Välja och isolera Kolonier av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller omprogrammeras från vuxna fibroblaster
Summary
Vi presenterar ett protokoll för effektiv omprogrammering av mänskliga somatiska celler till humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) med retrovirusvektorer som kodar Oct3 / 4, Sox2, Klf4 och c-myc (OSKM) och identifiering av korrekt omprogrammeras hiPSC med levande färgning med Tra- 1-81 antikropp.
Abstract
Häri presenterar vi ett protokoll av omprogrammering humana adulta fibroblaster in i humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) med användning av retrovirala vektorer som kodar Oct3 / 4, Sox2, Klf4 och c-myc (OSKM) i närvaro av natriumbutyrat 1-3. Vi använde denna metod för att omprogrammera sent passage (> P10) humana vuxna fibroblaster som härrör från Friedreichs ataxi patienten (GM03665, Coriell Repository). Den omprogrammering tillvägagångssätt innefattar effektiv transduktion protokoll med användning av upprepad centrifugering av fibroblaster i närvaro av virus-innehållande media. De omprogrammerade hiPSC kolonier identifierades med användning av levande immunfärgning för Tra-1-81, en ytmarkör av pluripotenta celler, separerades från icke-omprogrammerade fibroblaster och manuellt passerades 4,5. Dessa hiPSC överfördes sedan till Matrigel plattor och odlades i feeder-fria betingelser, direkt från omprogrammering plattan. Med utgångspunkt från den första passagen, hiPSC kolonier visar karaktäristiska HES-like morfologi. Användning av detta protokoll mer än 70% av utvalda kolonier kan framgångsrikt expanderas och etablerad i cellinjer. De etablerade hiPSC linjerna visas karakteristiska pluripotensbestämmande markörer inklusive ytmarkörer TRA-1-60 och SSEA-4, samt kärnkraft markörer Oct3 / 4, Sox2 och NANOG. Protokollet presenteras här har fastställts och testats med vuxna fibroblaster som erhållits från FA patienter och individer kontroll 6, mänskliga nyfödda fibroblaster, liksom humana keratinocyter.
Protocol
Discussion
Studiet av människans sjukdomar, särskilt neurologiska och neurodegenerativa, har speciellt utmanande på grund av otillgänglighet tillräckliga mänskliga cellulära modeller. Förmågan att programmera lätt erhållbara somatiska celler in inducerade pluripotenta stamceller och potentialen för att särskilja dem i olika celltyper öppnas en möjlighet att skapa cellulära modeller av genetiska sjukdomar. Dessutom iPSCs hålla en mycket lovande i framtiden regenerativ medicin. Därför är det viktigt att utveckla …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av FA alliansen och en pilot bidrag från Arnold Family Foundation och The Center for Stem Cells och utvecklingsbiologi vid MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 11965 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
| KSR | Invitrogen | 10828 |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
| Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
| SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
| Objective marker | Nikon | MBW10010 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
| Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
| polybrene | Sigma | H9268 |
| Object marker | Nikon | MBW10010 |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
- Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich’s ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
- Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O’Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Yu, J., Thomson, J. A., Lanza, R. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. , 331-337 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).
