Summary
細胞は、研究に尽力し、さらなる役割を果たす、と発見と新しい治療法の開発。我々は添付ファイル依存性細胞の成長と収穫のためのより効率的かつ効果的な方法を必要とする細胞の数が多いためにこのニーズが高まっている。右側の機能を持つ多層フラスコは、この目的を果たすことができる。
Abstract
セルベースのアプリケーションの増加は、多数の細胞を必要とする。多数の細胞が必要な場合、小規模な拡張中に適切な単層のT -フラスコ、の用法は、、面倒な手間と時間がかかる場合があります。このニーズに対応するため、新しい多層細胞培養容器の性能はT -フラスコの単層からの細胞の容易なスケールアップ容易にするためには、議論される。 T - 175フラスコに比べて、と5層の形式とそれぞれの文化と完全な3の回収と細胞の5倍の数を有効にする - テストフラスコは3で利用可能です。 BDマルチフラスコの重要な特徴は、容器内の混合だけでなく、各容器の層内との間に細胞や試薬の一様分布として、一貫して環境という点で培養することができる細胞を生成急速なことができるミックス/平衡ポートです。 T - 175フラスコと合同です。
これらのマルチフラスコのデザインは、cが可能onvenientピペットで直接フラスコに試薬と細胞を加えるだけでなく、貴重な細胞や試薬の効率的な回収のためのアクセスとは注ぐによる汚染の危険性を低減します。注ぐがピよりも好まれているアプリケーションの場合、デザインは貴重な細胞と試薬の無駄を減らすように最小限の残液の保持が可能になります。
Protocol
1。細胞培養用マルチフラスコを使用するプロトコル
- 船の調製と細胞懸濁液を追加
- 必要に応じて細胞増殖培地を準備。
- マルチフラスコ垂直作業面（滅菌層流フード）に上向きにキャップとの側面にラインアップ。
- これらのフラスコは3で利用可能で、5層のフォーマットとT - 175フラスコと同様の作業の流れのパターンを使用してください。
- 緩め、キャップを取り外します。 50または100 mLのピペットを用いてフラスコにまたは注入によって予め温めておいた培地の必要な量を追加します。
- マルチフラスコはキャップが上を向いて垂直に配置された場合≤10 mlの容器の底に達することができるものを薦めます。ピペット≥10ミリリットル、それによって血管へのメディアの大きなボリュームを追加する便利なポータルを提供する、マルチフラスコのロゴを過ぎてすぐに容器に到達することができます 。
- 培地の泡立ちを防ぐために、フロリダ州への液体の流れを許可するマルチフラスコの蓋（ロゴ側）の内壁に沿ってOW。
- 10 mLのピペットやキャップのフラスコを使用してトップ層を介して増殖培地中に濃縮された細胞株からの細胞懸濁液を追加します。
ヒント：
-トランスポートインキュベーターのサイトへカートのマルチフラスコと残りの手順を実行します。
-細胞の播種密度は細胞の種類、培地および培養期間の必要性によって異なります。標準T - 175フラスコに使用されるものと播種密度およびメディアのボリュームで始まり、形式が使用されるマルチフラスコに応じて、3または5を掛けます。
- 細胞の混合
- ミックスポジションでは：あなたが直面しているロゴが直立マルチフラスコを持ち、あなたが直面しているミックスのポートと45 °の角度に反時計回し。
- 最上層の液体が完全にdownwar排水溝まで、前面から背面（あなたから離れて、首）にマルチフラスコ優しくチルト、同じ角度に保持し混合ポートを介してDS。混合ポート側でピボット。
- 媒体が混合ポートを介して上部に向かって底層から完全に排水されるまで同様に、ゆっくりとバックからフロント（あなたに向かって首）にマルチフラスコを揺らし。ステップ1.2.2と適切な混合を保証するために1.2.3つのより多くの時間を繰り返します。
- バックミックスポジション（ステップ1.2.1）へのマルチフラスコをもたらすと1.3に進んでください
- 別の方法として、細胞懸濁液は、マルチフラスコから外部に製造することができると細胞懸濁液をピペットを用いて容器にまたは穏やか注ぐことによって追加することができます。
- ミックスポートは、メディアと細胞の混合、容器に可能になり、外部から細胞懸濁液を大量に作る必要がなくなります 。
- また、マルチフラスコの層を介してメディア等化を可能に
- 流体の平衡
- ミキシング/細胞懸濁液を追加した後、場所マルチフラスコ垂直に平らな作業台の上に液体の体積方程式を均一化するインディアナ州インディアナポリスのすべての体に含まれています。
- 各レイヤーに分割する液体
- あなたが直面しているロゴがマルチフラスコを押しながらレイヤーのそれぞれに分配へ45 °の角度液体に時計回りに。
ヒント：
-最良の結果を得るには、ステップ1.3から1.4のために平らな作業台を使用することが重要です
- あなたが直面しているロゴがマルチフラスコを押しながらレイヤーのそれぞれに分配へ45 °の角度液体に時計回りに。
- 交通
- 一度細胞懸濁液を含むメディアがパーティション化され、離れてインキュベーターにミックスのポートからメディアとステップ1.4.1と同じ45 °の角度（時計回り）でマルチフラスコを運ぶ。顕微鏡での表示用にインキュベーターからフラスコを取り外すときは、この位置にも適しています。
- インキュベーター棚の上にマルチフラスコの配置
- でマルチフラスコを保持して45 °の角度（時計回り、離れて混合ポートから）、静かに混合ポートから離れてコーナーを使用して（インキュベータの表面に水平に、それを下に回転させピボット）。ロゴを上に向けてマルチフラスコを置く。
- ファルコンマルチフラスコのデザインは、船を積層することができますし、頑丈なスタッキングリブによって所定の位置にそれらを保持しています 。
- でマルチフラスコを保持して45 °の角度（時計回り、離れて混合ポートから）、静かに混合ポートから離れてコーナーを使用して（インキュベータの表面に水平に、それを下に回転させピボット）。ロゴを上に向けてマルチフラスコを置く。
- 細胞と試薬の配布
- 作業面に平らにマルチフラスコを配置した後、軽く前後に揺すり、サイド、サイドにそれぞれの層から液体をこぼさないように注意しながら培養表面に均一に細胞を配布する。フラスコを積み重ねる。
- このフラスコは、光学的に透明な材料で作られており、最後の層上の細胞は容易に顕微鏡で見ることができます 。
- 作業面に平らにマルチフラスコを配置した後、軽く前後に揺すり、サイド、サイドにそれぞれの層から液体をこぼさないように注意しながら培養表面に均一に細胞を配布する。フラスコを積み重ねる。
- メディア交換
- あなたが直面しているロゴと左に傾けるマルチフラスコ（ミックスのポート側）しながら吸引する。
- その後、すべての残留培地を吸引除去するために継続、右側に、マルチフラスコを傾けて。
- メディアの適切な量を追加し、ステップ1.3から1.7に従ってください
2。マルチフラスコから収穫細胞
- 垂直マルチフラスコアップセル、行を解離し、 位置 （ステップ1.2.1）を混在させるそれぞれをもたらすこと。ゆっくりと首がそのようなメディアは、マルチフラスコの最上層にドレインできるようにする必要が直面しているとフラスコを反転させる。
- あなたがミックスのポートの近くに液体のレベルに達するまで首〜5または10 mLの吸引先端を挿入します。疲れ培地を吸引除去する。
- 解離試薬/洗浄バッファーを追加し、ステップ1.2.1のように位置をミックスにもたらす、次に進み、ステップ1.3から1.7に従ってください。増殖培地/中和剤で中和し、受信側のチューブに細胞懸濁液を注ぐOR細胞がに排出するようなフラスコを反転容器の上部層と10 mLのピペットを用いて細胞を集める。
ヒント ：アルからのメディアの完全な排水を可能にするために、細胞や試薬の回収を強化する位置（ステップ1.2.1）を混在させるマルチフラスコを持って、演算子に向かって首を逆にするには最上層へlの層。マルチフラスコが反転したままその後、チルトマルチフラスコは45 °の角度（離れてミックスのポートから）を時計回りに回し。残りの試薬を収集するためのピペット（1〜10 mL）を使用してください。
3。ファルコンマルチフラスコの推奨作業量
成長メディア
3層：マルチフラスコ当たり75〜150 mLの
5層：マルチフラスコあたり125〜250 mLの
解離剤
3層：マルチフラスコ当り≥15 mLの
5層：マルチフラスコ当り≥25 mLの
ヒント：標準のT - 175フラスコで使用される培地量で開始し、単位表面積当たりその溶解が変わらないように評価されたマルチフラスコに形式に応じて3〜5倍を掛ける。
4。代表的な結果：
ファルコンマルチフラスコ1。設計
files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg"/>
図1：マルチフラスコ細胞培養容器は、3でご利用いただけます-とスケールアップをそれぞれ525と875センチメートル2成長表面積を提供する細胞のための5層積み重ね可能なフォーマット。ピペットのアクセスは、ほかとに - と外容器の細胞と試薬の除去を容易にする。混合ポートの存在は、マルチフラスコの全層にわたってメディアの急速な炉内ミキシングとイコライゼーションが可能になります。
2 セルを使用して収量マルチフラスコ ：
これらの船舶は、3に対応し、T - 175フラスコの5倍の表面積の3層と5層の形式で提供されています。のそれに応じて、≥3と5回（それぞれ130 ± 6.8 × 10 6および218 ± 23.6 × 10 6個の細胞、）数BHK - 21（ベビーハムスター腎臓）細胞がT - 175に比べて成長し、マルチフラスコから回収したフラスコ（43.2 ± 3.5 × 10 6細胞; Fig.2A）。 U当たりの細胞収率NITの表面積が3に相当した - と5層マルチフラスコおよびBHK - 21用T - 175フラスコ、LNCaPの（ヒト前立腺癌細胞株）、HEP - G2（ヒト肝細胞株）、ECOPACK 2から293まで（人間の腎臓細胞株）などの細胞のベンダー（ATCC、シグマおよび/またはクロンテック）が推奨する増殖培地中、48 96時間の期間（図2b）（層あたり35 ml）を培養した。細胞は自動でViセルカウンター（2）に列挙された。
図2A：BHK - 21細胞の3と5倍の数を増殖させ、回復3からされた-と5層マルチフラスコT - 175フラスコに比べて。期待利回りは、コントロールからの平均細胞収率を用いて決定したT - 175 3の3と5倍を掛けたフラスコ - と5層マルチフラスコそれぞれ（n = 4のフラスコ/フォーマット）。
図2B：1cm 2当たりのセルの収率は3で同等であった-と5層マルチフラスコおよびBHK - 21用T - 175フラスコ、LNCaP細胞、HepG2およびEcoPack2 - 293細胞。各バーは、4〜6フラスコの平均値を表します。 BHK - 21細胞（11,000 cells/cm2）72時間、LNCaP細胞（20,000 cells/cm2）とEcoPack2 - 293細胞（〜35,000 cells/cm2）培養した、96時間およびHepG2細胞（25,000細胞/ cm 2のために培養した）収穫前に48時間培養した。
マルチフラスコの層の間で 3 メディアの分布
細胞培養培地（DMEM、Invitrogen）を5層マルチフラスコ（250 mL/5-layerの容器）に追加され、上述のプロトコールにしたがって層に分配した。メディアの分布は個々のレイヤーから送り出さ各レイヤとメディアに穴をあけることによって測定した。それぞれの層から回収された液体の重量を図3に示すように、層から層への比較的均一であることが判明した。それらは次の通りです：510.8 ± 0.73、50.3 ± 0.58、50.21 ± 0.13、49.88 ± 0.35、49.45 ± 0.37（GM）。
図3。5層マルチフラスコの5層のそれぞれに一様メディア配信。細胞培養培地は、個々のレイヤーに平衡化＆パーティション、マルチフラスコ（250 ml/5-layerの容器）に登録されました。メディアは、個々の層と流体の重量に開けた穴を通って圧送され、各層（n = 6フラスコ）から記録された。
マルチフラスコの層の間に 4 セルの分布
細胞は、マルチフラスコ内に添加して混合することができます。我々ビーズ（10μm以下、PolySciences社）を使用してマルチフラスコの層の間の細胞のシミュレートされた分布のセルのサイズに似て。ビーズの懸濁液を上部層を介して10 mLのピペットを使用してマルチフラスコ容器中に添加し、DESCなどの容器内のメディアと混合し、上記のプロトコルにribed。ビーズの分布は、ビーズ懸濁液を含む各レイヤーと流体の穴をあけることにより測定した個々の層から汲み上げられた。それぞれの層から回収したビーズ濃度はコールターカウンターで読み取られ、記録された。 3層マルチフラスコ（Fig.4A）に相当する層間ビーズのディストリビューションを以下に示します。混合ポートは、マルチフラスコの層の間の細胞や試薬の均一な分布を可能にします。
図4A：3層マルチフラスコの三層のそれぞれのビーズの分布。記述されたプロトコルを用いて平衡化し、パーティションのステップが続く、との混合ビーズの懸濁液（3.6 × 10 6 / ml）をマルチフラスコ（巻：：メディアのボリュームが1:10である、巻ビーズ懸濁液）に分注した培地に添加した。それぞれの層（培地各レイヤーに開けた穴を通してポンプ）から回収されたビーズ濃度はコールターカウントに読まれましたERと記録。層マルチフラスコ（n = 5のフラスコ） - 3の等価な層間ビーズのディストリビューションは以下の通り
以下のように補足した増殖培地で3層のマルチフラスコで> 80％コンフルエントに培養した細胞のECOPACK 2から293染色パターンの代表的なイメージです。細胞単層を固定し、染色し、クリスタルバイオレットで、マルチフラスコの層は、その後切断され、画像は（2）スキャンした。 （注）、細胞のパターニングには、マルチフラスコ（Fig.4B）のすべての層で均質であった。同様の結果が複数の細胞型（データは示さず）評価が得られた。
図4Bは、次の図は、マルチフラスコの層の間に均一な細胞の成長を示しています。 3層マルチフラスコおよびT - 175で> 80％コンフルエントまで増殖さECOPACK - 2 - 293細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。マルチフラスコの船が切断し、各染色された層がスキャンされた。
5 マルチフラスコ内の空気の供給。
96時間培養EcoPack2 - 293細胞からBioProfile FLEXアナライザ（3,4）（ノヴァバイオメディカル）使用済のメディアの分析では5層マルチフラスコ対T - 175フラスコ（81.03で培養した細胞の空気飽和に差は見られなかった± 1.9対83.4 ± 5.8パーセント、周囲O 2）。
図5：費やしたメディアの空気飽和（％周囲のO 2）対T - 175フラスコ5層マルチフラスコからのプレミックスメディアで同等であった。 EcoPack2 - 293細胞を35000個/ cm 2の密度で播種し、前のメディア分析（n = 3のフラスコ）に96時間培養した。
Discussion
現在の研究では、マルチフラスコのデザインは、研究者を提供する生産性の増加を示しています。マルチフラスコを使用するときにパフォーマンスを最適化するために上記の手順に従うことが重要です、一方、最も不可欠とみなされるこのプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。これらは、に分割マルチフラスコフラットのポストを敷設層のそれぞれの（ⅲ）に流体をパーティショニング後に時計回りに45 °の角度でマルチフラスコを輸送容器（II）内で混合ポートを使用して、細胞や試薬の混合（i）は含まれていますインキュベーター。
マルチフラスコの適切な使用は、T - 175フラスコ（5）と合同な環境で培養されている各容器内に均一な細胞集団の生産につながる。これらの船舶は、T - 175フラスコと同様のフットプリントで3と5倍以上のセルを提供しています。 3と5層構造の容器にはそれぞれ、成長のエリアの525および875センチメートル2を提供し、スペースと労働の両方を提供ユーザーへのマイ。組織培養表面処理は、このようにスケールアップ、既存の培養条件を再最適化または細胞（6,7）の品質、均一性やパフォーマンスを犠牲にすることなく可能にする標準のフラスコに匹敵するものです。これはまた、以前に収集されたデータとの比較のために用意されています。これらの船舶は、肝8、kertainocytes 9、無血清培地で増殖させた幹細胞などの特定の細胞型の付着、増殖および分化のための専門的な基層を提供するために、また、ポリ- D -リジンなどコラーゲン、フィブロネクチンなどの試薬 で被覆することができる製剤。コーティング溶液は、前の細胞を培養するために貴重な試薬の浪費だけでなく、コーティング液の効果的な除去を低減するように最小限の残液の保持と削除することができます。層ごとに25〜50ミリリットルに変換0.142〜0.287ミリリットル/ cm 2とからマルチフラスコ範囲内の培養細胞への推奨される最適なメディアのボリューム。別の多層フラスコ、Tとは異なり、彼の製品はだけでなく、内と各容器の層の間の細胞や試薬の均一な分布を混合、容器の急速なことができる容器にミックスポートを提供しています。多様な細胞株、初代培養や幹細胞は、マルチフラスコを用いて効率的にスケールアップされています。これらの船舶は、ハイスループットスクリーニング、ワクチンの生産、ウイルスベクターのトランスフェクションと細胞治療のような多数のセルを要求するアプリケーションに特に有利である。
時間の節約は、スペース、労働力の減少、廃棄物発生量は、単層容器の従来の文化に対するマルチフラスコの主要な賞金です。我々は、文化5から収穫された細胞の約3倍の数、T - 175 3を使用して、同じ空間でフラスコ、5層マルチフラスコをすることができます。省スペースのこの利点は、T - 175にのみ限定されるものではなく、他の船舶に拡張することができます：一般的な実験室のインキュベーターハウスに収まる標準ローラーボトル装置〜4 ROL850センチメートル2表面の面積を提供するそれぞれのLERのボトル（2200ミリリットル）。同じエリアでは、〜20、5層マルチフラスコは、このように培養細胞に5倍の成長表面を提供する収納することができる。さらに、"ゴーグリーン"意識の高まりとともに、廃棄物の発生を削減するためのオプションは非常に望ましいことです。その点で、38％がT - 175フラスコ及びこれらの利点に比べてマルチフラスコを用いて廃棄物発生量の減少は、リード（5、T - 175フラスコ一、5層マルチフラスコは〜400グラムの重さに対し、〜640グラムの重さ）がある廃棄物の保管と廃棄のコストやユーザーへの経済的な節約の結果では減少する。
Disclosures
すべての著者は、ベクトンディッキンソン、バイオサイエンス事業、ディスカバリー実験器具ユニットの従業員です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 | BD Biosciences | 353143 | |
| 5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100ml pipette | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml aspirating pipette | BD Biosciences | 357501 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 flask Tissue Culture-treated | BD Biosciences | 353028 | |
| Gram Crystal Violet | BD Biosciences | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Fetal Bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma-Aldrich | T8159 | |
| BHK-21 cells | Sigma-Aldrich | 85011433 | |
| Hep-G2, LnCAP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech Laboratories | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polystyrene Bead | Polysciences, Inc. | 24628-20 | |
| Bio-Profile Flex Analyzer | Nova BioMedical |
References
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).
- Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).
- Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).
- Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
- Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).
- Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
- Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).
- Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303-2303 (2002).
