माउस रेटिना से transretinal एर्ग रिकॉर्डिंग: रॉड और शंकु Photoresponses के के.

Summary

हम बरकरार माउस रेटिना से रॉड और कोन photoresponses के प्राप्त करने के लिए transretinal electroretinogram (एर्ग) रिकॉर्डिंग का एक अपेक्षाकृत सरल विधि का वर्णन. यह दृष्टिकोण photoreceptors से synaptic प्रसारण के ब्लॉक का लाभ लेता है अपने प्रकाश प्रतिक्रियाओं को अलग करने और उन्हें रिकॉर्ड क्षेत्र फ्लैट घुड़सवार अलग रेटिना भर में रखा इलेक्ट्रोड का उपयोग.

Abstract

छड़ और शंकु: हड्डीवाला रेटिना में दो अलग छवि बनाने photoreceptors के वर्गों रहे हैं. छड़ प्रकाश की फोटॉनों का पता लगाने में सक्षम हैं जबकि शंकु लगातार तेजी से उज्ज्वल प्रकाश स्थितियों को बदलने के तहत संचालित. रॉड और कोन photoreceptors के बाहरी क्षेत्रों में विशिष्ट दृश्य pigments द्वारा प्रकाश के अवशोषण कि अंततः प्लाज्मा झिल्ली और सेल hyperpolarization के पर चक्रीय nucleotide-gated चैनलों को बंद करने के लिए सुराग एक phototransduction झरना हो सके. वर्तमान और संभावित झिल्ली में यह परिवर्तन एक photoresponse प्रकाश प्रेरित के रूप में पंजीकृत किया जा सकता है या तो शास्त्रीय चूषण इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग तकनीक ^1,2 या pharmacologically अवरुद्ध postsynaptic प्रतिक्रिया ^3-5 घटकों के साथ अलग retinas के के से transretinal electroretinogram रिकॉर्डिंग (एर्ग) द्वारा. बाद के विधि माउस photoreceptors से दवा सुलभ लंबे समय से स्थायी रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है और स्थिर photoresponses fr प्राप्त करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैओम दुर्लभ और नाजुक माउस शंकु. शंकु के मामले में, इस तरह के प्रयोगों दोनों काले अनुकूलित शर्तों और निम्नलिखित तीव्र रोशनी है कि अनिवार्य रूप से सभी दृश्य रंगद्रव्य bleaches में प्रदर्शन किया जा सकता है, अंधेरे ^6,7 अनुकूलन दौरान कोन photosensitivity वसूली की प्रक्रिया की निगरानी. इस वीडियो में, हम दिखा देंगे कि कैसे के काले अनुकूलित माउस रेटिना से रॉड और एम / एल - कोन संचालित transretinal रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए. रॉड रिकॉर्डिंग जंगली प्रकार (6 / C57BL) चूहों के रेटिना का उपयोग किया जाएगा. चूहों जो ⁸ संकेत छड़ी की कमी है. सादगी के लिए, शंकु रिकॉर्डिंग से आनुवंशिक रूप से संशोधित रॉड transducin α-सबयूनिट पीटा ^{(- /} Tα) प्राप्त किया जाएगा

Protocol

1. इलेक्ट्रोड बनाना

1. कांच इलेक्ट्रोड तैयार. 120 मिलीग्राम अगर वजन और 10 एमएल आसुत पानी (अंतिम अगर एकाग्रता 1.2%) में यह मिश्रण. गर्म पानी के स्नान में अगर समाधान पिगलो. अगर प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग कर समाधान के साथ भरें: कांच के capillaries (= लंबाई 100 मिमी / ओवर ड्राफ्ट आईडी = 1/0.75 मिमी, और आंतरिक मात्रा = 44 μL हम शब्द Presision है उपकरण TW100-4 capillaries के उपयोग निम्नलिखित आयामों के साथ). 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अगर जमना. इस प्रकार, अप करने के लिए ~ 200 capillaries के (अगर मिश्रण के बाकी -4 डिग्री सेल्सियस और फिर से इस्तेमाल किया कई बार पर संग्रहीत किया जा सकता है) भरा जा सकता है.
2. एक हीरे की चाकू का उपयोग कर halves में कटौती के capillaries.
3. कम से कम 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर माउस इलेक्ट्रोड समाधान में जिसके परिणामस्वरूप कांच इलेक्ट्रोड लेना 4 ° सेल्सियस पर इलेक्ट्रोड स्टोर और उन्हें 3-4 महीने की अवधि से अधिक उपयोग करें.

2. प्रयोग की स्थापना

1. एक माउस रात भर अंधेरे अनुकूल है. जंगली प्रकार का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, सीरॉड चालित transretinal, रिकॉर्डिंग और टी α के लिए चूहों 57Bl / 6) ^{- / -} चूहों की कमी छड़ी लिए शंकु transretinal रिकॉर्डिंग ⁸ संकेत.
2. 1 एल छिड़काव समाधान, 100 एमएल इलेक्ट्रोड समाधान, और 20 एमएल ऊष्मायन समाधान (नीचे देखें) तैयार और छिड़काव समाधान गर्त Millipore 0.45 माइक्रोन या 0.22 फिल्टर माइक्रोन (वैकल्पिक) फ़िल्टर.
3. प्रकाश स्रोत (505 एनएम एलईडी या हलोजन बल्ब ऑप्टिकल उत्तेजक औधधि) रेटिना के विमान में रखा दीप्तिमापी का उपयोग जांचना. एलईडी प्रकाश स्रोत के मामले में, एक ऑप्टिकल विसारक का उपयोग करें प्रकाश एकरूपता को प्राप्त करने.
4. छिड़काव कक्ष (कक्ष निर्माण भिन्न हो सकते हैं) प्रयोग के लिए तैयार करते हैं. हमारी कक्ष 3 मिमी Plexiglas के किया जाता है, नीचे के साथ एक छोटे से प्लास्टिक पेट्री डिश के ढक्कन से बनाया, और ~ का एक सक्रिय छिड़काव मात्रा 400 μL (एल = 25 मिमी, डब्ल्यू = 8 मिमी, एच ≈ 2 मिमी) है. इलेक्ट्रोड युक्त 2 मिमी एल - ग्लूटामेट और 10 मिमी ₂ BaCl समाधान के साथ निचले सदन के इलेक्ट्रोड अंतरिक्ष भरें. प्लास्टिक टयूबिंग और एक गिलास केशिका का उपयोग, कम इलेक्ट्रोड (प्लास्टिक टयूबिंग कक्ष नीचे से जुड़ी संबंधक के) अंतरिक्ष और इलेक्ट्रोड धारक में समाधान के बीच एक संबंध बना. सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई बुलबुले में इलेक्ट्रोड, जोड़ने टयूबिंग, या इलेक्ट्रोड धारक (शुद्ध) प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग कर अगर जरूरत समाधान कर रहे हैं.
5. (: खुर्दबीन विरोधी कंपन मेज पर रखा जा सकता है और एक फैराडे पिंजरे के भीतर परिरक्षित यांत्रिक और विद्युत चुम्बकीय शोर को कम करने के वैकल्पिक) खुर्दबीन के मंच पर रिकॉर्डिंग कक्ष माउंट. अंतर प्रवर्धक (जैसे वार्नर उपकरण प्रवर्धक डी पी-311) की सकारात्मक headstage के पोल से कम इलेक्ट्रोड धारक कनेक्ट. केंद्र और कक्ष कम उत्तेजना प्रकाश स्थान के साथ खोलने इलेक्ट्रोड संरेखण. रिकॉर्डिंग कक्ष छिड़काव लाइन कनेक्ट और छिड़काव पर बारी.
6. 95% ₂ हे / 5% सीओ _{2 के} साथ बुलबुला छिड़काव समाधान, जबकि यह 40 में incubating डिग्री सेल्सियस वाटएर स्नान. सीओ ₂ 7.2 करने के लिए समाधान के पीएच को समायोजित कर देता है. समाधान एक चीनी मिट्टी रोकनेवाला के माध्यम से गुजर गुरुत्वाकर्षण यह 36-37 के लिए reheating डिग्री सेल्सियस से बोतल से रिकॉर्डिंग कक्ष बहती है गर्मी के नुकसान को कम करने के लिए, हीटर के रूप में संभव के रूप में आदर्श खुर्दबीन के मंच पर रिकॉर्डिंग कक्ष के करीब स्थित होना चाहिए.
7. नियामक के साथ एक प्रवाह के बारे में 1 एमएल / मिनट प्रवाह दर को समायोजित.
8. ऊपरी इलेक्ट्रोड कनेक्ट के एक दूसरे इलेक्ट्रोड धारक का उपयोग headstage के दूसरे ध्रुव (नकारात्मक). ऊपरी इलेक्ट्रोड का उपयोग कर एक अंगूठी - हे thermocouple के जांच के लिए बाध्य. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड और thermocouple युक्तियाँ करीब एक साथ ताकि तापमान पढ़ने के रूप में लिया जाता है संभव के रूप में रेटिना के केंद्र के करीब हैं. छिड़काव के समाधान में ऊपरी इलेक्ट्रोड की टिप को विसर्जित कर दिया और कक्ष के केन्द्र में जगह है. आधारभूत स्थिरीकरण के लिए 10-15 मिनट की अनुमति दें.
9. हीटर ताकि समाधान का तापमान 36 के लिए डीसी वोल्टेज समायोजित करें -37 ° सी.

3. माउस रेटिना अलग

1. धुंधला लाल बत्ती के तहत, सीओ ₂ और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ काले अनुकूलित माउस euthanize. वैकल्पिक: श्वेतपटल की एक दाग़ना कलम या गर्म विदारक पिन के साथ सबसे पृष्ठीय बिंदु cauterizing प्रत्येक माउस नेत्रगोलक पर एक संदर्भ चिह्न बनाते हैं. बाद के सभी प्रक्रियाओं अवरक्त अवरक्त छवि एक विदारक खुर्दबीन के लिए फिट कन्वर्टर्स का उपयोग कर प्रकाश के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं.
2. सौम्य दबाव लागू करने और प्रत्येक आँख के पक्षों पर त्वचा को खींच द्वारा घुमावदार कैंची के साथ आंखों को काटना. अवरक्त microscissors या एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर रोशनी के तहत दोनों आंखों Hemisect के.
3. कॉर्निया और लेंस निकालें. के रूप में संभव के रूप में शीशे का बहुत निकालें.
4. वर्णक उपकला परत से पहले रेटिना पील और, यदि आवश्यक हो, संदंश के साथ अच्छी तरह से यह साफ करने के लिए वर्णक उपकला के शेष granules निकालने. हम आम तौर पर दोनों रॉड और कोन transret के लिए पूरे रेटिना का उपयोग कर रहे हैंinal रिकॉर्डिंग. हालांकि, अगर आप के लिए विशेष रूप से माउस रेटिना के पृष्ठीय हिस्सा है कि ^{9 और} अधिक एम एल / शंकु से छीलने रेटिना एक रेजर ब्लेड या microscissors एक संदर्भ के रूप में दाग़ना चिह्न का उपयोग कर के साथ eyecup के उदर भाग को हटाने से पहले रिकॉर्ड की कामना करते हैं.
5. दूसरा hemisected नेत्रगोलक ऊष्मायन समाधान के साथ एक छोटा सा पेट्री डिश में रखें और एक प्रकाश तंग बॉक्स का उपयोग करें जब तक शुद्ध ऑक्सीजन के साथ संतृप्त में तैयारी सेते हैं. आमतौर पर, इन शर्तों के तहत दूसरे माउस eyecup कई घंटे के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है और रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया.
6. एक गिलास या प्लास्टिक विंदुक का प्रयोग एक पेट्री डिश के ढक्कन पर छिड़काव समाधान की एक बूंद (ca. 300 μl) के लिए अलग रेटिना. इलेक्ट्रोड समाधान के 5-6 छोटे बूंदों ₂ BaCl साथ पूर्व सेते हैं रेटिना युक्त BaCl ₂ में जोड़ें. पीछे की ओर का एक वर्ग (ca. 5x5 मिमी) टुकड़ा कोने से greased (हम डॉव Corning 111 वाल्व स्नेहक और सीलेंट का उपयोग करें) प्लेस Millipore फिल्टर पेपर (0.45 माइक्रोन प्रकार इसके केंद्र में छेद ही समाधान ड्रॉप करने के लिए पूर्व (2-2.5 व्यास में मिमी) के साथ) HARG. संदंश स्थिति फिल्टर पेपर (फोटोरिसेप्टर ऊपर की ओर) के शीर्ष पर रेटिना का उपयोग करना है और यह फ्लैट माउंट परिधि पर इसके किनारों प्रेस. रेटिना फिल्टर पेपर में खोलने पर केंद्रित किया जाना चाहिए.
7. संदंश का प्रयोग रेटिना के साथ छिड़काव कक्ष के लिए फिल्टर पेपर और हस्तांतरण यह प्रेरणा स्थान के अनुरूप कम इलेक्ट्रोड अंतरिक्ष के ऊपर जगह है. थोड़ा कक्ष के साथ यह बांड के लिए फिल्टर पेपर के किनारों से greased दबाएँ.
8. रेटिना केंद्र (थोड़ा फोटोरिसेप्टर परत को छूने के लिए) पर ऊपरी इलेक्ट्रोड रखें. ऊपरी इलेक्ट्रोड रेटिना पर केंद्रित संकेत आयाम (अप करने के लिए ~ 20-40% के रूप में यह रेटिना बढ़त के करीब रखने की तुलना में) बढ़ जाती है. हालांकि ऐसे इलेक्ट्रोड स्थान थोड़ा प्रभावी प्रकाश उत्तेजना तीव्रता रेटिना (~ इसकी कुल क्षेत्र के 12-15%) के एक छोटे से क्षेत्र तक पहुँचने विकृत, यह अभी भी चुनाव रखने के इष्टतम तरीका हैtrode. अब तैयारी है transretinal रिकॉर्डिंग के लिए तैयार है.

4. Transretinal रिकॉर्डिंग

1. अपने माउस लाइन, रिकॉर्ड छड़ी या कैलिब्रेटेड 505 एनएम प्रकाश एलईडी प्रकाश स्रोत या ऑप्टिकल उत्तेजक औधधि से प्रदान की उज्ज्वल तीव्रता मंद से एम / एल शंकु संचालित परीक्षण फ़्लैश प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करता है. हमारे एलईडी प्रकाश स्रोत के मामले में, फ्लैश तीव्रता एलईडी इनपुट वोल्टेज, switchable के प्रतिरोधों, और तटस्थ घनत्व फिल्टर का एक सेट (हम ई रंगीन Rosco प्रयोगशालाओं से 0.9 # 211 एन डी फिल्म फिल्टर का उपयोग करने के कम्प्यूटरीकृत नियंत्रण का एक संयोजन द्वारा नियंत्रित किया जाता है ) एलईडी और रेटिना के बीच रखा गया है. एलईडी फ्लैश परीक्षण की अवधि (20 एमएस) एक कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है. एक हलोजन बल्ब ऑप्टिकल उत्तेजक औधधि का उपयोग अगर, परीक्षण फ़्लैश तीव्रता और तरंग दैर्ध्य तटस्थ घनत्व फिल्टर और संकीर्ण बैंड हस्तक्षेप फिल्टर, क्रमशः के एक सेट के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. टेस्ट फ़्लैश अवधि कंप्यूटर संचालित शटर द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है.
2. वैकल्पिक: कुशल बनाए रखने के लिए₂ BaCl साथ photoresponse की glial दिन भर घटक का दमन, कम इलेक्ट्रोड समाधान कभी कभी यह purging के ताजा समाधान से भरा एक प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग कर (पूर्व प्रत्येक रेटिना परीक्षण करने के लिए जैसे).

5. प्रतिनिधि परिणाम

समाधान

1. माउस रेटिना छिड़काव समाधान: 112.5 मिमी NaCl, 3.6 मिमी KCl, 2.4 मिमी ₂ MgCl, 1.2 मिमी ₂ CaCl, 10 मिमी (7.2 पीएच) HEPES, 20 मिमी ₃ NaHCO, 3 मिमी ना succinate, 0.5 मिमी ना ग्लूटामेट, 0.02 मिमी EDTA, और ग्लूकोज 10 मिमी. इसके अलावा, समाधान के 2 मिमी एल ग्लूटामेट और 10 माइक्रोन डीएल-AP-4 उच्च ^10,11 photoresponse के क्रम घटक ब्लॉक के साथ पूरक है, और 0.1% सदस्य विटामिन और सदस्य अमीनो एसिड समाधान (सिग्मा) के साथ रेटिना में सुधार करने के लिए व्यवहार्यता.
2. माउस इलेक्ट्रोड समाधान: 140 मिमी, NaCl 3.6 मिमी KCl, 2.4 मिमी ₂ MgCl, 1.2 मिमी ₂ CaCl, 3 मिमी HEPES है (7.4 पीएच, NaOH). कम तत्वों में समाधानctrode अंतरिक्ष भी 2 मिमी एल - ग्लूटामेट synaptic ¹⁰ पारेषण और, इसके अलावा में ब्लॉक शामिल हैं, 10 मिमी ₂ BaCl ^3,12 photoresponse की glial घटक को दबाने के लिए.
3. रेटिना ऊष्मायन समाधान: 272 मिलीग्राम एल 15 (सिग्मा) मध्यम और 20 मिलीग्राम बीएसए 20 एमएल विआयनीकृत पानी में भंग. अंतिम L-15 और BSA सांद्रता 13.6 मिलीग्राम / एमएल और 1 मिलीग्राम / एमएल, क्रमशः. 7,4 एम 1 एचसीएल के साथ पीएच को समायोजित करें.

चित्रा 1 योजनाबद्ध आरेख transretinal एर्ग रिकॉर्डिंग के लिए माउस रेटिना के अलगाव दिखा.

चित्रा 2 छिड़काव कक्ष और उनके धारकों के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की तस्वीर. लाल तीर छिड़काव प्रवाह की दिशा का संकेत मिलता है.

चित्रा 3 transretinal एर्ग रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोगात्मक स्थापना के योजनाबद्ध आरेख. लाल तीर छिड़काव प्रवाह की दिशा का संकेत मिलता है.

चित्रा 4 प्रतिनिधि परिणाम: माउस रॉड चालित transretinal, प्रतिक्रियाओं के परिवार को दर्ज की गई. Photoresponses थे 30 हर्ट्ज (बेसल 8 पोल) में कम से गुजारें फ़िल्टर, 1 kHz पर डिजीटल और आगे के विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर पर संग्रहीत. मंद प्रकाश और saturating के प्रकाश की तीव्रता में तीव्रता 2-3 प्रतिक्रियाओं पर दिखाया निशान 5-6 प्रतिक्रियाओं का औसत प्रतिनिधित्व करते हैं.

5 चित्रा प्रतिनिधि परिणाम: माउस शंकु संचालित transretinal प्रतिक्रियाओं का रिकार्ड परिवार. Photoresponses थे 30 हर्ट्ज (बेसल 8 पोल) में कम से गुजारें फ़िल्टर, 1 kHz पर डिजीटल और आगे के विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर पर संग्रहीत. दिखाया निशान averag रहे हैं5-10 प्रतिक्रियाओं का मंद प्रकाश और saturating के प्रकाश की तीव्रता में तीव्रता 3-5 प्रतिक्रियाओं पर तों.

Discussion

रॉड और कोन संचालित transretinal एर्ग रिकॉर्डिंग की विधि ऊपर वर्णित दोनों जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं में माउस photoreceptors के समारोह की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनता जा रहा है. बुनियादी photoresponse संपत्तियों की आसान विशेषताओं के अलावा, इस सरल तकनीक लंबे समय तक चलने वाले बंद को बरकरार रेटिना की तैयारी पर प्रदर्शन प्रयोगों के दौरान महान प्रतिक्रिया स्थिरता प्रदान करता है. दोनों काले अनुकूलित रॉड अधिक से अधिक प्रतिक्रिया और जंगली प्रकार चूहों में आयाम photosensitivity 1 के भीतर कम से कम रिकॉर्डिंग की शुरुआत से स्थिर हैं, और आम तौर पर काले अनुकूलित शंकु के अधिक से अधिक आयाम और photosensitivity के 30-40 मिनट के बाद 10% से अधिक गिरावट नहीं है रिकॉर्डिंग. इस तकनीक का लाभ आसान औषधीय जोड़तोड़ कि शास्त्रीय एकल कोशिका माउस photoreceptors से चूषण रिकॉर्डिंग में पहुंच के बाहर है ज़िम्मा, और संज्ञाहरण के अभाव, जीना पशु एर्ग रिकॉर्ड प्रदर्शन के लिए आवश्यक हैंबैठकों. ^{/ -} Tα के retinas सफाया छड़ी के साथ माउस लाइन एक शंकु transretinal रिकॉर्डिंग के लिए ⁸ संकेतन का प्रयोग काफी हद तक दोनों प्रयोगात्मक प्रक्रिया और परिणामों की व्याख्या की सुविधा. यह चमकदार रोशनी और / प्रदर्शन के बाद माउस कोन दृश्य वर्णक के उत्थान की निगरानी या स्थिर पृष्ठभूमि के प्रकाश की उपस्थिति में शंकु समारोह का अध्ययन करने के उद्देश्य से प्रयोगों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, नया रोमांचक दृष्टिकोण अब छड़ और शंकु के संबंधित दृश्य विकारों के लिए माउस मॉडल सहित माउस छड़ और शंकु के शारीरिक गुणों की जांच के लिए खोल रहे हैं.