Summary
Cellene spiller en instrumental og økende rolle i forskning, og oppdagelsen og utviklingen av nye behandlingsformer. Med denne økende behov for større antall celler trenger vi mer effektive måter for dyrking og høsting vedlegg avhengige celler. En flere lag kolbe med de riktige funksjonene kan tjene dette formålet.
Abstract
Et økende antall celle-baserte applikasjoner krever et stort antall celler. Bruk av ett lag T-flakonger, som er tilstrekkelig under småskala ekspansjon, kan bli tungvint, arbeidskrevende og tidkrevende når et stort antall celler er nødvendig. For å møte dette behovet, til ytelsen til en ny multi-lagdelt cellekultur fartøy lette enkelt skalere opp av celler fra enkelt lag T-flakonger vil bli diskutert. Den kolber testet er tilgjengelig i 3 - og 5-lags format og aktivere kultur og fullstendig gjenoppretting av tre og fem ganger så mange celler, sammenlignet med T-175 kolber. Et viktig trekk ved BD Multi-Flask er en blanding / likevekt port som tillater rask i-fartøy blande samt uniform distribusjon av celler og reagenser innen og mellom lagene på hvert fartøy og konsekvent produsere celler som kan dyrkes i et miljø som er kongruente til T-175 kolber.
Utformingen av disse Multi-Flasks tillater også for convenient pipette tilgang for å legge til reagenser og celler direkte inn i flaskene samt effektiv utvinning av verdifulle celler og reagenser og reduserer risikoen for forurensning som skyldes helle. For applikasjoner der helle er foretrukket over pipettering, tillater design for minimal residual væske oppbevaring slik som å redusere svinn av verdifulle celler og reagenser.
Protocol
1. Protokoll å bruke Multi-Flasks for cellekultur
- Utarbeidelse av fartøy og legge cellesuspensjon
- Forbered cellevekst medium etter behov.
- Line up Multi-Flask vertikalt på sin side med hetten vender opp på overflaten (sterile laminær flow hette).
- Disse flaskene er tilgjengelig i 3 og 5-lags formater og bruke en lignende arbeid-flow mønster som en T-175 kolbe.
- Løsne og fjerne caps. Legg nødvendige mengden av forvarmet medium inn i kolbe med en 50 eller 100 mL pipette eller ved å helle.
- Pipetter som er ≤ 10 ml kan nå bunnen av skipet da Multi-Flasks er plassert vertikalt med cap vendt oppover. Pipetter ≥ 10ml kan komme inn i skipet straks forbi logoen på Multi-Flask, og dermed sørger for et beleilig portal til å legge større mengder media til fartøyet.
- For å unngå bobler av medium, la væske stream til flow langs den indre veggen av Multi-Flask lokket (logo-side).
- Legg cellesuspensjon fra en konsentrert celle lager i vekst medium gjennom det øverste laget med en 10 mL pipette og lue kolber.
Tips:
- Transport Multi-Flasks på en vogn til inkubator området og utføre resten av trinnene.
- Cellen seeding tetthet vil variere avhengig av celletype, medium og kultur varighet trenger. Begynn med seeding tetthet og media volum som brukes i standard T-175 kolber og multipliser med 3 eller 5 avhengig av Multi-Flask formatet som brukes.
- Blanding av celler
- Mix posisjon: Hold Multi-Flask oppreist med logoen mot deg og vri mot klokken til en 45 ° vinkel med mix port mot deg.
- Holding i samme vinkel, forsiktig vipp Multi-Flask fra front til rygg (nakke bort fra deg) til væsken i det øverste laget avløp fullt downwards gjennom mix porten. Pivot på mix port-side.
- Likeledes forsiktig stein Multi-Flask fra rygg til front (hals mot deg) til medium avløp helt fra bunnen lag mot toppen gjennom mix porten. Gjenta trinn 1.2.2 og 1.2.3 enda en gang for å sikre riktig blanding.
- Ta med Multi-Flask tilbake til mix posisjon (Step 1.2.1) og fortsett til trinn 1.3
- Alternativt kan cellesuspensjon være forberedt eksternt fra Multi-Flask og cellesuspensjon kan legges til fartøyet ved hjelp av en pipette eller ved milde helle.
- Bland port tillater i-fartøy blanding av celler med media og eliminerer behovet for å gjøre store mengder cellesuspensjoner eksternt.
- Det gir også media utjevning på tvers av lagene av Multi-Flask
- Stabilisering av væske
- Etter blanding / legge cellesuspensjon, for å plassere Multi-Flask vertikalt på et flatt underlag utjevne væske volum EQUAlly i alle lagene.
- Partition væske inn i hvert lag
- Hold Multi-Flask med logoen mot deg og vri med klokken til en 45 ° vinkel å partisjonere væsken i hver av lagene.
Tips:
- For best resultat, er det viktig å bruke en flat arbeidsflate for Steps 01.03 til 01.04
- Hold Multi-Flask med logoen mot deg og vri med klokken til en 45 ° vinkel å partisjonere væsken i hver av lagene.
- Transport
- Når media inneholder cellesuspensjon er partisjonert, transport Multi-Flask på samme 45 ° vinkel (med klokken) som i trinn 1.4.1 med medier unna mix port inn i inkubatoren. Denne posisjonen er også egnet når du fjerner flakonger fra inkubator for visning på et mikroskop.
- Plassering Multi-Flask på inkubator hylle
- Holding Multi-Flask på 45 ° vinkel (med klokken, vekk fra mix-port), forsiktig rotere den ned horisontalt på inkubatoren overflaten (ved hjørnet bort fra mix porten som enpivot). Lay Multi-Flask med logoen vendt opp.
- Falcon Multi-Flask utformingen gjør fartøy å stables og holder dem på plass med et solid stabling ribbein.
- Holding Multi-Flask på 45 ° vinkel (med klokken, vekk fra mix-port), forsiktig rotere den ned horisontalt på inkubatoren overflaten (ved hjørnet bort fra mix porten som enpivot). Lay Multi-Flask med logoen vendt opp.
- Fordeling av celler og reagenser
- Etter å plassere Multi-Flask flatt på arbeidsflaten, forsiktig stein frem og tilbake og side til side for å distribuere cellene jevnt på kultur flater ta vare du ikke søler væske fra hvert lag. Stack kolber.
- Dette Flask er laget av optisk klart materiale og celler på det siste laget kan lett sees på et mikroskop.
- Etter å plassere Multi-Flask flatt på arbeidsflaten, forsiktig stein frem og tilbake og side til side for å distribuere cellene jevnt på kultur flater ta vare du ikke søler væske fra hvert lag. Stack kolber.
- Media utveksling
- Aspirer mens vippe Multi-Flask til venstre (mix port-side) med logoen mot deg.
- Deretter tilt, Multi-Flask til høyre, fortsetter å aspirer alle rester medier.
- Legg passende mengde medier og følg trinn 01.03 til 01.07
2.Høsting av celler fra Multi-Flasks
- For å distansere celler, line up Multi-Flasks vertikalt og bringe hver til Mix posisjon (trinn 1.2.1). Snu forsiktig kolber med nakken mot deg slik at media til å renne til det øverste laget av Multi-Flask.
- Sett inn en 5 eller 10 ml aspirere spissen gjennom halsen inntil du når væskenivået nær mix port. Aspirer utslitt medium.
- Legg dissosiasjon reagens / vaskebuffer og bringe til Mix posisjon som i trinn 1.2.1, deretter fortsette og følge trinn 01.03 til 01.07. Nøytraliser med vekst medium / nøytraliseringsmiddel og hell cellesuspensjon til et mottak tube eller invertere kolbe slik at cellene avløp til det øverste laget av fartøyet og samle celler ved hjelp av en 10 mL pipette.
Tips: For å øke utvinningen av celler eller reagenser, bringe Multi-Flask å blande posisjon (Step 1.2.1), snu med nakken mot operatøren å tillate fullstendig tømming av media fra al l lag til det øverste laget. Deretter tilt Multi-Flask klokken til 45 ° vinkel (vekk fra mix port), mens Multi-Flask forblir invertert. Bruk en pipette (1-10 ml) å samle eventuelle gjenværende reagenser.
3. Anbefalt jobber volum i Falcon Multi-Flasks
Vekstmedier
3-lag: 75-150 ml per Multi-Flask
5-lag: 125-250 ml per Multi-Flask
Dissosiasjon agenten
3-lag: ≥ 15 ml per Multi-Flask
5-lag: ≥ 25 ml per Multi-Flask
Tips: Begynn med middels volum brukes i standard T-175 kolber og multipliser med 3 eller 5 ganger avhengig av Multi-Flask format evaluert slik at ml per enhet areal forblir den samme.
Fire. Representant Resultater:
1. Utforming av Falcon Multi-Flask
files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
. Figur 1: Multi-Flask Cell Culture fartøyene er tilgjengelig i en 3 - og 5-lags stables format for oppskalering av celler som gir 525 og 875 cm 2 vekst areal, henholdsvis. Pipette tilgang forenkler tillegg og fjerning av celler og reagenser inn-og ut av fartøyet. Tilstedeværelse av mix-port muliggjør for rask i-fartøy blanding og utjevning av media på tvers av alle lag av Multi-Flask.
. 2 Cell Yield bruker Multi-Flask:
Disse fartøyene er tilgjengelig i 3-lags og 5-lags formater som tilsvarer 3 og 5 ganger arealet av T-175 kolber. Følgelig ≥ 3 og 5 ganger (130 ± 6,8 x 10 6 og 218 ± 23,6 x 10 6 celler, henholdsvis) antall BHK-21 (baby hamster nyre) cellene ble dyrket og fikset Multi-Flask forhold til T-175 kolber (43,2 ± 3,5 x 10 6 celler; Fig.2A). Cell avkastning per unit arealet var tilsvarende i 3 - og 5-lags Multi-Flasks og T-175 flasker for BHK-21, LnCAP (human prostata adenokarsinom cellelinje), Hep-G2 (human hepatocarcinoma cellelinje), EcoPack 2-293 (human nyre celle linje) kultivert for en periode på 48-96h (Fig.2B) i vekstmedier (35 ml per lag) som anbefalt av celle leverandør (ATCC, Sigma og / eller Clontech). Celler ble oppregnet på en automatisert Vi-CELL counter (1).
Figur 2a: Tre og fem ganger så mange BHK-21 cellene ble dyrket og fikset 3 - og 5-lags Multi-Flasks forhold til T-175 kolber. Forventet avkastning ble fastsatt ved hjelp bety celle yield fra kontroll T-175 flakonger multiplisert med tre og fem ganger for 3 - og 5-lags Multi-Flasks henholdsvis (n = 4 flakonger / format).
Figur 2B: Cell yield per cm 2 var tilsvarende i 3 - og 5-lags Multi-Flasks og T-175 flasker for BHK-21, LnCAP, HepG2 og EcoPack2-293 celler. Hver søyle representerer betyr 4 til 6 kolber. BHK-21 celler (11000 cells/cm2) ble dyrket i 72 timer, LnCAP celler (20.000 cells/cm2) og EcoPack2-293 celler (~ 35 000 cells/cm2) ble dyrket i 96 timer og HepG2 celler (25.000 celler / cm 2 ) ble kultivert i 48 timer før innhøsting.
3. Media fordeling blant lag av Multi-Flask
Cellekultur medium (DMEM; Invitrogen) ble lagt til 5-lags Multi-Flasks (250 mL/5-layer fartøy) og partisjonert i lag i henhold til protokoll beskrevet ovenfor. Mediedistribusjon ble målt ved å bore hull i hvert lag og media pumpet ut fra enkelte lag. Vekt av væske utvunnet fra hvert lag ble funnet å være relativt ensartet fra lag til lag som vist i figur 3. De er som følger: 510.8 ± 0.73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (GM).
Figur 3. Uniform mediedistribusjon i hver av de fem lagene i en 5-lags Multi-Flask. Cellekultur medium ble lagt til Multi-Flasks (250 ml/5-layer fartøy), likevekt og partisjonert til individuelle lag. Mediene ble pumpet ut gjennom hull boret i individuelle lag og væske vekt ble spilt inn fra hvert lag (n = 6 kolber).
Fire. Cell fordeling mellom lag av Multi-Flask
Celler kan legges til og blandes i Multi-Flask. Vi simulerte distribusjon av celler mellom lag av Multi-Flask bruker perler (10μm; PolySciences Inc.) lik i størrelse til cellene. Bead suspensjonen ble lagt inn i Multi-Flask fartøy som ligger ved en 10 mL pipette gjennom det øverste laget og blandet med media i fartøyet som synkenderibed i protokollen ovenfor. Bead fordeling ble målt ved å bore hull i hvert lag og væske som inneholder perle suspensjon ble pumpet ut fra enkelte lag. Bead konsentrasjon utvinnes fra hvert lag ble lest på en Coulter Counter og registreres. Nedenfor er tilsvarende inter-lag perle distribusjoner i 3-lags Multi-Flasks (Fig.4A). I mix-porten gjør det mulig homogen distribusjon av celler og reagenser mellom Multi-Flask lag.
Figur 4A: Bead fordeling i hver av de tre lagene i en 3-lags Multi-Flask. En suspensjon av perler (3.6 x10 6 / ml) ble lagt til medium dispensert inn i Multi-Flasks (bead suspensjon: medievolumet er 1:10, vol: vol) og blandet, etterfulgt av likevekt og partisjon trinn ved hjelp av protokollen beskrevet. Bead konsentrasjon utvinnes fra hvert lag (medium pumpes gjennom hull boret på hvert lag) ble lest på en Coulter Counter og registrert. Nedenfor er tilsvarende inter-lag perle distribusjoner i 3 - lags Multi-Flasks (n = 5 flasker)
Nedenfor er representative bilder av Ecopack 2-293 flekker mønstre av celler dyrket til> 80% samløpet på 3-lags Multi-Flasks i supplert vekstmedier. Cell monolayers var faste og farget med krystallfiolett og Multi-Flask lagene ble deretter kuttet og bilder skannet (2). Merk celle mønster var homogen i alle lag av Multi-Flask (Fig.4B). Lignende resultater ble oppnådd med flere celletyper evaluert (data ikke vist).
Figur 4B: Denne figuren illustrerer homogen cellevekst mellom lag av Multi-Flasks. Ecopack-2-293 celler vokst til> 80% samløpet i 3-lags Multi-Flasks og T-175 var faste og farget med krystallfiolett. Multi-Flask fartøy ble kuttet og hver farget lag ble skannet.
5 Lufttilførsel i Multi-Flask.
Analyse av brukt medier med BioProfile FLEX analysator (3,4) (Nova Biomedical) fra EcoPack2-293 celler dyrket i 96 timer viste ingen forskjell i luften metning av celler dyrket i 5-lags Multi-Flasks vs T-175 flakonger (81.03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% ambient O 2).
Figur 5: Air metning (% ambient O 2) av brukt media var lik i pre-mixed media fra 5-lags Multi-Flasks vs T-175 kolber. EcoPack2-293 celler ble sådd ved en tetthet på 35.000 celler / cm 2 og kultivert i 96 timer før medieanalyse (n = 3 kolber).
Discussion
Den nåværende studien viser økningen i produktiviteten at Multi-Flask design tilbyr forskere. Mens det er viktig å følge fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor for optimal ytelse ved bruk av Multi-Flasks, er det få kritiske trinn i denne protokollen som anses mest essensielle. Disse omfatter (i) blanding av celler og reagenser bruker mix havn innenfor fartøy (ii) transport av Multi-Flask i 45 ° vinkel klokken etter partisjonering væske i hver av lagene (iii) legger Multi-Flask flat innlegg partisjonering inn inkubatoren.
Riktig bruk av Multi-Flask fører til produksjon av en homogen celle befolkning innenfor hvert fartøy som er dyrket i et miljø som er kongruent til T-175 flakonger (5). Disse fartøyene gir 3 og 5 ganger flere celler i en lignende fotavtrykk som T-175 kolbe. De 3 og 5-lags fartøy gir 525 og 875cm 2 av vekstområde, henholdsvis og tilbyr både plass og arbeidskraft eravings til brukerne. Tissue Culture Overflatebehandling er sammenlignbar standard flakonger dermed gjør skalere opp uten behov for re-optimalisering av eksisterende kultur vilkår eller kompromittere kvalitet, homogenitet eller ytelse av celler (6, 7). Dette gir også for sammenlignbarhet med tidligere innsamlede data. Disse fartøyene kan også belagt med reagenser som kollagen, fibronectin, poly-D-lysin for å gi en spesialisert undergrunnen for feste, vekst og differensiering av visse celletyper som hepatocytter 8, kertainocytes 9, stamceller dyrket i serum-free media formuleringer. Belegg løsninger kan fjernes med minimal residual væske oppbevaring slik som å redusere svinn av verdifulle reagenser samt effektiv fjerning av belegg løsning før dyrking celler. De anbefalte optimale medievolumet til kultur celler i Multi-kolber spekter 0.142 til 0.287 ml / cm 2 som oversette til 25-50 ml per lag. I motsetning til en annen mangefargede kolbe, thans produktet tilbyr en mix-port i fartøyet som tillater raske i-fartøy blande samt uniform distribusjon av celler og reagenser innen og mellom lagene på hvert fartøy. Diverse cellelinjer, primære kulturer og stamceller har blitt skalert opp effektivt ved hjelp av Multi-Flasks. Disse fartøyene er spesielt fordelaktig i applikasjoner som krever et stort antall celler som i høy gjennomstrømning-screening, vaksineproduksjon, viral vektor transfections og celleterapi.
Besparelser i tid, rom, arbeid og redusert avfallsproduksjon er sentrale gevinstene av Multi-Flask versus konvensjonelle kulturer i single-lags fartøyer. Vi kan kultur omtrent tre ganger så mange celler høstet fra 5, T-175 flakonger på samme plass med 3, 5-lags Multi-Flasks. Denne fordelen i plassbesparende er ikke begrenset bare til T-175, men kan også utvides til andre fartøy: en standard roller flaske apparat som passer inn i felles laboratorium inkubatorer hus ~ 4 roller flasker (2200 ml) som hver gir 850cm 2 overflateareal. I samme område, kan ~ 20, 5-lags Multi-Flasks bli plassert og dermed gi fem ganger veksten overflaten til kultur celler. Videre, med en økning i "Go-Green" bevissthet, er alternativer for å redusere avfall svært ønskelig. I så henseende er det en 38% (5, T-175 flakonger veie ~ 640g mens én, 5-lags Multi-Flask veier ~ 400g) reduksjon i avfallsproduksjon bruker Multi-Flasks forhold til T-175 kolber og disse fordelene føre til reduksjon i avfall lagring og deponering kostnader og resultere i økonomiske besparelser for brukeren.
Disclosures
Alle forfatterne er ansatte i Becton Dickinson, biovitenskap Segment, Discovery Labware Unit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 | BD Biosciences | 353143 | |
| 5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100ml pipette | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml aspirating pipette | BD Biosciences | 357501 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 flask Tissue Culture-treated | BD Biosciences | 353028 | |
| Gram Crystal Violet | BD Biosciences | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Fetal Bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma-Aldrich | T8159 | |
| BHK-21 cells | Sigma-Aldrich | 85011433 | |
| Hep-G2, LnCAP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech Laboratories | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polystyrene Bead | Polysciences, Inc. | 24628-20 | |
| Bio-Profile Flex Analyzer | Nova BioMedical |
References
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).
- Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).
- Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).
- Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
- Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).
- Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
- Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).
- Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303-2303 (2002).
