Transretinal ERG Inspelningar från mus Retina: Stång och Photoresponses Cone

Summary

Vi beskriver en relativt enkel metod för transretinal elektroretinogram (ERG) inspelningar för att erhålla stav-och-kon photoresponses från intakt mus näthinnan. Denna strategi tar fördel av blocket av synaptisk överföring från fotoreceptorer för att isolera sina ljus svar och spela dem med fältelektroder placerade över isolerade flat-monterade näthinnan.

Abstract

Det finns två distinkta klasser av bildalstrande fotoreceptorer i ryggradsdjuret näthinnan: stavar och tappar. Stänger kan upptäcka enstaka fotoner av ljus medan tappar arbeta kontinuerligt under föränderliga ljusa ljusförhållanden. Absorption av ljus genom stav-och kon-specifika visuella pigment i de yttre segmenten av fotoreceptorer utlöser en ljusöverledningen kaskad som slutligen leder till stängning av cykliska nukleotid-gated kanaler på plasmamembranet och cell hyperpolarisering. Detta ljus-inducerad förändring i membranet nuvarande och potentiella kan registreras som ett fotoresponsen, antingen genom klassiska sugelektrod inspelningsteknik ^1,2 eller transretinal elektroretinogram inspelningar (ERG) från isolerade näthinnor med farmakologiskt blockerade postsynaptiska svar komponenter ^3-5. Den senare metoden kan läkemedelsinnehållande tillgängliga långvariga inspelningar från mus fotoreceptorer och är särskilt användbar för att erhålla stabila photoresponses frOM de knappa och sköra mus kottar. I fallet med kottar, kan sådana experiment utföras både i mörk-anpassade förhållanden och efter intensiva belysning som bleker i huvudsak alla synliga pigment, för att övervaka den konen ljuskänslighet återhämtning under mörka anpassning ^6,7. I den här filmen kommer vi att visa hur man utför stav-och M / L-kon-drivna transretinal inspelningar från mörkt anpassad mus näthinnan. Stången inspelningar kommer att utföras med användning av näthinnan av vildtyp (C57BL / 6) möss. För enkelhets skull kommer kon inspelningar erhållas från genetiskt modifierade stav transducin α-subenheten knockout (Tai ^{- / -)} möss som saknar stången signalering ^8.

Protocol

1. Framställning av elektroder

1. Förbered glas elektroder. Väg 120 mg agar och blanda den i 10 ml destillerat vatten (slutlig agarkoncentration 1,2%). Smält agarlösning i varmt vattenbad. Fylla glaskapillärer (vi använder instrument Word Presision TW100-4 kapillärer med följande dimensioner: längd = 100 mm, YD / ID = 1/0.75 mm och inre volym = 44 | il) med agarlösning användning plastspruta. Stelna agar vid rumstemperatur under 10 minuter. Sålunda upp till ~ 200 kapillärer kan fyllas (resten av agar blandningen kan förvaras vid -4 ° C och återanvändas flera gånger).
2. Skär kapillärerna i halvor med en diamant kniv.
3. Blötlägg de resulterande glas elektroderna i musen elektrod lösning under minst 24 timmar vid 4 ° C. Lagra elektroderna vid 4 ° C och använda dem under en period av 3-4 månader.

2. Ställa in experimentet

1. Dark-anpassa en mus över natten. Använd vildtyp (till exempel C57BL / 6) möss för stav-drivna transretinal inspelningar och T a ^{- / -} möss som saknar stång signalering ⁸ för kon transretinal inspelningar.
2. Framställ 1 lösning L perfusion, 100 ml elektrod lösning och 20 ml inkubation lösning (se nedan) och filtrera perfusionslösningen tråget ett Millipore 0,45 | im eller 0,22 | im filter (valfritt).
3. Kalibrera ljuskälla (505 nm LED-eller halogenlampa optiska stimulatorn) med användning av en fotometer placerad vid planet för näthinnan. I fallet med LED som ljuskälla, använda en optisk diffusor för att uppnå ljus likformighet.
4. Förbered perfusionskammaren för experiment (kammare konstruktioner kan variera). Vår kammare är tillverkad av 3 mm plexiglas med en botten gjord av locket på en liten plast petriskål, och har en aktiv perfusion volym ~ 400 xl (L = 25 mm, B = 8 mm, H ≈ 2 mm). Fylla den undre elektroden utrymmet hos kammaren med elektroden lösning innehållande 2 mM L-glutamat och 10 mM _BaCl2. Användning plaströr och en glaskapillär, göra en anslutning mellan lösningen i nedre elektroden utrymmet (tillverkad av plast slangkopplingen fäst vid kammarens botten) och elektrodhållaren. Kontrollera att det inte finns några bubblor i elektroden och den anslutande slangar, eller elektrodhållaren (rensa lösningen med plastspruta om det behövs).
5. Montera registreringskammare på mikroskopets (valfritt: mikroskopet kan monteras på en anti-vibrations tabellen och skyddad inuti en Faraday-bur för att minimera mekaniska och elektromagnetiska störningar). Ansluta den undre elektroden hållaren till den positiva polen huvudsteg av differentialförstärkaren (t.ex. Warner Instruments DP-311 förstärkare). Center och anpassa kammaren undre elektroden öppning med stimulus ljuspunkten. Anslut perfusion linjen till inspelningen kammaren och slå på perfusionen på.
6. Bubbla perfusionslösningen med _95% O2 / _5% CO2 under inkubera den i 40 ° C watER bad. CO ₂ justerar lösningens pH till 7,2. Lösningen strömmar från flaskan till registreringshuvudet kammaren med hjälp av tyngdkraften passerar genom ett keramiskt motstånd återuppvärmning till 36-37 ° C. För att minska värmeförlusterna bör värmaren placeras så nära inspelningen kammaren som möjligt, helst på scenen av mikroskopet.
7. Med en flödesregulator justera flödeshastigheten till ca 1 ml / min.
8. Ansluta den övre elektroden till den andra (negativa) pol av huvudsteg med användning av en andra elektrod hållare. Binda termoelementsond till den övre elektroden med användning av en O-ring. Se till att elektrodelementen och termoelement spetsar är nära varandra, så att temperaturen avläsning så nära mitten av näthinnan som möjligt. Doppa den spets hos den övre elektrodplattan i perfusionslösningen och placera den i mitten av kammaren. Låt 10-15 min för baslinje stabilisering.
9. Justera DC-spänning för värmaren, så att temperaturen för lösningen är 36 -37 ° C.

3. Isolering musen Retina

1. Vid dåliga rött ljus, euthanize den mörka anpassad mus med CO ₂ och cervikal dislokation. Valfritt: en hänvisning märke på varje mus ögongloben med cauterizing den mest dorsala punkten i sklera med en diatermi penna eller uppvärmda dissekera stift. Alla efterföljande procedurer utförs under infrarött ljus med infraröda bilden omvandlare passar till ett dissektionsmikroskop.
2. Dissekera ut ögonen med böjd sax genom ett lätt tryck och stretching huden på sidorna av varje öga. Hemisect båda ögonglober under infraröd belysning med mikrosax eller ett rakblad.
3. Ta bort hornhinnan och linsen. Bort så mycket av den glasartade som möjligt.
4. Peel första näthinnan från pigmentepitelet skiktet och, om nödvändigt, grundligt rengöra med pincett för avlägsnande av återstående granulerna av pigmentepitelet. Vi typiskt med användning av hela näthinnan för både staven och kon transretVSLUTANDE inspelningar. Men om du vill att specifikt spela in från den dorsala delen av mus näthinnan som har mer M / L-koner ^9, innan du skalar näthinnan bort ventrala delen av ögonmusslan med ett rakblad eller mikrosax med diatermi varumärke som en referens.
5. Placera den andra hemisnittad ögongloben i en liten Petri-skål med inkubering-lösning och inkubera preparatet i en ljustät låda mättad med rent syre tills användning. Normalt under dessa förhållanden den andra musen ögonmusslan kan lagras i flera timmar vid rumstemperatur och användas för inspelningar.
6. Användning av en glas eller plast-pipett överföra den isolerade näthinnan till en droppe av perfusionslösningen (ca 300 | il) på locket till en Petri-skål. Lägg 5-6 små droppar av elektroden lösning innehållande BaCl ₂ att i förväg inkubera näthinnan med BaCl _2. Placera en kvadratisk bit (ca 5x5 mm) på baksidan hörn infettad (vi använder Dow Corning 111 ventilsmörjmedel och tätningsmedel) Millipore filterpapper (0,45 | im HArg typ) med förtillverkad hål i sitt centrum (2-2,5 mm i diameter) med samma lösning droppe. Använd pincett position näthinnan ovanpå filterpapper (fotoreceptor uppåt) och tryck på sina kanter på periferin till platt-montera den. Näthinnan skulle vara centrerat över öppningen i filterpappret.
7. Använd pincett överföra filterpapper med näthinnan till perfusionskammaren och placera det ovanför stimulans spot-linje lägre elektrod utrymme. Något tryck de infettade kanter filterpapper för att binda det med kammaren.
8. Placera den övre elektroden över retina centrum (svagt tryck på fotoreceptorskiktet). Centrering av övre elektroden på näthinnan ökar signalamplituden (upp till ~ 20-40% jämfört med att placera den närmare näthinnan kant). Även om en sådan elektrod plats snedvrider något effektivt intensiteten Ijusstimulus når en liten sektor i näthinnan (~ 12-15% av dess totala area), är det fortfarande det bästa sättet att placera eltrode. Beredningen är nu klar för transretinal inspelningar.

4. Transretinal Inspelningar

1. Beroende på musen line, registrera stav eller M / L-kon-drivna provsvar flash från svag till ljus intensitet kalibrerad 505 nm ljus tillhandahållas från LED-ljuskällan eller optisk stimulator. I fallet med vår LED-ljuskälla är blixten intensitet som kontrolleras av en kombination av datoriserad styrning av LED inspänning, omkopplingsbara motstånd, och en uppsättning av neutrala densitet filter (vi använder E-Färg # 211 0,9-filter ND film från Rosco Laboratories ) placerad mellan LED och näthinnan. Varaktigheten av LED-test blixt (20 ms) styrs av en dator. Om du använder en halogenlampa optisk stimulator, kan testet flash intensitet och våglängd styras av en uppsättning neutrala densitet filter och smala band filter störningar, respektive. Test flash längd kan styras av en dator-drivna luckor.
2. Tillval: för att upprätthålla en effektivundertryckande av gliaceller komponent fotoresponsen med BaCl ₂ hela dagen, ändra den nedre elektroden lösningen då (t.ex. före provning av varje näthinnan) genom att rensa den med en plastspruta fylld med färsk lösning.

5. Representativa resultat

Lösningar

1. Mus näthinnan perfusionslösningen: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 _mM MgCl2, 1,2 _mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCOs _3, 3 mM Na-succinat, 0,5 mM Na-glutamat, 0,02 mM EDTA, och 10 mM glukos. Dessutom, lösningen kompletterades med 2 mM L-glutamat och 10 | iM DL-AP-4 för att blockera högre ordningens komponenter i fotoresponsen ^10,11, och med 0,1% MEM-vitaminer och MEM aminosyror lösningar (Sigma) för att förbättra näthinnan livsduglighet.
2. Mus elektroden lösning: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 _mM MgCl2, 1,2 _mM CaCl2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). Lösningen i den nedre elementctrode utrymme innehåller även 2 mM L-glutamat för att blockera den synaptiska transmissionen ¹⁰ och, dessutom, till 10 mM _BaCl2 undertrycka glia komponenten av fotoresponsen ^{3,12 ecu.}
3. Retina inkubering: lös 272 mg L-15-medium (Sigma) och 20 mg BSA i 20 ml avjoniserat vatten. Slutlig L-15 och BSA koncentrationer är 13,6 mg / ml och 1 mg / ml, respektive. Justera pH till 7,4 med 1 M HCl.

Figur 1. Schematiskt diagram som visar isolering av mus näthinnan för transretinal ERG inspelningar.

Figur 2. Fotografi av perfusionskammaren och elektroderna inspelning med sina innehavare. Röda pilar indikerar riktningen för perfusion flöde.

Figur 3. Skiss av den experimentella inställning för transretinal ERG inspelningar. Röda pilar indikerar riktningen för perfusion flöde.

. Figur 4 Representativa resultat: in familj av mus stav drivna transretinal svar. Photoresponses var låg-pass filtreras vid 30 Hz (8-polig Bessel), digitaliseras vid 1 kHz och lagras på en dator för vidare analys. Visade spår representerar medelvärden av 5-6 svar på svagt ljus intensiteter och 2-3 svar på intensitet mättande ljus.

Figur 5 Representativa resultat:. Inspelade familj av mus kon-drivna transretinal svar. Photoresponses var låg-pass filtreras vid 30 Hz (8-polig Bessel), digitaliseras vid 1 kHz och lagras på en dator för vidare analys. Visas spår är averages 5-10 svaren på dunkla ljusintensiteter och 3-5 svar på intensitet mättande ljus.

Discussion

Metoden för stav-och kon-drivna transretinal ERG inspelningar som beskrivs ovan blir ett kraftfullt verktyg för att undersöka funktionen av mus fotoreceptorer i både vildtyp och genetiskt modifierade djur. Förutom den enkla karakterisering av grundläggande fotoresponsen egenskaper ger denna enkla teknik stort gensvar stabilitet under långvariga experiment som utförts på ett nära-till-intakta näthinnan preparat. Både mörka anpassad stav maximal respons amplitud och ljuskänslighet i vildtypmöss är stabila inom minst 1 timme från början av inspelningar, och den mörka-anpassad kon maximal amplitud och ljuskänslighet normalt inte minska mer än 10% efter 30-40 min inspelningar. Andra fördelar med denna teknik är dess mottaglighet för enkla farmakologiska manipulationer som är onåbara i klassiska encelliga sug inspelningar från mus fotoreceptorer, och frånvaron av anestesi, krävs för att utföra levande djur ERG rekordbyggnader. Använda näthinnor från Tai ^{- / -} mus line med elimineras stången signalering ⁸ för kon transretinal inspelningar väsentligt underlättar både experimentella metoder och tolkning av resultaten. Detta är särskilt viktigt i experiment som syftar till att övervaka musen kon visuell pigment återhämtning efter exponering för starkt ljus och / eller studera kon funktion i närvaro av fast bakgrundsbelysning. Således är nya spännande perspektiv öppnar nu för att undersöka de fysiologiska egenskaperna hos mus stavar och tappar, inklusive musmodeller för stav-och kon-relaterade visuella störningar.