Summary
ونحن تصف طريقة بسيطة نسبيا من transretinal التسجيلات (ERG) مخطط كهربية الشبكية للحصول على قضيب والمخروط photoresponses من شبكية العين الماوس سليمة. هذا النهج يستفيد من كتلة من انتقال متشابك من المستقبلات الضوئية لعزل ردودهم الخفيفة وتسجيلها باستخدام أقطاب الحقل وضعت في جميع أنحاء شبكية العين المسطحة التي شنت معزولة.
Abstract
هناك فئتين متميزتين من الصور المكونة للخلايا مستقبلة للضوء في شبكية الفقاريات: قضبان ومخاريط. قضبان هي قادرة على الكشف عن الفوتونات واحد للضوء في حين المخاريط بشكل مستمر تحت الظروف المتغيرة بسرعة الضوء الساطع. امتصاص الضوء بواسطة قضيب وأصباغ مخروط محددة البصرية في قطاعات الخارجي من المستقبلات الضوئية يتسبب في سلسلة phototransduction أن يؤدي في النهاية إلى إغلاق قنوات النوكليوتيدات بوابات دوري على غشاء البلازما وفرط الاستقطاب الخلية. ويمكن تسجيل هذا التغيير الناجم عن ضوء في غشاء الحاليين والمحتملين بمثابة photoresponse، إما عن طريق الشفط الكهربائي الكلاسيكية 1،2 تقنيات التسجيل أو عن طريق التسجيلات مخطط كهربية الشبكية transretinal (ERG) من شبكية العين معزولة مع سدت عقاقيري مكونات استجابة بعد المشبكي 3-5. الأسلوب الأخير يسمح للأدوية في متناول طويلة الأمد تسجيلات من المستقبلات الضوئية الماوس ومفيد بشكل خاص للحصول على photoresponses مستقر الابأم المخاريط الماوس نادرة وهشة. في حالة المخاريط، يمكن تنفيذ مثل هذه التجارب على حد سواء في الظروف المظلمة مكيفة والإضاءة المكثفة التالية التي التبييض أساسا جميع الصباغ البصرية، لرصد عملية الانتعاش حساسية مخروط خلال التكيف مع الظلام 6،7. في هذا الفيديو، وسوف نعرض كيفية تنفيذ قضيب وM / L-مخروط يحركها التسجيلات transretinal من الظلام تكييفها شبكية العين الماوس. وسيتم استخدام التسجيلات قضيب من شبكية العين من النوع البري (C57BL / 6) الفئران. عن البساطة، وسوف يتم الحصول على تسجيلات مخروط من transducin قضيب المعدلة وراثيا α وحدة فرعية خروج المغلوب (Tα - / -) الفئران التي تفتقر إلى قضيب يشير الى 8.
Protocol
1. صنع أقطاب
- إعداد أقطاب الزجاج. وزنه 120 ملغ أجار ومزجها في الماء المقطر 10 مل (نهائي تركيز أجار 1.2٪). إذابة حل أجار في حمام الماء الساخن. شغل الزجاج الشعيرات الدموية (نستخدم أدوات Presision كلمة TW100-4 الشعيرات الدموية مع الأبعاد التالية: الطول = 100 مم، OD / ID = ملم 1/0.75، وحجم داخلي = 44 ميكرولتر) مع الحل أجار باستخدام المحاقن البلاستيكية. يصلب أجار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. وبالتالي، ما يصل إلى ~ يمكن ملء 200 الشعيرات الدموية (ويمكن تخزين ما تبقى من خليط أجار في -4 درجة مئوية، وإعادة استخدامها عدة مرات).
- قطع الشعيرات الدموية الى نصفين باستخدام سكين الماس.
- نقع الأقطاب زجاج مما أدى إلى حل القطب الماوس مدة لا تقل عن 24 ساعة في 4 درجة مئوية. تخزين الأقطاب في درجة مئوية (4) واستخدامها على مدى فترة من 3-4 أشهر.
2. إعداد تجربة
- داكنة التكيف مع الفأر بين عشية وضحاها. استخدام نوع البرية (على سبيل المثال، C57Bl / 6) الفئران لقضيب يحركها التسجيلات transretinal وα T - / - الفئران التي تفتقر إلى قضيب يشير الى 8 لتسجيلات مخروط transretinal.
- 1 إعداد حل نضح L، 100 مل حل الكهربائي، و 20 مل من محلول الحضانة (انظر أدناه)، وتصفية الحوض الصغير حل نضح 1 ميليبور 0.45 ميكرومتر أو 0.22 ميكرومتر مرشح (اختياري).
- معايرة مصدر الضوء (505 نانومتر الصمام أو الهالوجين مشجعا مصباح ضوئي) باستخدام مضواء وضعت في الطائرة من شبكية العين. في حالة من مصدر ضوء الصمام، واستخدام الناشر البصرية لتحقيق التوحيد ضوء.
- إعداد غرفة نضح لتجربة (غرفة المنشآت قد تختلف). يتكون لدينا من غرفة زجاجي 3 مم، مع القاع مصنوعة من غطاء طبق بتري بلاستيكية صغيرة، ويحتوي على حجم نضح نشط من ~ 400 ميكروليتر (L = 25 مم، W = 8 مم، H ≈ 2 ملم). شغل مساحة أقل الكهربائي للغرفة مع حل الكهربائي التي تحتوي على 2 مم L-الغلوتامات و 10 ملم بووتون 2. باستخدام انابيب البلاستيك والزجاج والشعرية، إجراء اتصال بين الحل في مساحة أقل قطب كهربائي (مصنوعة من توصيل الأنابيب البلاستيكية التي تعلق على أسفل غرفة) وحامل قطب كهربائي. تأكد من عدم وجود فقاعات في القطب، وأنابيب يربط، أو صاحب قطب كهربائي (تطهير حل باستخدام المحاقن البلاستيكية إذا لزم الأمر).
- تركيب غرفة تسجيل على مرحلة من مراحل المجهر (اختياري: يمكن تركيب المجهر على طاولة مضادة للاهتزاز ومحمية داخل قفص فاراداي للحد من الضوضاء الميكانيكية والكهرومغناطيسية). وصل صاحب أدنى القطب إلى القطب headstage إيجابي من مكبر للصوت التفاضلية (مثل الآلات وارنر DP-311 مكبر للصوت). مركز ومحاذاة القطب الغرفة السفلى فتح مع التحفيز بقعة ضوء. ربط خط نضح إلى غرفة تسجيل وتحويل نضح في.
- فقاعة الحل نضح مع 95٪ O 2 / ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 في حين أن تفرخ في 40 درجة مئوية واتإيه حمام. CO 2 يضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7.2. الحل ينبع من زجاجة إلى دائرة تسجيل عن طريق الجاذبية يمر المقاوم السيراميك إعادة تسخين الى 36-37 درجة مئوية. للحد من فقدان الحرارة، يجب أن يكون موجودا في سخان أقرب إلى غرفة تسجيل وقت ممكن، من الناحية المثالية على مسرح المجهر.
- مع منظم تدفق ضبط معدل تدفق إلى حوالي 1 مل / دقيقة.
- ربط القطب العلوي إلى القطب (السلبية) الثاني من headstage باستخدام حامل القطب الثاني. ربط تحقيق الحرارية إلى القطب العلوي باستخدام حلقة O-. تأكد من أن نصائح القطب والحرارية هي قريبة من بعضها البعض بحيث يتم أخذ القراءة في درجة الحرارة وعلى مقربة من مركز شبكية العين ممكن. تزج غيض من القطب العلوي في حل نضح ووضعها في وسط الغرفة. تسمح 10-15 دقيقة لتحقيق الاستقرار خط الأساس.
- ضبط العاصمة الجهد لسخان حتى درجة حرارة الحل هو 36 -37 درجة مئوية.
3. عزل الشبكية ماوس
- تحت ضوء أحمر خافت، الموت ببطء الماوس داكنة تكيف مع CO 2 والتفكك عنق الرحم. اختياري: جعل علامة مرجعية على كل مقلة العين الماوس عن طريق الكي النقطة الأكثر الظهري للالصلبة مع القلم أو مكواة ساخنة دبوس تشريح. يتم تنفيذ جميع الإجراءات اللاحقة تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء باستخدام محولات صورة بالأشعة تحت الحمراء لائقا لمجهر تشريح.
- تشريح خارج العينين مع مقص منحني من خلال تطبيق ضغط لطيف على الجلد وتمتد على جانبي كل عين. Hemisect كلا مقل العيون تحت إضاءة الأشعة تحت الحمراء باستخدام microscissors أو شفرة حلاقة.
- إزالة القرنية والعدسة. إزالة أكبر قدر من زجاجي ممكن.
- قشر الشبكية الأولى من الصباغ طبقة الظهارة، وإذا لزم الأمر، تماما تنظيفه مع ملقط لإزالة حبيبات المتبقية من الظهارة الصبغية نحن نستخدم عادة شبكية العين كلها على حد سواء قضيب وtransret مخروطإينال التسجيلات. ومع ذلك، إذا كنت ترغب في تسجيل على وجه التحديد من الجزء الظهري من شبكية العين الفأر الذي لديه أكثر M / L-المخاريط 9، قبل تقشير الشبكية إزالة جزء من بطني فنجان العين مع شفرة حلاقة أو microscissors باستخدام علامة الكي كمرجع.
- وضع مقلة العين 2 hemisected في طبق بيتري صغير مع حل حضانة واحتضان إعداد في مربع ضوء محكم مشبع بالأكسجين النقي حتى الاستخدام. عادة، لا يمكن في ظل هذه الظروف يمكن تخزين فنجان العين الماوس الثاني لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة وتستخدم للتسجيلات.
- استخدام الزجاج أو ماصة بلاستيكية نقل الشبكية معزولة إلى قطرة من محلول الارواء (حوالي 300 ميكرولتر) على غطاء من طبق بيتري. أضف 5-6 قطرات صغيرة من محلول يحتوي على قطب كهربائي بووتون 2 إلى شبكية العين في مرحلة ما قبل احتضان مع بووتون 2. ضع قطعة مربعة (5x5 ملم حوالي العام) من الجانب الخلفي الزاوية مدهون (نستخدم داو كورنينج مواد التشحيم 111 و صمام مانع التسرب) ورقة مرشح ميليبور (0.45 ميكرون HARG نوع) مع مسبقة الصنع ثقب في وسطها (2-2،5 ملم في القطر) إلى انخفاض حل نفسه. باستخدام ملقط موقف الشبكية على رأس ورقة الترشيح (مبصرة جانب متابعة) واضغط على أطرافها على هامش لمسطح تركيبها. يجب أن تتركز في شبكية العين خلال فتحة في ورقة الترشيح.
- باستخدام ملقط نقل ورقة الترشيح مع شبكية العين إلى الدائرة نضح ووضعه فوق بقعة التحفيز الانحياز مساحة أقل الكهربائي. اضغط قليلا حواف مدهون من ورقة الترشيح إلى أن السندات مع الغرفة.
- وضع قطب كهربائي العليا على مركز شبكية العين (لمس قليلا طبقة مستقبلة للضوء). تركز القطب العلوي على شبكية العين يزيد من سعة إشارة (تصل إلى 20-40٪ ~ بالمقارنة مع وضعه أقرب إلى حافة شبكية العين). على الرغم من أن مثل موقع القطب يشوه قليلا الحافز ضوء فعالة كثافة التوصل الى قطاع صغير من شبكية العين (~ 12-15٪ من مساحتها الكلية)، فإنه لا يزال الطريق الأمثل لوضع ELECtrode. إعداد جاهز الآن للتسجيلات transretinal.
4. Transretinal تسجيلات
- اعتمادا على خط الماوس الخاص بك، سجل قضيب أو M / L-مخروط يحركها ردود فلاش اختبار من خافت إلى كثافة مشرق من معايرة ضوء نانومتر 505 قدم من مصدر ضوء LED أو مشجعا بصري. في حالة لدينا مصدر ضوء الصمام، ويتم التحكم في شدة الفلاش من قبل مجموعة من الرقابة الآلية لمساهمة الجهد الصمام، والمقاومات للتحويل، ومجموعة من مرشحات الكثافة محايدة (E-نستخدم اللون # 211 0.9 مرشحات فيلم ND من مختبرات روسكو ) وضعت بين الصمام وشبكية العين و. يتم التحكم في مدة اختبار فلاش LED (20 مللي) بواسطة جهاز كمبيوتر. إذا باستخدام محفز لمبة الهالوجين بصري، يمكن التحكم اختبار كثافة الفلاش والطول الموجي من قبل مجموعة من المرشحات كثافة محايدة وضيق المرشحات تدخل الفرقة، على التوالي. يمكن التحكم اختبار فلاش مدة بواسطة الكمبيوتر يحركها مصاريع.
- اختياري: للحفاظ على كفاءةقمع مكون من الدبقية photoresponse مع بووتون 2 على مدار اليوم، وتغيير الحل الكهربائي في بعض الأحيان أقل (على سبيل المثال قبل اختبار كل شبكية العين) عن طريق تطهير باستخدام حقنة بلاستيكية مملوءة حل جديد.
5. ممثل النتائج
الحلول
- حل الماوس نضح شبكية العين: 112.5 ملي كلوريد الصوديوم، 3.6 ملم بوكل، 2.4 مم MgCl 2، 1.2 مم CaCl 2، 10 HEPES ملم (7.2 درجة الحموضة)، و 20 ملي NaHCO 3، 3 مم نا سكسينات، 0.5 مم نا الغلوتامات، 0.02 ملم EDTA، و 10 مللى جلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، وتستكمل الحل مع 2 مم L-الغلوتامات و 10 ميكرومتر DL-AP-4 لمنع عناصر مرتبة أعلى من photoresponse 10،11، والفيتامينات مع MEM 0.1٪ و MEM الأحماض الأمينية حلول (سيجما) لتحسين شبكية العين الجدوى.
- فأر حل الكهربائي: 140 ملم كلوريد الصوديوم، 3.6 ملم بوكل، 2.4 مم MgCl 2، 1.2 مم CaCl 2، 3 HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة، هيدروكسيد الصوديوم). الحل في الجزء الأسفل من ايلىمساحة ctrode يحتوي أيضا على 2 مم L-الغلوتامات لمنع انتقال متشابك (10) وبالإضافة إلى ذلك، 10 ملي بووتون 2 إلى قمع المكون الدبقية من photoresponse 3،12.
- شبكية العين حل حضانة: حل 272 ملغ L-15 متوسطة (سيغما) و 20 ملغ جيش صرب البوسنة في 20 مل من الماء منزوع الأيونات. نهائي L-15 وتركيزات جيش صرب البوسنة هي 13.6 ملغ / مل و 1 ملغ / مل، على التوالي. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك 1 م.
الشكل 1. رسم تخطيطي يظهر العزلة من شبكية العين الماوس للتسجيلات ERG transretinal.
الشكل 2. صورة لغرفة نضح وأقطاب تسجيل مع أصحابها. السهام الحمراء تشير إلى اتجاه تدفق نضح.
الشكل 3. رسم تخطيطي لإعداد تجريبي للتسجيلات ERG transretinal. السهام الحمراء تشير إلى اتجاه تدفق نضح.
النتائج الممثل الشكل 4: سجلت عائلة من ردود قضيب يحركها الماوس transretinal. وكانت Photoresponses المنخفضة تمرير المصفاة في 30 هرتز (8-قطب بسل)، رقمية في 1 كيلو هرتز وتخزينها على جهاز الكمبيوتر لمزيد من التحليل. آثار أظهرت تمثل متوسطات استجابات 5-6 في شدة الضوء الخافت والاستجابات 2-3 في شدة ضوء تشبع.
الشكل 5 نتائج الممثل: عائلة مسجل ردود مخروط يحركها الماوس transretinal. وكانت Photoresponses المنخفضة تمرير المصفاة في 30 هرتز (8-قطب بسل)، رقمية في 1 كيلو هرتز وتخزينها على جهاز الكمبيوتر لمزيد من التحليل. وأظهرت آثار averagوفاق من ردود 5-10 في شدة الضوء الخافت والاستجابات 3-5 في شدة ضوء تشبع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ووصف أسلوب العصا والمخروط يحركها التسجيلات ERG transretinal أعلاه أصبح أداة قوية لتحقيق وظيفة من المستقبلات الضوئية الماوس في كل نوع البرية والحيوانات المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى توصيف سهل من خصائص photoresponse الأساسية، وهذا أسلوب بسيط ويوفر استقرار كبير خلال استجابة طويلة الأمد التجارب التي أجريت على الاستعدادات شبكية العين القريبة من حالها. كلا داكنة تكييفها قضيب السعة القصوى استجابة وحساسية للضوء في الفئران البرية نوع مستقرة ضمن ما لا يقل عن 1H من بداية التسجيلات، واتساع مخروط داكنة تكييفها القصوى وحساسية للضوء عادة لا تنخفض أكثر من 10٪ بعد دقائق من 30-40 التسجيلات. المزايا الأخرى لهذه التقنية هي بقدراتها على التلاعب الدوائية السهلة التي لا يمكن الوصول إليه في التسجيلات الكلاسيكية الشفط وحيدة الخلية من المستقبلات الضوئية الماوس، وعدم وجود التخدير، واللازمة لأداء حية سجل ERG الحيوانبالجلسات. استخدام شبكية العين من Tα - / - خط الفأر مع قضيب القضاء يشير 8 لتسجيلات transretinal مخروط يسهل إلى حد كبير على حد سواء الإجراءات التجريبية وتفسير النتائج. هذا مهم بشكل خاص في التجارب التي تهدف إلى مراقبة الماوس مخروط تجديد صبغة بصرية بعد التعرض للإضاءة ساطعة و / أو دراسة وظيفة مخروط في وجود ضوء خلفية ثابتة. وهكذا، وجهات نظر جديدة ومثيرة تفتح الآن عن التحقيق في الخصائص الفيزيولوجية للقضبان ومخاريط الماوس بما في ذلك نماذج الماوس لاضطرابات بصرية قضيب والمخروط ذات الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
بدعم من جائزة التطوير المهني من البحوث للوقاية من العمى، والمعاهد الوطنية للصحة منح EY19312 EY19543 (VJK)، وكذلك منح المطلقة من البحوث للوقاية من العمى وEY02687 (قسم طب العيون والعلوم البصرية في جامعة واشنطن).
References
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
- Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
