Summary
세포 연구에 수단과 증가 역할을하며, 발견과 새로운 치료제의 개발. 우리가 첨부 의존 세포를 성장과 수확에 대한 더 효율적이고 효과적인 방법이 필요 세포의 더 많은이 증가 필요성과. 오른쪽 기능을 Multilayered 술병이 목적를 검색할 수 있습니다.
Abstract
셀 기반 애플 리케이션의 증가 세포의 큰 숫자가 필요합니다. 세포의 큰 번호가 필요한 경우 소규모 확장하는 동안 적절 한가 단일 레이어 T - flasks의 사용은, 복잡하고 힘드는 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 이 요구를 충족시키기 위해, 새로운 다층 세포 배양 용기의 성능이 T - flasks 단일 계층에서 세포 쉽게 규모를 촉진하기이 논의됩니다. T - 175 flasks에 비해 5 - 레이어 형식과 각각의 문화와 완벽하게 세 복구 및 세포의 다섯 번 번호를 사용 - 테스트 flasks 3에서 사용할 수 있습니다. BD 멀티 플라스크의 핵심 기능으로 - 그릇 혼합뿐만 아니라 각 선박의 레이어 사이 사이 세포 및 시약의 균일한 분포로 일관 환경 거기에 교양 수있는 세포를 만들 수 있도록 신속하게 믹스 / 평균 항구 T - 175 flasks에 합동이다.
이러한 멀티 Flasks의 디자인도 C에 대한 수onvenient 피펫 직접 flasks에 시약과 세포를 추가뿐만 아니라 귀중한 세포 및 시약의 효율적인 복구에 대한 액세스하고 쏟아져에 의한 오염의 위험을 줄여줍니다. 붓는가 pipetting 이상 선호 어플 리케이션 디자인 귀중한 세포 및 시약의 소모를 줄이기 위해만큼 최소한의 잔류 액체 보유를 허용합니다.
Protocol
1. 프로토콜 세포 배양을위한 멀티 Flasks을 사용하는
- 선박의 준비와 세포 현탁액을 추가
- 필요에 따라 세포 성장 매체를 준비합니다.
- 멀티 플라스크 세로로 작업 표면 (무균 층류 후드)에 직면하고있는 캡과의 측면에 선.
- 이러한 flasks 3에서 사용할 수있는 5 층 형식과 T - 175 술병과 비슷한 작업 흐름 패턴을 사용합니다.
- 풀어 뚜껑을 제거합니다. 50 또는 100 ML의 피펫을 사용하여 플라스크 내부 또는 외부로 쏟아져 사전 예열 매체의 필요한 금액을 추가합니다.
- 멀티 Flasks이 모자가 위쪽을 향하고와 세로로 배치하는 경우 ≤ 10 ML은 선박의 바닥에 도달할 수 있습니다 아르 Pipettes. Pipettes ≥ 10ml 이는 선박 미디어의 큰 볼륨을 추가할 수있는 편리한 포털을 제공, 멀티 술병에있는 로고 과거 즉시 혈관에 도달할 수 있습니다.
- 매체의 버블링을 피하기 위해, FL에 액체 스트림을 허용멀티 술병의 뚜껑 (로고 쪽)의 내벽을 따라 오우.
- 10 ML 피펫 및 캡 flasks을 사용하여 상위 계층을 통해 성장 매체에 집중 세포 주식의 세포 현탁액을 추가합니다.
도움말 :
- 교통 인큐베이터 사이트에 카트 멀티 Flasks하고 나머지 단계를 수행합니다.
- 셀 시딩 밀도는 셀 유형, 매체 및 문화 기간이 필요에 따라 달라집니다. 표준 T - 175 flasks에서 사용하는 시딩 밀도와 미디어 볼륨으로 시작하여 형식이 사용되는 다중 술병에 따라 3 또는 5 곱하면됩니다.
- 세포의 혼합
- 위치를 믹스 : 로고가 직면하고 함께 똑바로 멀티 휴대용 술병을 잡고 카운터 45 ~ 시계 방향 각도 당신을 마주 믹스 포트.
- 같은 각도에서 개최, 부드럽게 상단 레이어의 액체까지 (당신을 멀리 목) 앞에서 뒤쪽으로부터 멀티 휴대용 술병을 기울 것은 완전히 소모될 downwar믹스 포트를 통해 DS. 믹스 포트쪽으로 돌고.
- 마찬가지로, 부드럽게 중간 완전히 혼합 포트를 통해 상단을 향해 아래쪽 레이어에서 하수구까지 뒤에서 앞에서 (당신쪽으로 목)에 다중 휴대용 술병을 바위. 단계 1.2.2과 적절한 혼합을 보장하기 1.2.3 한 번 더 반복합니다.
- 다시 믹스 위치 (1.2.1 단계)에 멀티 휴대용 술병을 지참하고 1.3 단계로 진행
- 또는 세포 현탁액은 멀티 술병에서 외부 준비할 수 있으며, 세포 현탁액은 피펫을 사용하여 혈관이나 부드러운 쏟아져하여 추가할 수 있습니다.
- 믹스 포트는 미디어와 세포의 인 - 선박은 혼합 수 있으며 외부 세포 정지의 큰 볼륨을 만들 필요가 없습니다.
- 또한 멀티 술병의 레이어에 걸쳐 미디어 등화 수 있습니다
- 유체의 평균
- 혼합 / 세포 현탁액의 추가 후, 장소 멀티 플라스크 수직 평면 작업 표면에 액체 볼륨 equa를 맞춰야베드로 모든 레이어 인치
- 각각의 레이어로 분할 액체
- 당신이 직면하고있는 로고와 함께 멀티 휴대용 술병을 잡고 레이어의 각 파티션에 45 ° 각도 액체 시계 방향으로 회전.
팁 :
- 최상의 결과를 얻으려면이 단계 1.3-1.4의 평면 작업 표면을 사용하는 것이 중요합니다
- 당신이 직면하고있는 로고와 함께 멀티 휴대용 술병을 잡고 레이어의 각 파티션에 45 ° 각도 액체 시계 방향으로 회전.
- 수송
- 일단 세포 현탁액을 포함하는 미디어 전송 멀티 술병은 같은 45 ° 각도 (시계 방향) 거리에 인큐베이터로 믹스 포트에서 미디어 단계 1.4.1에서와 같이에서 분할됩니다. 현미경에서 볼 배양기에서 flasks를 제거하면이 위치도 적합합니다.
- 보육 선반에 멀티 술병 배치
- 에서 멀티 휴대용 술병을 들고 45 ° 각도 (시계 방향, 거리 믹스 포트에서), 부드럽게로 믹스 포트에서 거리 모퉁이를 사용하여 (배양기 표면에 가로로 내려 회전피봇). 로고가 직면와 함께 멀티 휴대용 술병을 놓는다.
- 팔콘 멀티 플라스크 디자인은 선박이 스택을 허용하고 튼튼한 스택 갈비뼈에 의해 장소에서 그들을 보유하고 있습니다.
- 에서 멀티 휴대용 술병을 들고 45 ° 각도 (시계 방향, 거리 믹스 포트에서), 부드럽게로 믹스 포트에서 거리 모퉁이를 사용하여 (배양기 표면에 가로로 내려 회전피봇). 로고가 직면와 함께 멀티 휴대용 술병을 놓는다.
- 세포 및 시약의 유통
- 작업 표면에 평평하게 멀티 플라스크를 삽입 후, 부드럽게 앞뒤로 바위와 사이드 사이드 각 계층에서 액체를 엎지르지 않도록주의를 복용 문화 표면에 균일하게 세포를 배포할 수 있습니다. flasks를 스택.
- 이 플라스크는 광학 명확 물질로 만들어져 있으며 마지막 레이어에 세포는 쉽게 현미경에서 볼 수 있습니다.
- 작업 표면에 평평하게 멀티 플라스크를 삽입 후, 부드럽게 앞뒤로 바위와 사이드 사이드 각 계층에서 액체를 엎지르지 않도록주의를 복용 문화 표면에 균일하게 세포를 배포할 수 있습니다. flasks를 스택.
- 미디어 교환
- 기음하는 동안 직면하고있는 로고와 함께 왼쪽으로 기울이기는 멀티 술병 (믹스 포트 쪽).
- 다음 기울기, 오른쪽에있는 멀티 술병, 모든 잔여 미디어를 대기음을 이어갑니다.
- 미디어의 적절한 금액을 추가하고 단계 1.3-1.7을 따르십시오
2.멀티 Flasks에서 수확 세포
- 세포 라인까지 멀티 Flasks 수직을 떼어 놓다 및 위치 (1.2.1 단계)를 섞어 각 하나를 가지고 있습니다. 부드럽게 미디어 멀티 술병의 상단 레이어 배수 수 있도록 같이 목이 그래서 당신이 직면와 flasks로 바꾸란.
- 당신이 믹스 포트 근처에 액체 수준에 도달할 때까지 목을 통해 5 또는 10 ML aspirating 제보를 넣습니다. 지친 매체 기음.
- 분리 시약 / 세척 버퍼를 추가하고 단계 1.2.1에서와 같이 위치를 섞어 가지고 다음, 진행 및 단계 1.3-1.7를 수행합니다. 성장 매체 / 중화 요원과 함께 중화 및 수신 튜브에 세포 현탁액을 잔 또는 세포가 유출되는 등의 휴대용 술병을 바꾸란 상단 선박의 층 및 10 ML의 피펫을 사용하여 세포를 수집합니다.
팁 : 알에서 미디어의 완전한 배수를 허용하기 위해, 셀 또는 시약의 회복을 향상시킬 위치 (1.2.1 단계)를 섞어 멀티 휴대용 술병을 가지고, 교환을 향해 목이 반전하기 상단 레이어에 내 계층. 멀티 술병이 바뀌 남아 있고 난 후, 기울기 멀티 플라스크는 45 ° 각도 (거리 믹스 포트에서)를 시계 방향으로. 남은 시약를 수집하는 피펫 (10-10 ML)를 사용합니다.
3. 팔콘 멀티 Flasks에서 권장 작업 볼륨
성장 매체
3 층 : 멀티 플라스크 당 75-150 ML
5 층 : 멀티 플라스크 당 125-250 ML
해리 대리인
3 층 : 멀티 플라스크 당 ≥ 15 ML
5 층 : 멀티 플라스크 당 ≥ 25 ML
팁 : 표준 T - 175 flasks에 사용되는 중간 볼륨으로 시작하고 단위 면적 당되는 ML은 동일하게 유지하므로 평가 멀티 술병에 형식을 따라 3 또는 5 배 곱하면됩니다.
4. 대표 결과 :
팔콘 멀티 플라스크 1. 설계
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. 그림 1 : 멀티 플라스크의 세포 배양 혈관은 3에서 사용할 수있는 - 그리고 규모 - 업 각각 525과 875cm이 성장 면적을 제공하는 세포의 5 레이어 스택 형식입니다. 피펫 액세스뿐만 아니라과로와 밖으로 혈관의 세포 및 시약의 제거를 용이하게합니다. 믹스 포트의 존재는 멀티 술병의 모든 레이어에 걸쳐 미디어의 급속한에 - 선박 믹싱 및 균등화를위한 수 있습니다.
. 2 세포 수율은 멀티 플라스크를 사용하여 :
이러한 선박 3에 해당하고 T - 175 flasks의 5 배 면적 3 계층과 5 계층 형식으로 사용할 수 있습니다. 따라서, ≥ 3과 5 회 (130 ± 6.8 × 10 6 218 ± 23.6 각각 X 10 6 세포) BHK - 21의 숫자 (아기 햄스터 신장)이 세포가 T - 175에 비해 성장 및 멀티 플라스크로부터 복구되었습니다 flasks (43.2 ± 3.5 X 10 6 세포, Fig.2A). U 당 세포 수율알 표면 면적은 3 동등한되었습니다 - 5 층 멀티 Flasks와 BHK - 21 T - 175 flasks, LnCAP (인간의 전립선 선암 세포 라인), C 형 간염 - G2 (인간 hepatocarcinoma 세포 라인), EcoPack 2-293 (인간 신장 세포 라인)과 같은 세포 공급 업체 (ATCC, 시그마 및 / 또는 Clontech)에서 권장하는 성장 미디어 (레이어 당 35 ML)에서 48 - 96h 기간 (Fig.2B)에 대한 교양. 전지는 자동 바이올렛 - CELL 카운터 (1)에 열거되었다.
그림 2A : BHK 21 세포의 세 다섯 배 번호가 성장하고 복구되었습니다 3 - 5 - 레이어 멀티 Flasks T - 175 flasks에 비해. 예상 수확량은 컨트롤에서 의미 세포 수율을 사용하여 결정되었다 T - 175 3, 셋, 다섯 번 곱한 flasks - 5 층 멀티 Flasks 각각 (N = 4 flasks / 포맷).
그림 2B : cm 2 당 세포 수율은 3 상응하는어요 - 5 층 멀티 Flasks와 BHK - 21, LnCAP, HepG2 및 EcoPack2 - 293 세포에 대한 T - 175 flasks. 각 막대는 4-6 flasks의 의미 나타냅니다. BHK - 21 세포 (11,000 cells/cm2) 72 시간, LnCAP 전지 (20,000 cells/cm2)와 EcoPack2 - 293 세포 (~ 35,000 cells/cm2)에 대한 교양 있었다가 96시간 및 HepG2 세포 (25,000 세포 / cm 2 교양되었습니다 )는 48 시간 이전에 수확 교양되었습니다.
멀티 플라스크의 레이어 사이 3. 미디어 분포
세포 배양 매체 (DMEM, Invitrogen)는 5 계층 멀티 Flasks (250 mL/5-layer 용기)에 추가 및 프로토콜은 위에서 설명한에 따라 레이어로 분할되었다. 미디어 배포는 개별 레이어에서 밖으로 펌핑 각 계층 및 미디어에 구멍을 천공하여 측정되었다. 각 계층에서 발견한 액체의 무게는 그림 3과 같이 레이어에서 레이어로 비교적 균일한 것으로 판명되었다. 그들은 다음과 같습니다 : 510.8 ± 0.73, 50.3 ± 0.58, 50.21 ± 0.13, 49.88 ± 0.35, 49.45 ± 0.37 (GM).
그림 3. 5 층 멀티 플라스크의 다섯 가지 레이어의 각 통일 미디어 배포. 세포 배양 매체는 equilibrated 및 개별 레이어로 분할 다중 Flasks (250 ml/5-layer 용기)에 추가되었습니다. 미디어는 개별 레이어와 유체 무게로 뚫고 구멍을 통해 밖으로 펌핑되었다 각 계층 (n은 = 6 flasks)에서 기록되었다.
멀티 플라스크의 층 사이에 4. 세포 분포
셀이 추가되고 멀티 술병 내에서 혼합 수 있습니다. 우리 비즈 (10μm, PolySciences 주식 회사)를 사용하여 다중 플라스크의 층 사이에 세포의 시뮬레이션 배포 세포의 크기와 유사합니다. 비드 정지는 상단 레이어를 통해 10 ML의 피펫을 사용하여 멀티 플라스크 용기로 추가되고 내림차순으로 선박의 미디어 믹스되었다위의 프로토콜 ribed. 비드 배포 비드 서스펜션이 각 레이어에서 밖으로 펌핑되었다 포함된 각각의 레이어와 유체의 드릴링 구멍에 의해 측정되었다. 각 계층에서 발견한 비드 농도는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터에서 읽고 기록했다. 3 계층 멀티 Flasks (Fig.4A)에 상응하는 상호 층 비드 배포판은 아래와 같습니다. 믹스 - 포트 멀티 플라스크 레이어 사이의 세포 및 시약의 균일한 분포를 수 있습니다.
그림 4A : 3 층 멀티 플라스크의 세 가지 레이어의 각 비드 분포. (권, 미디어 볼륨 1시 10분입니다 비드 정지 권)는 구슬의 중지 (3.6 X10 6 / ML)은 멀티 Flasks에 적절 중간에 추가되었으며 혼합, 평균 및 설명된 프로토콜을 사용하여 파티션 단계로 따라갔다. 각 계층 (중간 각 레이어에 구멍을 뚫고 펌프)에서 복구 비드 농도는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운트를 읽어되었습니다어 및 기록. 계층 멀티 Flasks (N = 5 flasks) - 3 상응하는 상호 층 비드 배포판은 아래와 같습니다
아래와 같이 보충 성장 미디어에서 3 계층 멀티 Flasks에서> 80 % 합류로 성장 세포의 Ecopack 2-293 얼룩 패턴을 대표하는 이미지가 있습니다. 세포 monolayers는 고정 및 스테인드 크리스탈 바이올렛과 멀티 플라스크 레이어는 다음 잘린 및 이미지 (2) 스캔했습니다. 참고 셀 patterning는 멀티 플라스크 (Fig.4B)의 모든 레이어에 동질적인되었습니다. 비슷한 결과는 여러 세포 유형 (데이터가 표시되지 않음) 평가와 함께 획득했다.
그림 4B :이 그림은 다중 Flasks의 층 사이에 균일한 세포 성장을 보여줍니다. 3 계층 멀티 Flasks 및 T - 175에서> 80 % 합류로 성장 Ecopack - 2-293 전지는 고정 및 크리스탈 보라색 묻다되었습니다. 멀티 플라스크 혈관이 절단되었고 각각의 스테인드 계층은 스캔했습니다.
5 멀티 플라스크의 공기 공급. :
96시간을위한 교양 EcoPack2 - 293 세포에서 BioProfile 플렉스 분석기 (3,4)을 (노바 의생명)를 사용하는 동안 미디어의 분석 5 층 멀티 Flasks 대 T - 175 flasks (81.03 속에서 자란 세포의 공기 포화에 차이를 알려주지 않았다 ± 1.9 대 83.4 ± 5.8 % 주변 O 2).
그림 5 : 동안 미디어의 에어 채도 (% 주변 O 2) 5 층 멀티 Flasks 대 T - 175 flasks에서 미리 혼합 미디어와 유사했다. EcoPack2 - 293 세포는 35,000 세포 / cm 2의 밀도에 씨앗을 품고 사전 미디어 분석 (N = 3 flasks)에 96시간위한 교양되었습니다.
Discussion
현재 연구는 멀티 술병 디자인 연구자 제공하는 생산성의 증가를 보여줍니다. 멀티 Flasks를 사용할 때 최적의 성능을 위해 위에서 설명한 단계를 수행하는 것이 중요 반면, 가장 중요한 것으로 간주됩니다이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이것은에 파티션 멀티 플라스크 플랫 게시물 누워있는 레이어의 각 (III)에 액체를 분할 후 시계 방향으로 45 °의 각도로 멀티 휴대용 술병을 운반 용기 (2) 이내 믹스 포트를 사용 전지 및 시약의 혼합은 (i) 포함 인큐베이터.
멀티 플라스크의 적절한 사용은 T - 175 flasks (5)에 일치하는 환경에서 양식 각 선박 내에서 균일한 세포 인구의 생산 리드. 이 선박은 T - 175 술병과 비슷한 면적에 3과 5 배 이상 세포를 제공합니다. 3과 5 계층 우주선이 각각 525과 성장 영역의 875cm 2를 제공하고 공간과 노동의 모두를 제공합니다사용자 avings. 조직 문화 표면 처리 따라서 필요없이 스케일 업 가능 표준 flasks 비교 다시 최적화 기존의 문화 조건 또는 품질, 균질성 또는 셀 (6, 7)의 성능을 저하. 이것은 또한 이전에 수집된 데이터 comparability을 위해 제공합니다. 이 선박은 또한 콜라겐과 같은 시약과 코팅 수, 첨부, 성장과 같은 hepatocytes 8, kertainocytes 9, 혈청이없는 미디어 속에서 자란 줄기 세포와 같은 특정 세포 유형의 차별 화를위한 전문 하층을 제공하기 위해 폴리 - D - 라이신, fibronectin 공법. 코팅 솔루션은 이전 culturing 세포에 귀중한 시약의 소모뿐만 아니라 코팅 솔루션의 효과적인 제거를 줄이기 위해 최소한의 잔류 않도록 액체 유지로 제거할 수 있습니다. 레이어 당 25-50 ML로 번역 0.142-0.287 ML / cm 2에서 멀티 flasks 범위의 문화 세포에 권장되는 최적의 미디어 볼륨. 다른 multilayered 플라스크, T 달리그의 제품은 내에서 각 선박의 레이어 사이 세포 및 시약의 균일한 분포로 - 그릇 혼합뿐만 아니라 신속한 수있는 용기에 섞어 포트를 제공합니다. 다양한 세포 라인, 차 문화와 줄기 세포는 멀티 Flasks을 사용하여 효율적으로까지 축소되었습니다. 이 선박은 높은 처리량 - 심사, 백신 생산, 바이러스성 벡터 transfections 및 세포 치료와 같은 세포의 큰 숫자를 요구하는 애플 리케이션에 특히 유리한 있습니다.
시간, 공간, 노동 감소 폐기물 발생의 절감 단일 계층 선박에 종래의 문화 대 멀티 술병의 핵심 위닝 있습니다. 우리 문화 5 수확 세포의 약 세 번 숫자를 수있는, T - 175 3를 사용하여 동일한 공간에 flasks, 5 층 멀티 Flasks. 우주 절약에이 장점은 T - 175에 국한되지뿐만 아니라 다른 선박으로 확장될 수 있습니다 : 일반 실험실 incubators 하우스에 맞는 표준 롤러 병 장치 ~ 4 rol850cm이 표면 영역을 제공하는 각각의 ler 병 (2,200 ML). 같은 영역에서 ~ 20, 5 레이어 다중 Flasks 따라서 문화 전지 다섯 배의 성장 표면을 제공 지내게 될 수 있습니다. 또한, "이동 - 그린 '인식의 증가, 폐기물 생성을 줄이기 위해 옵션이 매우 바람직합니다. 그런 점에있어서, 38 %는 T - 175 flasks 이러한 장점에 비해 멀티 Flasks를 사용하여 폐기물 발생의 감소 리드 (5, T - 175 flasks 한 5 레이어 다중 술병이 ~ 400g 무게 반면에 ~ 640g의 무게)가 있습니다 폐기물 저장 및 처리 비용 및 사용자에게 경제적 절감 결과에 감소합니다.
Disclosures
모든 저자 Becton 디킨슨, Biosciences 세그먼트, 디스커버리 Labware 단위의 직원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 | BD Biosciences | 353143 | |
| 5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100ml pipette | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml aspirating pipette | BD Biosciences | 357501 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 flask Tissue Culture-treated | BD Biosciences | 353028 | |
| Gram Crystal Violet | BD Biosciences | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Fetal Bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma-Aldrich | T8159 | |
| BHK-21 cells | Sigma-Aldrich | 85011433 | |
| Hep-G2, LnCAP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech Laboratories | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polystyrene Bead | Polysciences, Inc. | 24628-20 | |
| Bio-Profile Flex Analyzer | Nova BioMedical |
References
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