Summary
We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.
Abstract
Hierin we een protocol herprogrammering menselijke volwassen fibroblasten in humane geïnduceerde pluripotente cellen (hiPSC) met retrovirale vectoren die coderen Oct3 / 4 Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) in aanwezigheid van natriumbutyraat 1-3. We gebruikten deze methode om laat de passage herprogrammeren (> p10) volwassen mens fibroblasten afgeleid van ataxie van Friedreich patiënt (GM03665, Coriell Repository). De herprogrammering aanpak omvat efficiënte transductie protocol het veelvuldig centrifugeren van fibroblasten in de aanwezigheid van virus-bevattende media. De geprogrammeerd hiPSC kolonies werden geïdentificeerd met levende immunohistochemie voor Tra-1-81 een oppervlak merker pluripotente cellen gescheiden van niet-geherprogrammeerd fibroblasten en handmatig gepasseerd 4,5. Deze hiPSC werden vervolgens overgebracht naar Matrigel platen en gekweekt in feeder-vrije omstandigheden, rechtstreeks van de herprogrammering plaat. Vanaf de eerste passage, hiPSC kolonies te tonen karakteristieke hES-like morfologie. Met deze protocol meer dan 70% van de geselecteerde kolonies met succes kan worden uitgebreid en opgesteld in cellijnen. De gevestigde hiPSC lijnen weergegeven kenmerk pluripotentie markers zoals markers TRA-1-60 SSEA-4, en nucleaire markers Oct3 / 4 Sox2 en NANOG. Het protocol hier gepresenteerd is vastgesteld en getest met behulp van volwassen fibroblasten afkomstig van ataxie van Friedreich patiënten en controle individuen 6, menselijke pasgeboren fibroblasten, maar ook humane keratinocyten.
Protocol
1. Virus productie en transductie
- Plaat Phoenix ampho cellen een dichtheid van 8x10 ~ 7 6 per 10 cm plaat in 10 ml DMEM medium (DMEM hoog glucose, 10% FBS warmte geïnactiveerd, 2 mM L-glutamine, zonder antibiotica). Plaats in de couveuse cultuur nacht bij 37 ° C, 5% CO2.
- De volgende dag transfecteren Phoenix cellen met behulp van 12 ug van een vector die codeert voor een Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc, of GFP-gen (Addgene plasmiden 17217, 17218, 17219, 17220) en 35 ul Fugene 6. Bereid transfectie mengsel in 500 ul DMEM medium (DMEM hoog glucose, 2 mM L-glutamine, zonder FBS en antibiotica). Incubeer 20 minuten. Voorzichtig pipet DNA complexen in de 10 cm platen die 70-80% confluent Phoenix cellen.
- Plaats media 6-8 uur na transfectie met DMEM medium (DMEM hoog glucose, 10% FBS warmte geïnactiveerd, 2 mM L-glutamine) met penicilline en streptomycine.
- Vervolgens verzamelen virus-bevattende media 4 maal in 12 hintervallen, combineren alle delen en gefilterd met behulp van een 0,45 pm filter om vrijstaande cellen en afval (media met virale deeltjes kunnen worden bewaard in de koelkast voor 2 weken zonder verlies van besmettelijke activiteit, hoe bevriezing wordt niet aanbevolen) te verwijderen.
- Voor retrovirale transductie, plaat volwassen mens fibroblasten (passage 10, Coriell Laboratories) van een bevroren voorraad 24 uur voorafgaand aan de laatste dag van retrovirale media collectie. Zaad de cellen 6-well platen gelatine onder de dichtheid 1x10 5 cellen per well in DMEM hoge glucose, 10% FBS, 2 mM L-glutamine, penicilline, streptomycine en niet-essentiële aminozuren.
- De volgende dag vervangende DMEM-media met media met virale deeltjes afkomstig van Phoenix cellen. Voeg virale media (1 ml van elk Oct4, Sox2, Klf4 en c-myc media, 4 ml totaal) aangevuld met 6 ug / ml polybreen in elk putje van de 6-wells plaat van fibroblastculturen en centrifugeer bij 1600 g van 1 uur bij 20 ° C. Ongeveer 12 uur after de transductie, vervang dan de virale media met fibroblast kweekmedium. Voer virale infectie en centrifugatie 3 keer 24 uur intervallen.
- Cultuur fibroblasten in DMEM media gedurende 48 uur na de laatste infectie. Controleer de efficiëntie van infectie door parallel transductions met retrovirale expressie media GFP. Figuur 1 illustreert de doelmatigheid van centrifugatie-vergemakkelijkt retrovirale infectie van humane fibroblast.
2. Herprogrammering
- Bereid 6 wells platen met γ-bestraalde MEF feeder lagen door enten MEF cellen een dichtheid van 2x10 ~ 5 cellen per putje van de gelatine behandelde 6 wei-plaat in fibroblast groeimedium. De volgende dag verdeeld geïnfecteerd humane fibroblasten met 0,05% trypsine / EDTA en zaai ze de dichtheid van ~ 1.2x10 4 per putje in de fibroblasten groeimedium.
- De volgende dag vervangen door media met HES media (DMEM/F12, 20% Knockout Serum vervanging, niet-essentiële aminozuren, penicillin / streptomycine, 2 mM L-glutamine, 0,1 mM β-mercapto-ethanol, 20 ng / ml basale Fibroblast Growth Factor (bFGF), aangevuld met 0,5 mM natriumbutyraat voor de eerste zeven dagen de herprogrammering. Dagelijks veranderen media.
- Dagelijks Monitor morfologische veranderingen in de getransduceerde cellen. Kolonies HIPS-achtige cellen gaan ongeveer 5 ontstaan - 10 dagen na overdracht van de getransduceerde cellen fibroblasten op feeder. De hiPSC kolonies staan klaar om ongeveer 14 worden geïsoleerd - 28 dagen na plating ze op de MEF feeder cellen.
3. Isolatie van hiPSC kolonies
- Een dag voor het plukken van hiPSC kolonies bereiden 24-well platen met γ-bestraalde MEF feeder cellen (~ 4x10 4 cellen per putje) in fibroblasten groeimedium. In dit stadium hiPSC kolonies kunnen ook worden overgedragen aan feeder vrije cultuur met behulp van Matrigel en mTeSR1 medium.
- Voorafgaand aan de isolatie van hiPSC kolonies te bereiden MEF platen door het verwijderen van fibroblasten groei medium en spoelen MEFs met PBS om sporen van FBS te verwijderen. Vervolgens 0,5 ml hES medium (of mTeSR1 medium bij Matrigel beklede putjes) met 10 pM ROCK inhibitor Y27632 aan elk putje 7,8.
- Verwijder indien nodig de fibroblasten rond de hiPSC kolonies met een 21 gauge naald onder een microscoop gemonteerd in een laminaire stroming kap (figuur 2A - C). Spoel de platen met PBS en voeg verse hES media die de Tra-1-81 StainAlive specifiek antilichaam (1:200, Stemgent). Na 30 minuten. Te vervangen medium met het antilichaam met verse hES media aangevuld met 10 pM ROCK inhibitor. Onderzoek de platen onder de fluorescentie microscoop en Mark Tra-1-81 positieve kolonies met behulp van een objectieve marker (Figuur 2D).
- Snij de Tra-1-81 positieve hiPSC kolonies onder een microscoop een laminaire kap, in meerdere kleine stukjes met een 21 gauge naald zoals in figuur 2E en F.
- Met behulp van een automatische pipet (P200) overdracht fragmenten van hiPSC kolonies in de individual putjes van de 24-wells plaat met MEFs of Matrigel. Vermijd het overdragen van niet-heupen cellen. Plaats de platen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator en laat de hiPSC kolonies te voegen gedurende 24-36 uur.
- Change HES of mTeSR1 (voor kolonies gegroeid op Matrigel) media per dag. De hiPSC kolonies met de juiste hES-achtige morfologie zichtbaar 48 uur na de eerste overdracht op een 24-wells plaat.
- Handmatig passage hiPSC koloniën om de 6 - 8 dagen op een 12-well en vervolgens op een 6-wells plaat.
- Na klonale expansie en waarin hiPSC lijnen analyseren expressie van pluripotentie markers TRA-1-60 SSEA-4, Oct3 / 4 Sox2 en NANOG met immunocytochemie zoals weergegeven in figuur 3. Evalueer genomische integriteit en differentiatie potentieel van de verkregen lijnen met behulp van karyotype en teratoom vorming analyses 6,9.
4. Representatieve resultaten
Efficiënte transductie met retrovirus-bevattende media is van cruciaal belang voor een succesvolle herprogrammering. Het verdient aanbeveling de gehele transfectie / infectie procedure voeren met een GFP expressie virus elke herprogrammering experiment om de efficiëntie volgen zoals weergegeven in figuur 1. De titer van het GFP expressie virus bepaald als beschreven in 10 via de transductie van humane fibroblasten met niet-virale geconcentreerde media was kenmerkend in het traject van 0,5 - 5 x 10 7 virusdeeltjes per ml (vp / ml).
Fibroblasten veranderen morfologie al 2 dagen na de laatste infectie. Getrypsiniseerd menselijke fibroblasten moet zorgvuldig worden geteld op zaaien ze op de MEF feeder cellen. Het wordt aanbevolen om zaad cellen op 3 verschillende dichtheden (6x10 3, 1.2x10 4, 2.5x10 4 per enkele, goed van een 6-wells-plaat), omdat elke cellijn toont verschillende groei karakteristiek en zaaien dichtheid is van cruciaal belang voor de efficiëntie van de herprogrammering. Natriumbutyraat gebruikt vooreerste 7-14 dagen herprogrammering verhoogt de efficiëntie van hiPSC vorming ongeveer 5 maal. Vaak, vooral wanneer geïnfecteerde fibroblasten werden gezaaid met hogere dichtheid, kan de fibroblast-achtige cellen overwoekeren een kweekschaal en omvatten hiPSC kolonies zoals getoond in figuur 2A. In dit geval kan de fibroblast laag nauwkeurig worden opgetild en overgebracht naar hiPSC kolonies (Figuur 2B) bloot te leggen. Vervolgens dient hiPSC kolonies worden gespoeld met HES media en gekleurd met Tra-1-81 antilichaam. Afhankelijk van de fibroblast cellen, ongeveer 20 - 40% van de kolonies te tonen met de IPSC-achtige morfologie niet vlek met Tra-1-81 antilichaam. Vastgestelde hiPSC kolonies kan worden overgedragen van een plaat binnen komende 12 - 24 uur. Langdurige incubatie zal resulteren in een snelle differentiatie van hiPSCs. Kolonies kunnen handmatig worden gepasseerd op een MEF feeder cellen of Matrigel-gecoate platen. Na expansie opgericht hiPSC klonen moet worden getest met behulp van immunocytochemie (ICC) voor de expressie van pluripotency markers zoals in figuur 3. Bovendien moet een gedetailleerde moleculaire karakterisering van de gegenereerde iPS cellijnen zijn: analyse van de genexpressie pluripotentie met RT-PCR, demonstratie van de DNA demethylering de promoters van genen pluripotentie en analyseren van de transgenen geluiddempende 9.
Figuur 1. De efficiëntie van transductie virale bepaald volgens GFP expressie retrovirus. (A, B) Human volwassen fibroblasten afgeleid van Friedreich ataxie patiënt (GM03665, Coriell Repository) werden gevisualiseerd na twee infecties met GFP retrovirale media. (C, D) humane fibroblasten werden geïnfecteerd met dezelfde partij van het GFP retrovirale media afcentrifugeren van de cellen direct op de 6-wells platen gedurende 1 uur bij 1600 g. Beelden werden gevangen genomen 48u na de infectie.
Figuur 2. Identificatie en isolatie van hiPSC kolonies. (A) fase contrast beeld van een plaat met hiPSCs omgeven door fibroblasten. De cellen werden gedurende 21 dagen hES media. (B, C) Dezelfde hiPSC kolonie na verwijdering van de omringende fibroblast laag. (D) opnieuw aangeleerd hiPSC kolonies worden geïdentificeerd door live kleuring met Tra-1-81 oppervlak marker antilichaam, gesneden met behulp van een steriele naald (E, F) en overgedragen aan afzonderlijke putjes van een 24-wells plaat.
Figuur 3. De expressie van het pluripotentie specifieke markers Oct3 / 4, NANOG, Sox2, SSEA4 en Tra-1-60 in hiPSCs werd bepaald door middel van immunocytochemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bestuderen van menselijke ziekten, met name neurologische en neurodegeneratieve, is een bijzondere uitdaging door de ontoegankelijkheid van voldoende menselijke cellulaire modellen. De mogelijkheid om gemakkelijk verkrijgbaar somatische cellen te herprogrammeren tot geïnduceerde pluripotente stamcellen en het potentieel om te differentiëren in verschillende celtypes opende een mogelijkheid om cellulaire modellen van genetische ziekten te creëren. Daarnaast iPSCs bezit zijn van een grote belofte in de toekomst van regeneratieve geneeskunde. Daarom is het noodzakelijk dat optimaliseren en betrouwbare, efficiënte en veilige wijze van herprogrammering somatische cellen pluripotentie.
Vanuit het perspectief van therapeutische toepassingen, is het cruciaal om een veilige aanpak van de IPSC generatie ontbreekt voetafdruk mutaties in de gastheer genoom te ontwikkelen. Methoden somatische herprogrammering zonder dat er vaste wijzigingen in het genoom van geherprogrammeerd cellen zoals transfectie van episomale vectoren gebruik van accijns transposons, adenovirale infectie, en directe levering van mRNA of eiwitten zijn al ingesteld 11-15. Tot zover de herprogrammering efficiëntie met deze transgene vrij methoden laag en afhankelijk van het karakter, type en de leeftijd van geherprogrammeerd somatische cellen. Daarom zijn deze protocollen niet geschikt zijn voor herprogrammering laat de passage, volwassen somatische cellen vaak afgezet in cel repositories. Bovendien, om gedetailleerde karakterisering van meerdere IPSC regels mogelijk te maken en nieuwe modellen van ziekten bij de mens vast te stellen en high-throughput drug-schermen uit te voeren, herprogrammering van somatische cellen met behulp van virale levering van transcriptiefactoren is een adequate strategie. Als u meer dan 20 studies op heden gemeld generatie van patiënt-specifieke iPSCs tot model menselijke neurologische en neuromusculaire ziekten. In op een na alle gevallen zijn de iPSCs werden gegenereerd met behulp van lentivirale of retrovirale transductie 16.
De gegevens tonen dat een eenvoudige protocol op the retrovirale levering van OSKM transcriptiefactoren kan worden efficiënt herprogrammeren volwassen menselijke fibroblasten, zelfs hoge passage. De hoeveelheid virus verkregen uit een transfectie van cellen Phoenix 10 cm plaat voldoende is voor meer dan 10 herprogrammering experimenten. Er zijn drie belangrijke stap in herprogrammering protocol volwassen fibroblasten: (i) zeer efficiënte transductie virale vergemakkelijkt door een extra centrifugatiestap gedurende transductie met aanmerkelijk verhoogt de efficiëntie van transductie, (ii) zaaien dichtheid van de getransduceerde fibroblast op de MEF en ( iii) het gebruik van levende kleuren met de Tra-1-81 merker-antilichaam aan selectie vergemakkelijken potentieel volledig geherprogrammeerd kolonies die direct kunnen worden overgebracht naar feeder-vrij culturen. De efficiëntie van herprogrammering aanzienlijk verbeterd door natriumbutyraat in tweede week de herprogrammering. Bovendien hebben we waargenomen dat een grotere fractie van de IPSC kolonies gekweekt inde aanwezigheid van het geneesmiddel kan worden uitgebreid en vastgelegd in volledig opnieuw geprogrammeerd IPSC lijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de ataxie van Friedreich Research Alliance en een pilot subsidie van Arnold Family Foundation en het Centrum voor stamcellen en ontwikkelingsbiologie bij MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| KSR | Invitrogen | 10828 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 | |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8628 | |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S | |
| Tra-1-60 antibody | EMD Millipore | MAB4360 | |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S | |
| SSEA4 | EMD Millipore | MAB4304 | |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G | |
| Objective marker | Nikon Instruments | MBW10010 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 05850 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Fugene 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Object marker | Nikon Instruments | MBW10010 |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
- Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich's ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
- Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O'Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Yu, J., Thomson, J. A. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. Lanza, R. , Elsevier Inc. 331-337 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).
