Summary

Välja och isolera Kolonier av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller omprogrammeras från vuxna fibroblaster

Published: February 20, 2012
doi:

Summary

Vi presenterar ett protokoll för effektiv omprogrammering av mänskliga somatiska celler till humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) med retrovirusvektorer som kodar Oct3 / 4, Sox2, Klf4 och c-myc (OSKM) och identifiering av korrekt omprogrammeras hiPSC med levande färgning med Tra- 1-81 antikropp.

Abstract

Häri presenterar vi ett protokoll av omprogrammering humana adulta fibroblaster in i humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) med användning av retrovirala vektorer som kodar Oct3 / 4, Sox2, Klf4 och c-myc (OSKM) i närvaro av natriumbutyrat 1-3. Vi använde denna metod för att omprogrammera sent passage (> P10) humana vuxna fibroblaster som härrör från Friedreichs ataxi patienten (GM03665, Coriell Repository). Den omprogrammering tillvägagångssätt innefattar effektiv transduktion protokoll med användning av upprepad centrifugering av fibroblaster i närvaro av virus-innehållande media. De omprogrammerade hiPSC kolonier identifierades med användning av levande immunfärgning för Tra-1-81, en ​​ytmarkör av pluripotenta celler, separerades från icke-omprogrammerade fibroblaster och manuellt passerades 4,5. Dessa hiPSC överfördes sedan till Matrigel plattor och odlades i feeder-fria betingelser, direkt från omprogrammering plattan. Med utgångspunkt från den första passagen, hiPSC kolonier visar karaktäristiska HES-like morfologi. Användning av detta protokoll mer än 70% av utvalda kolonier kan framgångsrikt expanderas och etablerad i cellinjer. De etablerade hiPSC linjerna visas karakteristiska pluripotensbestämmande markörer inklusive ytmarkörer TRA-1-60 och SSEA-4, samt kärnkraft markörer Oct3 / 4, Sox2 och NANOG. Protokollet presenteras här har fastställts och testats med vuxna fibroblaster som erhållits från FA patienter och individer kontroll 6, mänskliga nyfödda fibroblaster, liksom humana keratinocyter.

Protocol

1. Virusproduktion och transduktion Plattan Phoenix amfo-celler vid en densitet av ~ 7-8×10 6 per 10 cm platta i 10 ml DMEM-medium (DMEM hög glukoshalt, 10% FBS värmeinaktiverat, 2 mM L-glutamin, utan antibiotika). Plats i inkubatorn och kulturen över natten vid 37 ° C, 5% CO2. Nästa dag transfektera Phoenix celler med användning av 12 pg av en vektor som kodar för antingen Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc-eller GFP-genen (Addgene plasmider 17.217, 17.218, 17.219, 17.220) och…

Discussion

Studiet av människans sjukdomar, särskilt neurologiska och neurodegenerativa, har speciellt utmanande på grund av otillgänglighet tillräckliga mänskliga cellulära modeller. Förmågan att programmera lätt erhållbara somatiska celler in inducerade pluripotenta stamceller och potentialen för att särskilja dem i olika celltyper öppnas en möjlighet att skapa cellulära modeller av genetiska sjukdomar. Dessutom iPSCs hålla en mycket lovande i framtiden regenerativ medicin. Därför är det viktigt att utveckla …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av FA alliansen och en pilot bidrag från Arnold Family Foundation och The Center for Stem Cells och utvecklingsbiologi vid MD Anderson Cancer Center.

Materials

Reagent Company Catalog number
DMEM Invitrogen 11965
DMEM/F12 Invitrogen 11330
KSR Invitrogen 10828
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140
Sodium butyrate Sigma B5887
Y27632 Stemgent 04-0012
bFGF Stemgent 03-0002
Tra-1-81 antibody Stemgent 09-0069
Oct3/4 antibody Santa Cruz sc-8628
Nanog antibody Cell Signaling Technology 4903S
Tra-1-60 antibody Millipore MAB4360
Sox2 antibody Cell Signaling Technology 3579S
SSEA4 Millipore MAB4304
CF1 MEFs Globalstem GSC-6201G
Objective marker Nikon MBW10010
Matrigel BD Biosciences 354277
mTeSR1 StemCell Technologies 05850
β-mercaptoethanol Sigma M7522
Fugene 6 Roche 11814443001
polybrene Sigma H9268
Object marker Nikon MBW10010

References

  1. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
  3. Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
  4. Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  5. Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
  6. Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich’s ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
  7. Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O’Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
  8. Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  9. Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
  10. Yu, J., Thomson, J. A., Lanza, R. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. , 331-337 (2009).
  11. Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  12. Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  13. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
  14. Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  15. Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  16. Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).

Play Video

Cite This Article
Polak, U., Hirsch, C., Ku, S., Gottesfeld, J., Dent, S. Y., Napierala, M. Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts. J. Vis. Exp. (60), e3416, doi:10.3791/3416 (2012).

View Video