Transretinal ERG Optagelser fra Mouse nethinden: Rod og Cone Photoresponses

Summary

Beskriver vi en relativt enkel fremgangsmåde til transretinal elektroretinogram (ERG) optagelser til opnåelse stang og kegle photoresponses fra intakte muse retina. Denne tilgang tager fordel af den blok af synaptisk transmission fra fotoreceptorer til at isolere deres lette svar og registrere dem ved hjælp af feltelektroder placeret over den isolerede flade monteret nethinden.

Abstract

Der er to distinkte klasser af billeddannende fotoreceptorer i hvirveldyr nethinden: stave og tappe. Stænger er i stand til at detektere en enkelt lysphotoner henviser kegler arbejde kontinuerligt under ændrer sig hurtigt klare lysforhold. Absorption af lys ved stangformede og kegle-specifikke visuelle pigmenter i de ydre segmenter af fotoreceptorer udløser en lysoverførelsen, som til sidst fører til lukning af cykliske nukleotid-gatede kanaler på plasmamembranen og celle hyperpolarisering. Dette lys-induceret ændring i membran nuværende og potentielle kan blive registreret som photoresponse, ved enten klassisk suge elektrode optagelse teknik ^1,2 eller transretinal elektroretinogrammet optagelser (ERG) fra isolerede nethinder med farmakologisk blokerede postsynaptiske respons komponenter ^3-5. Den sidstnævnte metode tillader lægemiddel-tilgængelige langvarige optagelser fra mus fotoreceptorer og er særlig nyttig til at opnå stabile photoresponses frOM de begrænsede og skrøbelige mus kegler. I tilfælde af kegler, kan sådanne eksperimenter kan udføres både i mørke-tilpassede betingelser og efter intens belysning, blegemidler stort set alle visuelle pigment, til overvågning af keglen lysfølsomhed opsving i løbet af mørke tilpasning ^6,7. I denne video, vil vi vise, hvordan man udfører stang-og M / L-kegle-drevne transretinal optagelser fra mørke-tilpasset mus nethinden. Stangen optagelser udføres ved anvendelse retina af vildtype (C57BL / 6) mus. For nemheds skyld vil kegle optagelser opnås fra genetisk modificerede stang transducin α-underenhed knockout (Ta ^{- / -)} mus, der mangler stangen signalering ^8.

Protocol

1. Gør Elektroder

1. Forberede glaselektroder. Afvej 120 mg agar og bland i 10 ml destilleret vand (endelig agar koncentration 1,2%). Smelte agaropløsning i varmt vandbad. Fylde glaskapillarer (vi bruger Word Presision Instruments TW100-4 kapillarer med følgende dimensioner: længde = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, og det indre volumen = 44 uL) med agaropløsning ved hjælp plastsprøjte. Størkne agar ved stuetemperatur i 10 min. Således op til ~ 200 kapillarer kan fyldes (resten af ​​agar blandingen kan opbevares ved -4 ° C og genanvendes flere gange).
2. Skær kapillærerne i to halvdele ved hjælp af en diamant kniv.
3. Soak de resulterende glaselektroder i mus elektrode opløsning i mindst 24 timer ved 4 ° C. Opbevares elektroderne ved 4 ° C og anvende dem over en periode på 3-4 måneder.

2. Opsætning af eksperimentet

1. Mørk tilpasse en mus natten over. Anvendes vildtype (f.eks C57Bl / 6) mus stang drevne transretinal optagelser og T-a ^{- / -} mus som mangler stang signalering ⁸ til kegle transretinal optagelser.
2. Forbered 1 L perfusionsopløsningen, 100 ml elektrode-løsning, og 20 ml inkubation opløsning (se nedenfor) og filtrere perfusionsopløsningen igennem en Millipore 0,45 um eller 0,22 mm filter (valgfrit).
3. Kalibrere lyskilde (505 nm LED eller halogen pære optisk stimulator) under anvendelse af et fotometer placeret på planet af nethinden. I tilfælde af LED lyskilde anvende en optisk diffuser for at opnå let ensartethed.
4. Forbered perfusionskammeret for eksperiment (kammer konstruktioner kan variere). Vores kammer er fremstillet af 3 mm plexiglas med en bund fremstillet af låget af en lille plast Petri-skål, og har en aktiv perfusion volumen ~ 400 uL (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm). Udfylde den nedre elektrode rum kammeret med elektroden opløsning indeholdende 2 mM L-glutamat og 10 mM _BaCl2. Ved hjælp af plastrør, og en kapillarrøret, en forbindelse mellem opløsningen i nedre elektrode rum (fremstillet af plast slangeforbindelsesindretningen fastgjort til kammeret nederst) og elektrodeholderen lave. Sikre, at der ikke er nogen bobler i elektroden, den forbindende rør eller elektrodeholderen (rense opløsningen under anvendelse plastsprøjte hvis nødvendigt).
5. Monter optagelsen kammer på scenen af ​​mikroskopet (valgfrit: mikroskopet kan monteres på en anti-vibration bord og afskærmet i et Faradays bur for at minimere mekanisk og elektromagnetisk støj). Forbinde den nedre elektrode holderen til den positive hovedtrin pol af differensforstærkeren (f.eks Warner Instruments DP-311 forstærker). Center og tilpasse kammeret nederste elektrode åbning med stimulus lysplet. Tilslut perfusion linje til optagelse kammeret og drej perfusion på.
6. Boble perfusionsopløsningen med _95% O2 / 5% CO _2, mens inkubere dem i 40 ° C watis bad. CO ₂ justerer pH af opløsningen til 7,2. Opløsningen strømmer fra flasken til optagelse kammeret ved hjælp af tyngdekraften gennem en keramisk modstand genopvarmning det til 36-37 ° C. For at reducere varmetabet bør varmelegeme anbragt så tæt på optagelsen kammeret som muligt, helst på det stadium af mikroskopet.
7. Med en flowregulator justere strømningshastigheden til omkring 1 ml / min.
8. Forbinde den øvre elektrode til den anden (negative) pol af hovedtrin ved hjælp af en anden elektrode holder. Binde termoelement til den øvre elektrode med en O-ring. Sikre, at elektroden og termoelement spidser ligger tæt sammen, således at temperaturen aflæsning så tæt på midten af ​​nethinden som muligt. Nedsænkes spidsen af ​​den øvre elektrode i perfusion opløsningen og anbringes i midten af ​​kammeret. Tillader 10-15 minutter for basal stabilisering.
9. Justere DC spænding for varmelegemet, således at temperaturen af ​​opløsningen er 36 -37 ° C.

3. Isolering af Mouse Retina

1. Under svagt rødt lys, aflive de mørke indrettet mus _med CO2 og cervikal dislokation. Valgfrit: at en henvisning præg på hver mus øjeæble af ætsende det mest dorsale punkt sclera med en kautering pen eller opvarmet dissekere pin. Alle efterfølgende procedurer udføres under infrarødt lys ved hjælp af infrarødt billede konvertere fit til et dissektionsmikroskop.
2. Dissekere de øjnene med krum saks ved at anvende et let tryk og strækker huden på siderne af hvert øje. Hemisect begge øjne under infrarød belysning ved hjælp microscissors eller et barberblad.
3. Fjerne hornhinden og linsen. Fjerne så meget af den glasagtige som muligt.
4. Skræl den første retina fra pigmentepithelet lag og eventuelt grundigt renses med pincet for at fjerne tilbageværende granuler af pigment-epitel. Vi typisk under anvendelse af hele retina både stang og konus transretFSLUTTENDE optagelser. Men, hvis du ønsker specifikt at optage fra den dorsale del af mus nethinden, der har mere M / L-kegler ^9, før peeling nethinden fjerne den ventrale del af øjestykket med et barberblad eller microscissors bruge kautering varemærke som en reference.
5. Anbring den anden hemisected øjeæblet i en lille petriskål med inkubering opløsning og inkuber præparat i en lystæt kasse mættet med rent oxygen indtil anvendelse. Typisk under disse betingelser anden mus øjestykket kan opbevares i adskillige timer ved stuetemperatur og anvendes til optagelser.
6. Under anvendelse af en glas-eller plast pipette overføre isolerede nethinden til en dråbe perfusion opløsning (ca. 300 ul) på låget af en petriskål. Tilsættes 5-6 små dråber elektrode opløsning indeholdende _BaCl2 til præinkuberes retina med _BaCl2. Læg et firkantet stykke (ca. 5x5 mm) af bagsiden hjørne-smurte (vi bruger Dow Corning 111 ventil smøremiddel og tætningsmiddel) Millipore filterpapir (0,45 um hArg-type) med præfremstillede huller i midten (2-2,5 mm i diameter) til den samme opløsning dråbe. Brug pincet position nethinden oven på filterpapir (fotoreceptor side op) og tryk på sine kanter på periferien til flad-montere den. Nethinden skal centreres over åbningen i filterpapiret.
7. Med pincet overføre filterpapir med nethinden til perfusionskammeret og anbringes over den stimulus spot-linie nedre elektrode rum. Let tryk de smurte kanter filterpapiret at binde det til kammeret.
8. Anbring den øverste elektrode over retina centrum (svagt rører fotoreceptorlaget). Centrere øverste elektrode på nethinden forøger signalamplitude (op til ~ 20-40% sammenlignet med placere den tættere på nethinden kant). Selv om en sådan elektrode placering forvrænger svagt effektiv lysstimulus intensitet opnå en lille del af nethinden (~ 12-15% af den samlede areal), er det stadig den optimale måde at placere den elektrode. Præparatet er nu klar til transretinal optagelser.

4. Transretinal Recordings

1. Afhængig af din mus linje, registrere stang eller M / L-kegle-drevne test flash svar fra dim til lys intensiteten af ​​kalibreret 505 nm lys, fra LED-lyskilde eller optisk stimulator. I tilfælde af vores LED-lyskilde, er flash-intensiteten styres af en kombination af edb-styring af LED indgangsspænding, omskiftelige modstande, og et sæt neutralfiltre (vi bruger E-farve # 211 0,9 ND film filtre fra Rosco Laboratories ) er anbragt mellem LED og nethinden. Varigheden af ​​LED testen flash (20 ms) styres af en computer. Hvis der anvendes en halogenpære optisk stimulator, kan test flash intensitet og bølgelængde styres af et sæt af neutralfiltre og smalbåndede interferensfiltre, hhv. Testen flash varighed kan styres af en computer-drevne skodder.
2. Valgfrit: for at opretholde en effektivundertrykkelse af glial komponent photoresponse med _BaCl2 i løbet af dagen, ændrer den nedre elektrode opløsningen lejlighedsvis (f.eks før testning hver nethinden) ved skylning den med en plastsprøjte fyldt med frisk opløsning.

5. Repræsentative resultater

Løsninger

1. Mus retina perfusionsopløsning: 112,5 mM NaCI, 3,6 mM KCI, 2,4 mM _MgCl2, 1,2 mM _CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM _NaHCO3, 3 mM Na-succinat, 0,5 mM Na-glutamat, 0,02 mM EDTA, og 10 mM glucose. Desuden er opløsningen suppleret med 2 mM L-glutamat og 10 uM DL-AP-4 til at blokere højere ordens komponenter photoresponse ^10,11 og med 0,1% MEM-vitaminer og MEM-aminosyrer opløsninger (Sigma) for at forbedre retina levedygtighed.
2. Mus elektrode opløsning: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCI, 2,4 mM _MgCl2, 1,2 mM CaCI _2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). Opløsningen i den nedre elementctrode rummet også indeholder 2 mM L-glutamat til at blokere synaptisk transmission ¹⁰ og desuden til 10 mM _BaCl2 undertrykke glial komponent af photoresponse ^3,12.
3. Retina inkubation opløsning: Opløs 272 mg L-15 medium (Sigma) og 20 mg BSA i 20 ml deioniseret vand. Endelig L-15 og BSA-koncentrationerne er 13,6 mg / ml og 1 mg / ml. Juster pH til 7,4 med 1 M HCI.

Figur 1. Skematisk diagram, der viser isoleringen af muse nethinden for transretinal ERG optagelser.

Figur 2. Foto af perfusionskammeret og optagelse af elektroder med deres indehavere. Røde pile viser retningen af ​​perfusion strømning.

Figur 3. Skematisk diagram af forsøgsopstillingen for transretinal ERG optagelser. Røde pile viser retningen af ​​perfusion strømning.

. Figur 4 Repræsentative resultater: registreret familie af muse stang-drevne transretinal reaktioner. Photoresponses var lavpasfiltreres ved 30 Hz (8-polet Bessel), digitaliseret ved 1 kHz og lagres på en computer til yderligere analyse. Vist spor repræsenterer gennemsnit af 5-6 svar på dunkle lysintensiteter og 2-3 reaktioner ved mættende lysintensiteter.

Figur 5 Repræsentative resultater. Optaget familie af muse konisk drevne transretinal responser. Photoresponses var lavpasfiltreres ved 30 Hz (8-polet Bessel), digitaliseret ved 1 kHz og lagres på en computer til yderligere analyse. Vist spor er Gennemses af 5-10 svar på dunkle lysintensiteter og 3-5 reaktioner ved mættende lysintensiteter.

Discussion

Fremgangsmåden stangformede og kegle-drevne transretinal ERG optagelser beskrevet ovenfor bliver et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af funktionen af ​​muse fotoreceptorer i både vildtype-og genetisk modificerede dyr. Ud over den nemme karakterisering af grundlæggende photoresponse egenskaber, giver denne simple teknik god respons stabilitet under langvarige forsøg udført på tæt-på-intakte nethinden præparater. Både mørke tilpasset stang maksimale respons amplitude og lysfølsomhed i vildtypemus er stabile i mindst 1 time fra begyndelsen af ​​optagelser, og den mørke tilpassede kegle maksimal amplitude og lysfølsomhed typisk ikke falde mere end 10% efter 30-40 minutters optagelser. Andre fordele ved denne teknik er dens tilgængelighed for let farmakologiske manipulationer, der er utilgængelig for klassiske encellede suge optagelser fra mus fotoreceptorer, og fraværet af anæstesi, der kræves til udførelse af levende dyr ERG recordsomheder. Brug nethinder af Ta ^{- / -} mus linje med elimineres stang signalering ⁸ for kegle transretinal optagelser væsentligt letter både eksperimentelle procedurer og tolkning af resultaterne. Dette er især vigtigt i eksperimenter til overvågning mus kegle visuelt pigment regenerering efter udsættelse for lys belysning og / eller at studere kegle funktion i nærvær af konstant baggrundslys. Således er nye spændende perspektiver åbner nu for at undersøge de fysiologiske egenskaber af muse-stænger og kegler, herunder musemodeller for stang-og kegle-relaterede synsforstyrrelser.