。図2は、このアッセイで行う典型的な用量反応曲線を示しています。 EXTR既知の走化性蛋白質のallurinを含むアフリカツメガエルの卵ゼリー（"卵水"）（赤丸）の行為は、希釈系列における下部チャンバー内に設置した。各アッセイに含まれる全卵の水のタンパク質は、マイクログラム/アッセイに記載されています - オリジナル50μlの量で提供されている金額を。納入タンパク質が拡散勾配を形成するので、精子が応答するタンパク質の実際の濃度範囲は知られていないが納入ドロップのタンパク質濃度に比べて5〜10倍であると推定することができます。このような理由から、我々は導入タンパク質の量ではなく、濃度を表す。通常、我々は各投与量と平均的な結果のため、重複や三連アッセイを実行する、我々は、各実験の異なる男性から精子を用いて実験全体3〜4回を複製する。平均値の平均値と標準誤差は、通常、平均値の5〜10％という平均値の標準誤差を各用量ごとに計算されます。自演しなくても、そのタンパク質に注意してくださいウシ血清アルブミン（白丸、図2）としてWN化学走化性活性は、膜を介して精子の通過で低レベル、非特異的増加を生じることがあります。上げ局面と減少相 - 興味深い観察は、卵の水のための用量反応曲線が多面的なことです。多相の関係のこのタイプは、精子誘引物質が一般的です、卵胞液にヒト精子の応答は、卵の周辺に見られる走化性因子のその高濃度で有用であると考えられてさらに検索応答を減少させるのに役立つ可能性のある同様の二相性の関係で^6を示しています。精子の部分で。

時折、我々は、このように化学誘引物質によって生成された倍の増加を減らすこと、このアッセイのコントロール値が通常より高くなることがわかります。通常、これは、アッセイ時のフィルタインサートの機械的破壊にさかのぼることができます。従って、それは精子やチェゲバラのロード中に挿入するに障害が発生していないことが重要です。moattractant、アッセイのインキュベーション中または挿入が削除される。特に重要な挿入で精子溜め井戸からインサートを持ち上げる前に、マイクロピペットまたは吸引によって除去されるということです。これにより、挿入が削除される場合は下部チャンバー内に多孔質膜を襲ったされていない精子が保証されます。

Zigmondチャンバーアッセイにおける重要な技術的パラメータは、カバーガラスと展望台、ビデオ観察の倍率、使用される光学系の種類、およびフレームレートの間の距離が含まれています。より多くのオイル、大きい距離 - この距離はカバーガラスおよびチャンバースライドの間のインターフェースに使用されるシリコーンオイルの量によって変えることができるものの、展望台の間の距離は通常10〜15μmである。流体の薄い平面を形成するには、グラデーションだけでなく、一度形成された勾配の長寿のために必要な時間の量が増えます。流体の厚い面は、より迅速なgを可能にradientの形成が勾配は、ライフタイムが短いと少なく安定しています。勾配形成のダイナミクスは、よく化学誘引物質に蛍光色素や蛍光デキストランを使用して、ダイナミクスを表示するには、蛍光顕微鏡を用いて可視化することができる。テストの試薬は、化学誘引物質使用とダイナミクスが決定した勾配の形成と精子の動きの記録のために許可されるべきか、多くの分を判断するために使用されているために分子量に一致する必要があります。

使用される倍率は、全体的に低くする必要があります（4倍または10倍目標）全体の展望台は、我々が説明したアッセイ条件のように視覚化されるかどうか。いずれかの鞭毛運動を解決するために比較的短い軌道セグメントやご要望を監視するためにしようとする場合に一方、高倍率（40倍または63xの目的）が役に立つかもしれません。このホワイトペーパーでまたは自動追跡によって説明されているように多くのSOPで実践としての追跡は、半手動の方法のいずれかによって行うことができますMetaMorphまたはImarisトラックなどのhisticatedソフトウェアパッケージ。どちらの場合でも、追跡の容易さは、それが演算子によってまたはソフトウェア支援物体認識によるものかどうかを画像のコントラストで非常に依存しています。明視野光学系は、いくつかのケースで使用される可能性がありますが、位相コントラストの光学系や暗視野光学系の使用が一般的に必要となります。最後に、フレームレートは、追跡に必要な時間分解能に依存します。毎秒4から8フレーム - - セミマニュアルの方法は私たちの手順のように使用される場合、こちらは、おそらく比較的低いフレームレートに制限されて記録データの労働集約的な性質に起因する。一方、ビデオレートの観測は、このような鞭毛の波形のような迅速な対応が必要な場合があります。頻繁に、実験的な目標は、最適なものはまた、倍率、光学系、またはデジタル画像処理などの他のパラメータを変更したいので、別々に遅いフレームレートの実験とより高速なフレームレートの実験を行うことによって処理されます。

Zigmの典型的な結果ONDチャンバー追跡アッセイは、ムービー1のビデオクリップで50カエルの精子のために見られるような軌道の集合で構成されています。展望台のイメージに対して、個々の精子の軌跡は、対照実験（無化学誘引物質勾配の存在）のために赤色でトレースされます。各精子のための時間の関数としてxy平面における2次元セル軌跡をプロットしMtrackJによって記録され、Microsoft Excelにインポートすることができます。軌道解析のために、我々はもともとファブロらによって開発された規則と一致し、X軸と直交する軸としてY軸として、化学誘引物質グラデーション軸を指定する^。3。図3の図に示すように、撮影した実際の軌道がステップで構成され、長さの和は、軌道（金/青の矢印）で走行曲線の距離に等しい。各精子による旅行の正味の距離と方向は軌道（赤斜め矢印）の最初と最後の点を結ぶベクトルである。市販ネットトラベルは、そのX軸成分及びY軸成分に分けることができます（赤い破線の矢印;また、ネットデルタXとそれぞれネットデルタY、と呼ばれる）。

脊椎動物の精子の走化性は、走行方向に相対的に微妙な変化が生じる可能性があるため、精子の大量（100〜300）、ランダムに選ばれた、通常多くの場合、4〜6の独立した実験からプールされたデータを必要とする条件ごとに分析されます。説明の目的のために、しかし、我々はたった50カエルの精子からのデータを使用します。表1は、精子の旅行の変化を検出するために使用される一般的なパラメータを示しています。走化性因子の存在下で、全体として精子の人口は、より密接勾配に合わせている軌跡を次、場合X軸に沿って平均正味旅行が大幅に増加します。この例では、平均正味X軸移動量は、卵の水の存在下で3倍以上に増加した。一つは、また、ADVANを持っている精子の人口の純X軸移動量のヒストグラムをプロットすることができます。反応精子の小さな集団が検出される可能性があること田下。ファブロら³によって開発された2つのパラメータはまた、そのような集団を検出するのに役立ちます。正の正味X軸移動量（％ΔX> 0）を示す精子の割合とグラデーション軸（％ΔX/ |ΔY|> 1）から45度を超えないネットリニア旅行を示す精子の割合は、両方の場合劇的に増やすことができます精子の集団が敏感な場合は、全体の精子の人口は、走化性因子またはより小さいが、それでもかなりの量だけに敏感です。表1の私たちの例では、卵の水勾配にさらさfiftyカエルの精子のパラメータの両方の増加を示しています。これ以上の制御値を（このような表1にあるような）低いサンプル番号のどちらかに起因するバックグラウンドを表すか、ランダムな非指向の動きがそれぞれ50％、25％のこれらのパラメータの両方のための非ゼロの値を与えることに注意してください実験的なデザインに特定の精子の向きのバイアスに。

内容は"化学誘引物質への応答における精子の旅行の>方向性は、直接シータ、それぞれの精子と勾配（X）軸のためのネット旅行のベクトル間の角度によって評価することができます。平均値θが減少することを表1に示すように私たちの例人口などの精子の軌跡がよりよい勾配で整列されたことを示す。正味のX軸移動量（上記参照）と同様に卵の水勾配における精子の水泳のために、精子集団のthetasはアプローチにも敏感な、分布として表すことができる。反応精子と最近Gakamskyら⁷で検討されたものの集団に。

最後に、個々の精子のための曲線と瞬間的な速度は、時間の関数として、xy平面に2次元セル軌道を記述するデータから抽出することができます。一つは、このようにだけでなく、chemokinetic応答を示唆し、速度の増加だけでなく、旅行の向きにずれがあることを見つけるかもしれない走化性応答。

これらのデータは、精子の軌跡の分析の出発点を表しています。さらなる分析は、ベーマーらが実施したように瞬間毎瞬間に軌道の直線性と曲率の測定を含めることができます^。8、芝ら^9、バーネットらによって行わとしてターンの自動検出^。10、および非線形性などのフラクタル解析^11,12によって測った。これらの軌道を泳ぐ精子がより高い倍率で監視されていれば、一つも画像鞭毛運動とのようないくつかの研究室^{8,9,13,14,15,16}によって運ばれるリアルタイムのカルシウムシグナルできた。このような研究は、無脊椎動物と哺乳類の精子の両方が走化性因子源に向かって勾配まで精子の急カーブで化学誘引物質に応答することを明らかにした。これらのターンは非常に舵のように精子の向きを変更する鞭毛の曲がりを伴っているでしょう、定義されて、波のLiによって開始されたように見える曲げ鞭毛を通って伝搬するKEのカルシウムシグナル。このように、精子のトラッキングの究極の目標は、走化性勾配で精子の方向の基礎となる鞭毛推進力の変化とシグナル伝達系のダイナミクスを相互に関連付けることです。これらの目標は、らせん運動¹⁷に移動するアフリカツメガエルの精子で到達されてこなかった彼らの軌跡¹⁰に低曲率を示し、そのカルシウムの信号は、監視されていない。

我々はアフリカツメガエルの精子のために使用するアッセイ方法を詳述した上でここに焦点を当てて、両方とも特定の変更が行われる場合は、2つのチャンバーの精子の蓄積アッセイとZigmond室の追跡アッセイは、哺乳類の精子のために使用することができますが。両方のアッセイは、暖かいと、Zigmondチャンバーアッセイにおいて、顕微鏡ステージウォーマースライドを使用して、必要に応じ° Cなら37℃で行うことができる。一般的に、哺乳類の精子は、分離容量制約と適切な哺乳類のバッファを用いてインキュベートするD化学誘引物質が、データの分析では、両生類の種のためにここに記載されているもののようになります。さらに一つの違いは、哺乳類の精子以来、 アフリカツメガエルの精子とは異なり、展望台にまで泳ぐことができるZigmond室は通常、正立顕微鏡のステージ上に直立配置されているということです。まだテストされていないとして、これら2つのアッセイでは、将来の仕事の種の数の精子にアプリケーションが表示されることがあります。

図1二チャンバーアッセイの模式図。精子は12μmの細孔を有するポリカーボネートフィルターです底そのうちのインサートに配置されます。走化性因子溶液は慎重に濃度勾配の形成を開始するウェルにピペットで入れる。

二チャンバー精子chemotaxiを使用してカエルの精子については、 図2。代表的なデータのアッセイ。 X.から調製した卵の水ツメガエルの卵は、精子誘引物質の特徴である多相用量-活性曲線を示す。わずかにウシ血清アルブミンの増加の精子の通路 - タンパク質の非特異的な効果。図は、Al - Anzi＆チャンドラー⁵から変更。

ムービー1。カエルの精子の軌跡を示すビデオクリップは、Zigmond室の展望台に赤でプロット。プラットフォームの幅は1mmである。 ビデオクリップを見てここをクリック。

図3。軸の規則、ネット線形旅行のための精子曲線の軌跡とベクトルはZigmondチャンバー観測プラットフォーム上にプロットされています。得られたデータは3つのタイプがあります。最初に、精子の軌跡そのものは（ゴールド/青の矢印）suの特定のパターンを明らかにすることができます円とターン（アスタリスク）としてCH。曲線距離と曲線速度は、軌道のパスのために測定することができます。第二に、ネットの直線距離は全体の軌跡、旅の正味のX（勾配）軸コンポーネント上に移動した、旅の正味のY軸成分とX軸とネット旅行のベクトル間の角度θは、それぞれの軌道を計算することができますと監視されるすべての精子上の分布として比較した。個々の軌道内のセグメントのための速度と進行方向に第三に、瞬間的な変化は、個別にまたは集団として研究することができる。上記の、チャンバーの側面図を図に表示されます。

表1。しばしばZigmondチャンバーからのデータを分析に使用されるパラメータ。

Discussion

アメーバ運動や鞭毛駆動水泳のどちらかで移動する細胞の走化性は、多くの生物学的な文脈で発見され、この現象の研究は、実用的で信頼性の高いアッセイの可用性を必要とします。このようなウニの卵や子実体を形成するために粘菌の細胞の集まりに精子の魅力として、現象のいくつかの例では、、即座に視覚的なインパクトを持っている。この現象の定量は、Eisenbach ¹⁸により説明したように、さまざまな方法で行われてきた。これらのアッセイは、毛細血管が精子を引き付けるために満たされた化学誘引物質の使用、精子と化学誘引のために井戸を持っているMaklerチャンバーの勾配と使用を作成するために毛細血管接合貯水池の使用を含む。本論文では、今より頻繁に使用されている二つの"第二世代"のアッセイを説明します。これらのアッセイは、まだ彼らはいくつかの新機能を組み込むグラデーションを作成する必要性に依存しているが。最初に、二つのチャンバーアッセイでは、多数の膜孔SAMPその利点を持っていますルの精子の通路は勾配を越えむしろ複数のキャピラリーの開口部は、単一のアッセイで勾配をテストするために多くの精子を可能にします。

指示細胞運動のパターンは、走化性における重要な特徴であり、それは追跡のセル用の新しいフォーマットが開発されていることは当然である。彼らは卵に近づくと、一つの新しい形式は、精子の軌跡の3次元スキャニングです。精子の位置を検出する赤外光の移動平面を使用して、ジマーらは、卵を中央に置く室内の精子軌跡のデータを提供している - 自然な化学誘引物質のソースを使用し、そうでなければ自然な精子の動きを妨害する可能性が比較的遠い壁を持つデバイスを^19。また、Corkidiら。 ²⁰三次元軌跡をキャプチャするために、高いフレームレートと長作動距離対物レンズの急速な動きを組み合わせたシステムを開発した。このようなデバイスの精子運動の分析は、最近極coordinaの使用によって促進されていますTES ²¹とゲレロら。最近、将来の研究¹³の精子走化性の三次元観察の必要性を強調している。

対照的に、デカルト座標の使用はZigmond室、好中球の方向と走化性の研究のためにサリーZigmondが開発し、最初のGiojalasや同僚^2,3によって精子の走化性の研究に有用であることが示されたデバイスによって促進される。走化性因子の線形谷ではなく、化学誘引物質の点源の使用は、化学的勾配はXY座標系ではなく、半径方向の座標系で設定することができます。 Giojalasは、ヒト、マウス、ウサギ、牛の精子の走化性の研究に、このアッセイを適用し、卵胞からの流体が化学誘引物質^2,3,22が含まれ^ていること^を見つけることを認識しています。最近では、GiojalasとEisenbachはまた卵を取り巻く卵丘細胞によって放出されることプロゲステロンが示されている精子走化性因子^23から26となっています。確かに、プロゲステロンは最近精子鞭毛屈曲し、それによって精子の水泳^27,28の方向を変更すると考えられてカルシウムシグナルを開始するために精子のCatsperチャネルの開口を引き起こすことが示されている。

Zigmond室は、メリットとデメリットの両方があります。利点の一つは、光、精子のシンプルセット焦点面内に維持されているとZ次元のないスキャン必要です。もう一つの利点は、ほとんどの研究者に、より精通していると、比較的一般的な数学で考案された新しいパラメータの試験を奨励するデカルト座標を使用することです。一方、Zigmond室は、自然界に見られるとは異なり、状況を作成します。精子は、おそらく彼らの鞭毛波形のレパートリーだけでなく、結果として得られる力の結果に影響を与えることが近距離で二つの壁の間で泳ぐに作られています。同様に、使用される化学誘引物質は通常、化学物質です。と卵から起こるとは異なる方法で分散した。最後に、壁に付着する精子は、3次元チャンバ内に存在しないという潜在的な問題です。

いくつかの研究者は、その精子のトラッキングは、精子走化性を研究する唯一の信頼できる方法である提案している一方、半手動ではなく自動化されたメソッドが使用されている場合、これらのアッセイは、実験とデータ分析の段階の両方で労働集約することができます。このような理由から、二チャンバーアッセイのようなアッセイは、ここで説明する走化性のための証拠を提供することができる定量的な再現性の高いデータを提供するために使用されている。このタイプのアッセイは、好中球懸濁液を多孔質のフィルタバリア²⁹の表面に接触して配置されたボイデンチャンバー、最初に作ったものです。走化性因子溶液は化学的勾配は、フィルタ自体の中に形成することができますフィルタの反対側に接触して置かれた。フィルタ行列を入力するセルはどちら染色し、mをカウントすることができますicroscopicallyまたは、放射性標識された場合、シンチレーションカウンターで計数。このアプローチはさらにchemotaxing細胞が実際にここでは^5を説明する2つのチャンバーアッセイのように渡すことに経由する大規模なポアポリカーボネートフィルターを使用することによって開発されました。

以前に我々は、カエルの精子の走化性の尺度として二チャンバーアッセイを検証しています。最初に、誘引として卵の水を使用して、我々は、フィルターを通して精子の通過の刺激は、濃度勾配が下部チャンバー内の走化性因子の単滴の沈着によって作成する必要があることを示している。化学誘引物質が混合によって底部チャンバのバッファ全体に分散されている場合は、精子の動きは^5を刺激されていません。上部チャンバーに誘引物質を添加することによって"逆勾配"の第二に、創造は、精子の通過を刺激しない。最後に、我々はZigmondチャンバー内の精子のトラッキング実験、精子の運動性と速度になっていることを見つける減少または関係なく勾配（バーネット、未発表の観察）からの相対精子の進行方向の変更はありません。それは精子の運動性の阻害剤は実際にこのように走化性¹⁸として誤解される可能性が精子の人工蓄積を提示する化学物質の源の近くに精子を遅くしたり停止する可能性が指摘されているので、この最後の観察は重要です。

これらの警告にもかかわらず、そのような二チャンバーアッセイ精子蓄積アッセイは、卵胞液およびプロゲステロンに哺乳類精子の化学誘引の初期検出で、細菌のペプチド^29,30に好中球走化性を特徴づけるに役立っている非常に便利な省力化ツールであることが証明されている^6,31,32、およびカエルの精子の走化性因子allurin ^4,5,33の精製とキャラクタリゼーションインチ

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	BD Biosciences	35/1147
12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane	EMD Millipore	PIXP01250	We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued
Zigmond chamber	Neuroprobe	Z02
Silicone oil	GE Healthcare	SF1154	Equivalent to Dow Corning 550 Fluid
Image J software	Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health	Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
MtrackJ software	Biomedical Imaging Group	Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
Virtual Dub software	GNU General Public Licensed	Free download via http://www.virtualdub.org/index.html	Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only
cellSens software	Olympus Corporation	See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability