Nous présentons un protocole de reprogrammation efficace des cellules somatiques humaines dans l'homme cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) en utilisant des vecteurs rétroviraux codant Oct3 / 4, Sox2, Klf4 et c-myc (OSKM) et l'identification des hiPSC correctement reprogrammé par coloration en direct avec des Tra 1-81 anticorps.
On présente ici un protocole de reprogrammation fibroblastes humains adultes humaines en cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) en utilisant des vecteurs rétroviraux encodant Oct3 / 4, Sox2, Klf4 et c-myc (OSKM) en présence de sodium 1-3 butyrate. Nous avons utilisé cette méthode pour reprogrammer passage tardif (> p10) fibroblastes adultes humaines dérivées de patients l'ataxie de Friedreich (GM03665, Coriell Repository). L'approche reprogrammation comprend protocole de transduction hautement efficace en utilisant une centrifugation répétitif de fibroblastes en présence d'un milieu contenant de virus. Les colonies hiPSC reprogrammées ont été identifiés à l'aide immunomarquage direct pour Tra-1-81, un marqueur de surface de cellules pluripotentes, séparés à partir de fibroblastes non-reprogrammés manuellement et passages 4,5. Ces hiPSC ont ensuite été transférés sur des plaques de Matrigel et cultivés dans des conditions exemptes de desserte, directement à partir de la plaque de reprogrammation. A partir du premier passage, les colonies hiPSC démontrer caractéristique HES-lmorphologie ike. En utilisant ce protocole, plus de 70% des colonies sélectionnées peuvent être élargi avec succès et mis en place dans des lignées cellulaires. Les lignes établies hiPSC affiché caractéristiques des marqueurs de pluripotence, y compris les marqueurs de surface TRA-1-60 et SSEA-4, ainsi que des marqueurs nucléaires Oct3 / 4, Sox2 et Nanog. Le protocole présenté ici a été établi et testé à l'aide des fibroblastes adultes obtenus chez des patients ataxie de Friedreich et de contrôle des individus, des fibroblastes humains 6 nouveau-nés, ainsi que les kératinocytes humains.
Étude des maladies humaines, notamment neurologiques et neurodégénératives, a été particulièrement difficile en raison de l'inaccessibilité de l'homme des modèles cellulaires adéquats. La capacité de reprogrammer des cellules somatiques faciles à obtenir en cellules souches pluripotentes induites et la possibilité de les différencier en divers types cellulaires a ouvert une possibilité de créer des modèles cellulaires de maladies génétiques. En outre, CSPi tenir une grande promesse pour l'…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l'ataxie de Friedreich Alliance de recherche et une subvention pilote de la famille Arnold Fondation et le Centre pour les cellules souches et la biologie du développement au MD Anderson Cancer Center.
Reagent | Company | Catalog number |
DMEM | Invitrogen | 11965 |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
KSR | Invitrogen | 10828 |
Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
bFGF | Stemgent | 03-0002 |
Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
Objective marker | Nikon | MBW10010 |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
polybrene | Sigma | H9268 |
Object marker | Nikon | MBW10010 |