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Biology

两种类型的检测,检测青蛙精子Chemoattraction

doi: 10.3791/3407 Published: December 27, 2011

Summary

蛋和蛋的周围外涂料频频释放多肽,蛋白质和小分子,与精子的沟通,引导他们到卵子,从而促进受精。利用青蛙的精子,我们描述和比较两类检测,用于检测精子chemoattraction - 精子的积累检测和精子跟踪检测。

Abstract

精子在无脊椎动物chemoattraction可以足够强大,可以将吸管将含有一个精子悬液的吸引力肽和微观可视精子积累周围移液器1。在脊椎动物如青蛙,啮齿动物和人类的精子chemoattraction是比较困难的检测和定量分析要求。这种检测两大类型 - 定量来源的趋化,所谓的精子积累分析,和实际跟踪单个精子的游泳轨迹的检测精子的运动检测。

精子积累实验较快,允许数十或数百个在一天内完成检测,从而使剂量反应曲线和时间课程进行较快。这些类型的检测已广泛用于表征许多行之有效的chemoattraction系统 - 例如,中性粒细胞趋化BACterial肽和精子的趋化卵泡液。精子的跟踪分析,可以更多的劳动力密集型,但对如何chemoattractancts实际上改变的游泳路径,精子采取提供额外的数据。这类型的检测是需要表现出精子的运动方向相chemoattrractant渐变轴和可视化特征或转方向的变化,使精子接近卵子。

在这里,我们描述了这两种类型的检测采用的方法。利用精子积累检测,被称为“两院”法。两栖类动物的精子被放置在一个组织文化与聚碳酸酯过滤器直径为12微米的毛孔地板的板插入。插入与精子放入组织培养板中含有缓冲区和底部以及地面符合墙上(见图1)。吸管小心地将一个chemoatttractant井。潜伏期后,顶端插入含有精子水库是经过精心řemoved,并在底部室,通过膜的传递的精子都将被删除,颗粒,然后通过血球计数或流式细胞仪。

精子跟踪检测,采用了Zigmond室最初观察中性粒细胞趋化,并观察精子的修改Giojalas 同事2,3。该商会由一个厚厚的玻璃幻灯片已被加工成两纵槽。这些相隔1毫米宽的观测平台。经过一个玻璃盖,精子的应用程序加载到一个低谷,到其他运动和单个精子的趋化剂的可视化视频显微镜。录像分析软件,以确定时间(xyt数据集),每个精子的运动轨迹功能在XY平面二维的细胞运动。

Protocol

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1。所使用的材料和缓冲区

  1. 卵母细胞林格氏液(1.5 × OR2)包含124毫米氯化钠,3.75 mM的氯化钾,1.5毫米氯化钙2,1.5毫米氯化镁2,1.5毫米的Na 2 HPO 4,10毫米HEPES, pH值7.8。施肥缓冲器(F - 1)包含41.25 mM氯化钠,氯化钾1.25毫米,0.25毫米氯化钙2,0.06毫米氯化镁2,0.5毫米娜2 HPO 4,2.5毫米的HEPES,pH值7.8。
  2. 爪蟾卵水准备根据杉山爱等4。简要介绍,冻,新鲜催生的蛙卵盘旋30分钟和微量删除的条件培养基中的F - 1缓冲体积小。这种媒介,被称为“水蛋”,也可用于制备纯化allurin,在这个果冻提取物的主要趋化。精子获得商业育成爪蟾热带爪蟾
  3. 在T所需要的具体项目,请参阅材料表他检测。

2。一个青蛙精子的趋化双室法

  1. 麻醉浸泡在含有0.07%苯佐卡因的水蛙,杀头使用了一双碳化硅一把剪刀,和双髓,以确保安乐死。切去腹部皮肤暴露肌肉。腹部肌肉的中线和横向切割和收回。轻轻收回肠和脂肪揭示白,豆状睾丸。修剪远离使用罚款剪刀小心,以避免血管的结缔组织。取出睾丸,洗去血液,使用1.5 × OR2缓冲区,然后在滤纸上滚动睾丸去除多余的缓冲和小壁血管,然后放置在一个塑料pitre菜0.2毫升1.5 × OR2缓冲区的睾丸。 2毫升1.5 × OR2缓冲区填入5毫升注射器,轻轻捅睾丸表面大部分在10-20孔的一端,在另一端插入针,轻轻地注入冲洗掉精子的缓冲区。另外,可以注入的缓冲区,而戳退出孔冲洗掉精子。传输使用一个切断提示(避免精子剪切)到离心管置于冰上一个微量的精子悬液。
  2. 估计精子1:100稀释在1.5 x或- 2和混合精子悬液20μL样品,并使用血球和大1 毫米2区的细胞计数的青蛙精子数目。使用血球计数和采样率计算精子密度和收获精子的总数。这个总数一般为2 - 6 × 10 7体积约2毫升的精子时均采用双侧睾丸。稀释1.5 × OR2缓冲库存精子悬液,获得了2 × 10 7 /毫升的精子密度。使用的精子在2至3小时的准备检测。评估5μL精子1:10稀释的F - 1的缓冲和使用相衬光学可视化运动精子的活力。至少有40%至50%的精子应能动。即使是适当的准备,将包含大量的immotile精子,其中大部分是不成熟的。
  3. micropipetting到每口井700 F1的缓冲液,准备一个新的24孔塑料组织培养板。每口井应在底部直径约15毫米。
  4. 启动一系列稀释900 F1的缓冲液100μL精子悬液,离心管在室温(约21至23 ° C),激活渗透压冲击精子活力的检测。以这种方式激活每次新鲜精子,精子必须在1-2分钟内使用。
  5. 放置一个12微米孔隙率(12毫米OD)插入到一个缓冲区填充以及确保插入的位置偏离中心的一侧留下了空间。由一个具有切断尖的微量立即转移入井400μL的活力激活精子。精子悬液应用的过滤器插入墙上,并允许它运行到过滤器底部的THE插入;精子悬液不应该直接吸管上的过滤器。
  6. 小心微量的趋化剂,以及在空间之间以及偏离中心的过滤器插入到50μL。一是必须小心,存款的下降,井的侧面和底部的满足和退出,没有系统的干扰移液器。具体来说,柱塞上的微应推的第一站,从而彻底退出的样品,但没有气泡。
  7. 重复上述步骤2.5和2.6启动需要尽可能多的检测,然后孵化板,直到第一个实验开始孵育50分钟。通常情况下,可以启动检测,每45至60秒。注意:检测可以简化由有经验的人或两个人一起工作。在这种情况下,一个或两个行的检测,可与活动精子较大的股票和更快地提供精子的吹打发起始终使用1至2分钟内激活。
  8. 停止检测序列中的每个启动。首先,用一只手,并与其他的过滤器插入仔细稳定小心取出大部分或所有在上议院通过微管或用巴斯德吸管吸入精子悬液。随即,用细镊子,取出过滤器插入,并丢弃。在这一步必须谨慎使用,至少余下的精子席卷artifactually提高精子通过过滤器的值。
  9. 从每块板好,整个精子悬液转移到离心管。撤离前的精子悬液混合井自精子倾向于定居的底部是很重要的。加入15μL25%的甲醛的终浓度为0.5%V / V和冷藏精子计数,如果没有这样做的同一天。
  10. 颗粒的精子每管使用个人有一个2000年的最高速度离心10秒的按钮旋转小工删除所有,但100μLsupernat蚂蚁从每管,然后重悬沉淀在该卷。取20μL精子悬液,用蒸馏水稀释1:10,和上一个堂堂正正的显微镜上用一个40X的目标血球计数精子。使用计数和稀释因素来计算的,通过在每个检测通过过滤器的精子总数。

3。青蛙精子跟踪检测,使用Zigmond室

  1. 准备偷拍倒置显微镜工作站。我们使用尼康Elipse TE300倒置显微镜配备了索尼DXC - 390的3片彩色模拟视频摄像机或滨松ORCA - 03G单色数码相机。 Zigmond室幻灯片必须休息在舞台上在​​舞台板有足够的开放端,以容纳一个22x40毫米的玻璃盖。这项安排是必要的​​事实,青蛙的精子是无法对抗地心引力游泳。聚焦4倍或10倍的物镜观察两者之间的运行平台波谷。
  2. 进行测试,以确保相机是突出重点,围绕观测平台。如果使用索尼摄像机,将输出发送到一个视频显示器和一个A / D转换器(图像采集卡)能够从视频信号数字化每秒7帧。使用3 GHz或更高的计算机上运行最好具有4 GB或更多RAM的数字流处理。虽然我们使用Scion的图像控制天朝CG - 7的图像采集卡的软件(NIH的图片自定义Windows版本),这些产品都不再可用。一个当前的解决方案是使用一个模拟摄像头捕捉的VirtualDub插件Image J软件。如果滨松相机使用,其数字输出处理奥林巴斯cellSens软件和电脑显示器上显示。在这两种情况下,数据是作为一个8位TIFF栈内部或外部硬盘驱动器上保存。接穗图像软件需要使用TIFF图像序列转换为堆栈使用图像研究
  3. 准备在适当浓度的趋化因子在F1缓冲区。准备爪蟾精子如前所述,在1.5 × OR2缓冲存储,直到用冰。
  4. 组装Zigmond室。开始用干净室。使用微量的地方约5毫米,每个槽外缘平行线硅油(4μL)。一个22x40毫米的玻璃盖放置到允许硅油均匀地扩散到每个槽外缘分。如果初步实验结果表明,精子坚持是一个问题,一个可能需要与硝化棉涂层玻璃盖Fabro等建议。3。 Alternatively,包括蛋白质(如1%BSA)的缓冲区,也可以减少精子的坚持。
  5. 反转商会和地方在圆形切口,在显微镜下小心,玻璃盖不与接触阶段阶段。这倒配置是必要的,使爪蟾精子从低谷到平台。与哺乳动物精子, 爪蟾精子没有强大到足以对抗地心引力游泳,达到平台。
  6. 激活20μL 爪蟾精子在1.5 × OR2与在室温下的F1缓冲区搅拌1:10缓冲区。使用一个微管切割头,马上转移70μL的活力,激活精子进入低谷。这是实现以低角度的微管,并放置在槽侧开放的一角。弹出细胞悬液通过毛细作用填充槽和桥梁。下一步,填写对面槽在同样的方式使用chemoatttractant的解决方案。
  7. 在3分钟内开始摄录( 爪蟾的精子有一个有限的蠕动一生),并持续5分钟。在摄录年底,拆解室和水加压流,然后从一个喷瓶乙醇洗涤槽和观测平台。删除文件,小心不要污染的观测平台和波谷湿巾上表面的硅油。
  8. 如果需要的话,视频转换成TIFF图像序列或堆栈使用Image J软件捕捉到的数据。在图像J和第21帧(3秒),然后打开文件选择多达50精子进行跟踪。为了避免偏见,选择了从观测领域的所有地区和精子没有自己的轨迹数据的知识。捕捉时间(xyt数据集)的功能在XY平面二维每个精子细胞的轨迹点和点击鼠标的使用插件模块MtrackJ图像J.可视化轨迹和计算轨迹距离,轴组件和速度范围内MtrackJ。另外,开展这些行动和进一步的数值分析(如方向性,趋化参数和参数直方图)进口xyt数据集到Microsoft Excel。
  9. 每个精子检测整体的运动模式,包括直线,曲线和圆形图案以及如轮流功能在Excel绘制轨迹。利用xyt数据集来计算平均曲线速度,沿X净旅行(梯度) - Y轴,如旅行的平均相对梯度轴的角度和方向参数。

4。代表性的成果:

在两个腔检测的重要技术参数的大小和形状的腔,膜的孔隙率,并孵化的长度。上层室举行精子的大小不应该在直径过大,需要大量的精子(预ferably 0.5毫升或更少)上议院也不应如此之深的细胞悬液,以建立一个高柱(<1厘米)。下腔周围的上腔插入缓冲量应完全匹配的插入,以免创建一个跨膜静水压力,artifactually强行通过精子膜细胞悬液水平。进入底部的空插入第一个精子在初始向上的静水压力,防止精子膜在装载装载结果,安置。膜孔径的选择是由精子的大小,和多孔膜插入的商业可用性。我们发现,与青蛙的精子的检测可以利用8或12微米直径的毛孔虽然通过较高的精子允许更准确计数的数字为12微米孔隙。大于12微米的孔径不出现市售。采用TI的另一种方法ssue文化插入趋检测在96孔板设计Neuroprobe膜的使用。它们提供了一个潜在的更大的吞吐量和更广泛的孔径。虽然较大的哺乳动物精子似乎需要更大的孔径,我们已经成功地测定了小鼠精子趋化使用12微米毛孔(伯内特,未发表意见)插入。相比之下,规模较小的孔径大小可能会足够小精子(如海胆),虽然我们还没有测试过这种可能性。

两院描述检测的缺点之一是精子放置在上面从而不可避免地产生一些精子通过由重力室,从而减少了信号背景比。这是必要的事实, 爪蟾精子在他们的蠕动不严厉,足以对重力游泳的哺乳动物精子。化验爪蟾精子的另一个困难是事实,他们的蠕动升IFE时间短 - 激活后5至15分钟。这种限制是需要激活精子开展多个实验时,每2至3分钟的新一批的基础上。作为一个结果,时间当然有研究表明,大多数精子通过发生在第20分钟检测5。虽然我们用了50分钟的潜伏期,这期间可能会短路到20或30分钟。相比之下,小鼠精子仍然小​​时能动,我们已经使用了良好的效果(伯内特,未发表意见)的含量2小时期间。

在两院实验用青蛙的精子,精子传递通过多孔膜的总数通常是10到20万或放置在上议院插入精子约1至2%。中下室趋化梯度的存在可以提高精子的通过,为4至10倍之多。图2显示了一个典型的剂量反应曲线进行这个实验。一个EXTR爪蟾卵果冻(“蛋水”),其中包含已知的细胞趋化蛋白allurin(红色圆圈),行为被放置在底部室在一系列的稀释。每个检测中的蛋白质总蛋水微克/检测 - 在原来的50μL体积交付的数额。由于交付的蛋白质会形成扩散梯度,蛋白质的实际浓度范围内,精子回应不知道,但可估计为5至10倍,比蛋白的浓度较低的交付下降。出于这个原因,我们代表的介绍,蛋白质的量浓度。通常我们执行重复或一式三份检测各剂量和平均结果,然后复制整个实验3或4次,每次实验中使用不同的男性的精子。均值的均值和标准的错误是计算各剂量与标准错误的意思通常是5至10%的平均值。注意,蛋白质没有KNOWN趋化活动,如牛血清白蛋白(空心圆,图2)可能会产生精子通过非特异性较低的水平,通过增加膜。一个有趣的现象是,蛋水的剂量反应曲线是多相 - 一个上升阶段和下降阶段。这种类型的多相关系是常见的精子趋化因子;人类精子卵泡液的反应,显示了一个类似双相关系6,被认为是在附近发现一个鸡蛋的趋化,高浓度非常有用,可能有助于进一步减少搜索响应精子的一部分。

有时,我们发现,这个实验的控制值高于正常,从而减少趋化因子产生的褶皱增加。通常,这可以追溯到机械在检测的过滤器插入中断。因此,重要的是,插入不受到干扰,同时加载的精子或枝moattractant,在实验孵化时或插入删除。尤为关键的是,在插入的精子水库解除以及插入之前由微管或吸入删除。这将确保精子无法通过多孔膜进入底部室席卷插入删除。

Zigmond室法的重要的技术参数包括玻璃罩和观测平台之间的距离,视频观察的放大倍率,使用的光学类型和帧速率。观测平台之间的距离通常是10至15微米,虽然这个距离可以用来盖玻璃和室幻灯片之间的接口的硅油量不同 - 更多的石油,距离越远。薄薄的流体平面增加渐变形式以及一旦形成梯度长寿所需的时间量。较厚的流体平面允许更快速的克radient形成,但渐变有一个较短的寿命和不太稳定。趋化以及使用荧光染料或荧光葡聚糖,并用荧光显微镜来查看的动态,形成梯度的动态可视化。应匹配的分子量检测试剂正在使用的趋化和动态确定用于判断应允许梯度的形成和精子运动的记录多少分钟。

使用放大倍数应低整体(4X或10X的目标),如果整个观测平台是在分析我们所描述的条件的可视化。另一方面,更高的放大倍率(40X或63X的目标)可能是有用的,如果打算监测相对较短的轨迹段或希望解决鞭毛运动。跟踪可以进行半人工的方法,在本文或自动跟踪描述更多SOP实行如MetaMorph或Imaris轨道histicated软件包。在这两种情况下,跟踪性是非常依赖图像的对比度,无论是由运营商或软件辅助识别物体。虽然可能在某些情况下使用亮场光学相衬光学,使用或暗场光学是通常需要。最后,帧速率取决于跟踪所需的时间分辨率。如果在我们的程序中使用半人工的方法,可能是有限的,以相对较低的帧速率 - 4至8帧每秒 - 由于劳动密集性质,记录数据。另一方面,视频速率的意见,可能需要快速反应,如鞭毛波形式。通常情况下,实验的目标是最好的服务分别做慢的帧速率实验和更快的帧速率实验,因为人们还希望改变其他参数,如放大,光学或数字图像处理。

Zigm的典型结果第二个商会的跟踪检测,包括50视频剪辑的电影1青蛙精子看到的轨迹。对一个图像的观测平台,单个精子的运动轨迹跟踪,以红色为控制实验(没有趋化梯度目前)。可以绘制在XY平面上的时间为每个精子的功能的二维细胞轨迹MtrackJ和记录导入到Microsoft Excel中。轨迹分析,我们指定为X轴和正交轴Y轴的趋化因子梯度轴,最初由Fabro等公约一致。3。正如图3所示,采取实际轨迹的步骤组成的总和,其长度等于曲线的轨迹(蓝色/金色箭头)在距离前往。每个精子的净距离和旅行的方向是一个矢量连接的第一个和最后一个点的运动轨迹(红色斜向箭头)。 “旅游可分为净其X轴分量和Y轴组件(红色虚线箭头,也被称为净三角洲X和净三角洲Y,分别)。

,因为在脊椎动物精子的趋化可以涉及相对行驶方向的微妙变化,大量的精子(100至300),随机选取的,通常是分析每个通常需要4至6个独立的实验汇总数据的条件。然而,为了说明起见,我们将使用从只有五十青蛙的精子的数据。表1列出了常用的参数,用于检测精子旅行的变化。沿X轴的平均净旅游将显着增加,趋化因子的存在,如果作为一个整体的精子人口如下轨迹,更加紧密地配合梯度。在我们的例子中,平均净X轴行程增加了3倍蛋水的存在。你也可以绘制的ADVAN精子人口净X轴行程的直方图踏歌,可能会检测到较小的亚群的反应精子。 Fabro等3所开发的两个参数,还可以帮助检测这些人群。呈现出积极的净X轴行程(%ΔX> 0)的精子的百分比,呈现净线性旅行精子的比例不大于45度梯度轴(%ΔX/ |ΔY|> 1)可以显着增加整个精子人口是敏感的趋化因子或金额较小,但仍显著的,如果精子亚群敏感。我们在表1的例子显示在五十蛙精子接触到一个鸡蛋水梯度的这两个参数的增加。需要注意的是随机面向非运动将给予非零值,为50%,这些参数和25%;控制值高于(如表1)代表的背景下,由于低样本数或精子的方向,特别是实验设计中的偏见。

内容“的精子趋化剂旅游的方向性,可直接评估净旅行的载体,每个精子和梯度(X)轴之间的角度θ,我们的例子在表1显示,平均THETA下降精子游泳在一个鸡蛋水梯度表明,精子作为一个人口轨迹,更好地与梯度对齐。净X轴行程(见上文),精子人口thetas可以被表示为一个分布,这种方法也很敏感亚群反应的精子和最近研究Gakamsky 7 。

最后,也可以提取单个精子的曲线和瞬时速度从数据描述二维细胞轨迹在XY平面作为时间的函数。人们可能会发现,有速度增加,以及在旅行的方向转变,从而表明chemokinetic响应以及一个趋化反应。

这些数据代表一个精子运动轨迹分析的出发点。 Bohmer等一个时刻时刻的基础上进行进一步的分析可以包括8和芝等。9,自动检测伯内特等进行轮流10,和非线性为轨迹的线性度和曲率的测量。来衡量分形分析11,12。精子游泳这些轨迹是在更高的放大倍率监测,也形象鞭毛运动和实时钙信号8,9,13,14,15,16几个实验室进行。这些研究表明,无脊椎动物和哺乳动物精子回应精子向上坡度走向趋化源的急转弯,以趋化因子。这些轮流伴随着高达舵改变方向精子的鞭毛弯曲,弯曲,似乎发起的定义,波李克钙信号通过鞭毛传播。因此,精子跟踪的最终目标是相互关联的信号系统动力学与鞭毛推进精子方向的基础上为在趋化梯度的变化。这些目标还没有达到在蟾精子在螺旋运动 17旅行,展示自己轨迹10低曲率,其钙信号尚未进行监测。

虽然我们的重点在这里就详细说明我们用蟾精子的含量测定方法,无论是两个腔精子积累检测和Zigmond室跟踪检测可用于哺乳动物精子如果某些修改。两种检测可在37 ° C,如果进行所需,用幻灯片温暖,Zigmond室检测,显微镜阶段回暖。通常情况下,将被隔离,哺乳动物精子获能和培养使用适当的哺乳动物缓冲区ð趋化因子,但数据分析将会为两栖类动物在这里描述的是什么。另一个区别是,Zigmond室通常是放在一个堂堂正正的显微镜阶段直立哺乳动物精子以来,不像非洲爪蟾精子,可以游到观测平台。还未经测试,可能会看到这两个实验的应用在今后的工作中的物种数量的精子。

图1
图1双室法的示意图。精子放置在插入其底部是一个12微米毛孔的聚碳酸酯过滤器。一个趋化的解决方案是经过精心吸管入井开始形成一个浓度梯度。

图2
青蛙的精子图2。代表性的数据,使用两腔精子chemotaxi小号检测。 X蛋水配制非洲爪蟾卵展品多相剂量的特点是精子的趋化因子的活动曲线。牛血清白蛋白增加精子通过仅略 - 蛋白质的非特异性作用。图修改铝Anzi钱德勒5。

电影1。视频剪辑,显示青蛙精子轨迹绘制在红色的一个Zigmond室观察平台。该平台的宽度为1毫米。点击这里观看视频剪辑

图3
图3轴公约,精子曲线的轨迹和净线性旅行的向量绘制Zigmond室观测平台。获得的数据有三种类型。首先,精子轨迹(蓝色/金色箭头),可以揭示苏特定的模式CH界和圈(星号)。可以测量曲线距离和曲线速度的轨迹路径。其次,净直线距离在整个轨迹,(梯度)的旅游网络X轴分量旅行,净Y的旅行轴分量和角度theta之间的X轴和净旅行的载体,可以计算出每条轨迹作为对所有跟踪精子的分布比较。第三,在个别的轨迹段的旅行的速度和方向的瞬间变化可单独或作为一个人口研究。以上,会议厅一侧的观点是在一个图表。

表1。
表1参数经常用于从Zigmond室分析数据。

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Discussion

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要么变形虫运动或鞭毛动力的游泳运动细胞趋化在许多生物中发现和研究这一现象,需要提供实用,可靠的的检测。一些现象的例子,如精子海胆卵或粘菌细胞的聚集,形成子实体的吸引力,有直接的视觉冲击力。这种现象已艾森巴赫18所述的各种方法进行定量。这些实验包括充满毛细血管吸引精子,加入水库,以创建一个渐变和使用的一个Makler室中有精子和趋化井使用的毛细血管细胞趋化。本文介绍了两个“第二代”,现在更频繁地使用检测。虽然这些检测仍然依赖就需要创建一个渐变,他们采用了多种新功能。首先,两个室法的优势,众多的膜孔桑普LE精子通过,而不是一个跨梯度毛细血管开放,让更多的精子在一个单一的检测测试梯度。

定向细胞的运动模式是在趋化的主要特征,这是很自然的,已制定新的格式为追踪细胞。一个新的格式,是精子运动轨迹的三维扫描,因为他们的做法一个鸡蛋。使用红外线检测精子的位置移动平面,Zimmer和他的同事们提供了一腔与卵子结合中心的精子轨迹数据 - 一个设备,使用自然的趋化源,并具有相对遥远的墙壁,​​否则可能会破坏自然精子的运动19。另外,Corkidi等。开发了一个系统相结合的高帧速率的长工作距离目标快速运动捕捉三维轨迹20。在这种设备的精子运动分析最近一直使用的配极便利TES 21和格雷罗等。最近强调需要13未来的研究精子的趋化的立体观测。

相比之下,使用直角坐标Zigmond室,萨利Zigmond开发设备的研究方向和趋化中性粒细胞,在精子的趋化Giojalas和同事2,3的研究证明是有用的第一推动。的趋化因子的线性槽,而不是一个点源的趋化允许使用一种化学梯度设置在一个XY坐标系统,而不是一个径向坐标系统。 Giojalas应用这种检测在人类,小鼠,兔子和公牛精子的趋化的研究,并证实发现,卵巢的卵泡液中含有一个细胞化2,3,22。最近,Giojalas和艾森巴赫已经证明了卵丘细胞周围的鸡蛋也关闭,孕激素作为一个精子细胞趋化23-26。事实上,孕激素最近被触发精子Catsper渠道的开放启动的钙信号,认为修改精子鞭毛的弯曲,从而对精子游动27,28的方向。

Zigmond室有利有弊。一个优势是精子保持在设定的焦平面光简单和没有Z尺寸的扫描是必要的。另一个优点是使用直角坐标系,多数研究者都比较熟悉,并鼓励新的参数设计与比较常见的数学测试。另一方面,Zigmond室创建一个不像在自然界中发现的情况。精子是游泳两个近距离的墙壁之间,有可能影响他们的剧目鞭毛波的形式以及产生的力量的结果。同样,使用的趋化因子通常是化学和分散的不同会发生从一个鸡蛋。最后,坚持在墙上的精子是一个潜在的问题,不会在三维厅。

虽然一些调查表明,精子的跟踪是唯一可靠的方法来研究精子的趋化,这些实验可以是劳动密集,半手工,而非自动化的方法是用实验和数据分析阶段。出于这个原因,像双室法检测形容这里已被用于定量和可重复性的数据,可以趋化提供的证据。这类型的实验起源与Boyden小室,其中一个中性粒细胞悬液接触表面的多孔过滤器阻隔29。接触让一种化学梯度过滤器内形成自己的过滤器的对面被放置在一个趋化解决方案。细胞进入过滤器矩阵可以染色与计数米icroscopically,如果放射性标记,在闪烁计数器计数。这种做法得到了进一步发展chemotaxing细胞使用大孔径的聚碳酸酯过滤 ​​器,通过它可以通过在两个室法,这里描述 5 。

此前,我们已经验证作为衡量青蛙精子的趋化双室法。首先,使用鸡蛋作为诱食水,我们已经表明,精子通过刺激需要通过过滤器,一个浓度梯度沉积在底部室的单下降的趋化的创建。如果趋化因子是整个底部室缓冲区混合分散,精子的运动是不刺激5。二,创造一个“反向梯度”,除了顶式气室趋化不刺激精子的通过。最后,我们发现精子Zigmond室跟踪实验,精子活力和速度,是没有减弱或改变精子旅游相梯度(伯内特,未发表意见)的方向。这最后的观察是很重要的,因为它已经指出,抑制精子活力可能放慢或停止精子附近的化学源,从而提出了精子artifactual的积累,可能会认为趋化18。

尽管有这些警告,精子积累检测等双室法已被证明是非常有用的节省劳力的工具,已经 29,30细菌肽特征的中性粒细胞趋化在最初发现哺乳动物精子chemoattraction,卵泡液和孕激素6,31,32,和青蛙的精子细胞趋化allurin 4,5,33净化和表征。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们感谢他们的视频显微镜工作站使用的WM凯克生物成像实验室。支持这项研究是由NSF资助IBN - 0615435。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates BD Biosciences 35/1147
12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane EMD Millipore PIXP01250 We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued
Zigmond chamber Neuroprobe Z02
Silicone oil GE Healthcare SF1154 Equivalent to Dow Corning 550 Fluid
Image J software Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij Java program that runs on Windows, Linux and Mac
MtrackJ software Biomedical Imaging Group Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ Java program that runs on Windows, Linux and Mac
Virtual Dub software GNU General Public Licensed Free download via http://www.virtualdub.org/index.html Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only
cellSens software Olympus Corporation See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070 Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability

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References

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Burnett, L. A., Tholl, N., Chandler, D. E. Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction. J. Vis. Exp. (58), e3407, doi:10.3791/3407 (2011).More

Burnett, L. A., Tholl, N., Chandler, D. E. Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction. J. Vis. Exp. (58), e3407, doi:10.3791/3407 (2011).

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