Summary
우리는 그대로 마우스 망막에서 막대와 원뿔 photoresponses를위한 transretinal electroretinogram (에르그) 레코딩 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 가벼운 반응을 분리하고 분리된 평면 마운트 망막에 걸쳐 배치 필드 전극을 사용하여 그들을 기록하는 photoreceptors에서 시냅스 전송 블록의 활용합니다.
Abstract
막대와 원뿔 : 척추 망막에있는 이미지 성형 photoreceptors의 두 개의 클래스가 있습니다. 콘 빠르게 밝은 빛 조건을 변경 하에서 지속적으로 작동 반면 막대는 빛의 단일 광자를 감지할 수 있습니다. photoreceptors의 외부 세그먼트의 막대 및 원뿔 특정 시각 색소에 의한 빛의 흡수는 결국 플라즈마 막과 세포 hyperpolarization에 주기적 염기 - 게이트 채널의 폐쇄에 이르게 phototransduction 층계를 트리거합니다. 현재 및 잠재적인 멤브레인이 빛을 유도된 변화는 역시 클래식 흡입 전극 녹음 기술의 1,2이나 pharmacologically 차단 postsynaptic 응답 구성 요소 3-5과 격리된 망막에서 transretinal electroretinogram 레코딩 (에르그)에 의해, photoresponse로 등록하실 수 있습니다. 후자의 방법은 마우스 photoreceptors에서 약물 액세스할 지속적인 녹음이 가능하고 안정적인 photoresponses에게 금을 얻기 위해 특히 유용톰 부족하고 연약한 마우스 콘. 원뿔의 경우, 그러한 실험은 어두운 적응 6,7 동안 원뿔 photosensitivity 복구 과정을 모니터링하는 모두 본질적으로 모든 시각 색소 표백제로 닦았을 어두운 적응 조건과 다음과 같은 강렬한 조명으로 수행할 수 있습니다. 이 동영상에서 우리는 어두운 적응 마우스 망막에서 막대와 M / L, 원추 중심 transretinal 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다. 로드 녹음은 야생 유형 (C57Bl / 6) 생쥐의 망막을 사용하여 수행됩니다. 8 신호 막대 부족 생쥐. 단순 들어, 원뿔 음반은 유전자 변형로드 transducin에서 α-subunit 녹아웃 (- - / Tα) 얻을 것이다
Protocol
1. 전극을 만들기
- 유리 전극을 준비합니다. 120 MG 한천 배지의 무게를 10 ML 증류수 (최종 한천 농도 1.2 %)에 섞는다. 온수 욕조에서 한천 솔루션을 용융. 플라스틱 주사기를 사용하여 한천 솔루션 : 유리 모세관 (길이 = 100mm, OD / ID = 1/0.75 mm, 내부 부피 = 44 μL 우리는 다음과 같은 차원으로 TW100-4 모세관 워드 Presision 악기 사용) 입력합니다. 10 분 상온에서 한천을 고체화. 따라서, 최대 ~ 200 모세 혈관이 (한천 혼합물의 나머지가 -4 ° C와 재 사용 여러 차례에 저장할 수) 충만 수 있습니다.
- 다이아몬드 나이프를 사용하여 반쪽으로 모세 혈관을 잘라요.
- 4 ° C.에 최소 24 시간 동안 마우스 전극 용액의 결과로 유리 전극을 적시게 4 ° C에서 전극을 저장하고 3~4개월의 기간 동안 그들을 사용합니다.
2. 실험 설정하기
- 하룻밤 사이에 마우스를 어두운 적응. (예를 들어, C, 야생 유형을 사용막대 중심 transretinal 녹음과 T α에 대한 57Bl / 6) 마우스 - / - 생쥐 부족한 봉은 원추 transretinal 녹음을 위해 8 신호.
- 1 패 재관류 솔루션, 100 ML 전극 용액, 20 ML 보육 솔루션 (아래 참조) 준비 및 재관류 솔루션 여물에게 Millipore 0.45 μm의 또는 필터 0.22 μm의 (선택 사항) 필터링합니다.
- 망막의 비행기에 배치 광도계를 사용하여 광원 (505-nm의 LED 또는 할로겐 전구 광 자극기)를 보정. LED 광원의 경우 빛의 균일를 달성하기 위해 광학 디퓨저를 사용합니다.
- 실험 (챔버 건축이 다를 수 있습니다)에 대한 재관류 챔버를 준비합니다. 우리 회의소는 작은 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑으로 만든 바닥으로, 3 밀리미터 플렉시 글라스로 만들어진, 그리고 ~의 적극적인 재관류 볼륨 400 μL를 (L = 25mm, W = 8mm, H ≈ 2mm) 가지고있다. BaCl 2 MM L-글루 탐 산염 및 10 밀리미터를 포함하는 전극 솔루션 챔버 하부 전극 공간을 채우기. 플라스틱 튜브와 유리 모세관 사용하여 낮은 전극 공간 (챔버 하단에 부착된 플라스틱 튜브 커넥터로 만들어진) 및 전극 홀더의 솔루션 사이의 연결을 확인하십시오. 전극에는 거품, 연결 튜빙, 또는 전극 소유자 (필요한 경우 플라스틱 주사기를 사용하여 솔루션을 정화) 없습니다 있는지 확인합니다.
- 현미경의 스테이지 (현미경은 방진 테이블에 장착, 기계적 및 전자 기적 노이즈를 최소화하기 위해 패러데이 케이지 내에서 차폐 수있는 선택 사항)에 녹음 챔버를 탑재합니다. 차동 증폭기 (예 : 워너 인스 트루먼 트의 DP-311 증폭기)의 긍정적인 headstage의 기둥으로 낮은 전극 홀더를 연결합니다. 센터와 자극 빛의 명소로 개방 챔버 하부 전극에 맞춥니다. 녹음 챔버로 관류 선을 연결하고 재관류를 켜십시오.
- 95% O 5분의 2 %의 CO 2와 버블 관류 용액 40에 잠복기 동안 ° C 와트응급실 목욕. CO 2는 7.2 솔루션의 산도를 조절합니다. 해결책은 36-37로 재열 세라믹 저항을 통과 중력 ° C.에 의해 병에서 녹화 실로 플로우 열 손실을 줄이기 위해 히터가 이상적으로 현미경의 무대에, 가능한 한 기록 챔버 가까이 위치해야합니다.
- 유량 조절기를 통해 약 1 ML / 분으로 유량을 조정합니다.
- 두 번째 전극 홀더를 사용 headstage의 두 번째 (부정적인) 극에 상부 전극을 연결합니다. O-링을 사용하여 상부 전극에 열전쌍 프로브를 바인딩합니다. 전극과 열전대 도움말 가까운 곳에 온도 읽기가 가능한 망막의 중심 가까이로 가져옵니다 있도록 있는지 확인합니다. 관류 용액의 상부 전극의 끝부분을 담가와 챔버의 중앙에 배치. 베이스 라인 안정화를위한 10-15 분 소요됩니다.
- 용액의 온도가 36되도록 히터의 직류 전압을 조정하십시오 -37 ° C.
3. 마우스 망막 분리
- 희미한 붉은 불빛 아래에서 CO 2와 경추 전위와 어두운 맞게 마우스를 안락사. 옵션 : 소작 펜 또는 온수 해부 핀과 공막엔 가장 지느러미 포인트를 cauterizing하여 각 마우스 안구에 참조 표시를합니다. 이후의 모든 절차는 해부 현미경에 적합한 적외선 이미지 변환기를 사용하여 적외선 하에서 수행됩니다.
- 부드럽게 압력을 적용하고 각 안구의 측면에서 피부를 스트레칭으로 굽은 가위로 눈을 해부. microscissors 또는 면도날을 사용하여 적외선 조명 아래 두 눈알을 Hemisect.
- 각막과 렌즈를 제거합니다. 가능한 한 유리의만큼을 제거합니다.
- 안료 상피 층에서 처음으로 망막 벗겨하고, 필요한 경우, 안료 상피의 남아있는 과립을 제거 포셉 그것을 철저하게 닦아주십시오. 우리는 일반적으로 막대와 원뿔 transret 모두에 대한 전체 망막을 사용하는inal 녹음. 그러나 구체적으로 망막이 참조로 소작 마크를 사용하는 면도날이나 microscissors로 세안 컵의 복부 부분을 제거하는 필링 전에, 더 많은 M / L-콘 9를 가지고 마우스 망막의 지느러미 부분에서 녹음하고자하는 경우.
- 인큐베이션 솔루션 작은 배양 접시에있는 두 번째 hemisected 안구를 삽입하고 사용까지 순수 산소로 포화 빛을 꽉 상자의 준비를 품어. 일반적으로 이러한 조건에서 두 번째 마우스 세안 컵은 상온에서 몇 시간 동안 저장할 수 있으며, 녹음에 사용.
- 유리 또는 플라스틱 피펫을 사용하여 페트리 접시의 뚜껑에 재관류 솔루션의 한 방울 (ca. 300 μl)로 분리된 망막을 전송. BaCl 2 미리 품어 망막에 BaCl 2를 포함하는 전극 솔루션의 5-6 작은 방울을 추가합니다. 뒷면의 사각형 조각 (ca. 5x5 ㎜) 모퉁이의 기름칠 (우리는 다우 코닝 111 밸브 윤활제 및 밀봉 재를 사용)를 놓고 Millipore 필터 용지 (0.45 μm의 같은 솔루션 드롭으로 중심에서 미리 만든 구멍 (직경 2-2.5 ㎜)과 함께) 유형을 HARG. 필터 종이 (최대 photoreceptor 사이드)의 상단에 포셉 위치에게 망막을 사용하고 평면 마운트 거기에 주변에 그것의 가장자리를 누르십시오. 망막은 여과지의 개통을 통해 중앙에 있어야합니다.
- 집게를 사용하면 재관류 챔버로 망막과 여과지를 전송하고 자극 스파트 정렬 낮은 전극 공간을 위에 가져 오십시오. 약간 챔버와 결합 그것에 필터 용지의 가장자리에 기름칠을 누르십시오.
- 망막 센터 (약간 photoreceptor 레이어를 만지지) 위에 상부 전극을 배치합니다. 망막에 상부 전극을 중심으로하는 신호 진폭을 (망막의 가장자리가 가까이 배치에 비해 최대 ~ 20-40%) 증가한다. 이러한 전극의 위치가 약간 망막 (는 전체 면적의 ~ 12-15%)의 작은 섹터에 도달 효과적인 조명 자극 강도를 왜곡했지만, 여전히 elec을 배치의 최적의 방법입니다trode. 준비는 이제 transretinal 레코딩을 준비합니다.
4. Transretinal 레코딩
- 마우스 라인, LED 광원이나 광 자극기에서 제공하는 보정 505 나노미터의 빛을 밝게 강도로 희미한에서 레코드로드 또는 M / L-콘 기반의 테스트 플래시 반응에 따라. 우리 LED 광원의 경우, 플래시 강도는 LED 입력 전압, 전환 가능한 저항 및 중성 밀도 필터 세트 (우리는 전자 컬러 노랑 라스코 연구소에서 # 211 0.9 ND 필름 필터를 사용 중 컴퓨터 제어의 조합에 의해 제어됩니다 ) LED와 망막 사이에 위치. LED 테스트 플래시 (20 MS)의 기간은 컴퓨터에 의해 제어됩니다. 할로겐 전구 광 자극기를 사용하는 경우 테스트 플래시 강도와 파장은 각각 중성 밀도 필터와 좁은 밴드 간섭 필터의 집합에 의해 제어 할 수 있습니다. 테스트 플래시 지속 시간은 컴퓨터 기반의 셔터에 의해 제어할 수 있습니다.
- 옵션 : 효율적인 유지 관리를위한하루 종일 BaCl 2 photoresponse의 glial 컴포넌트의 억제는 신선한 솔루션으로 채워진 플라스틱 주사기를 사용하여 그것을 정화하여 (각 망막을 테스트하기 전에 예) 가끔 낮은 전극 솔루션을 변경합니다.
5. 대표 결과
솔루션
- 마우스 망막 재관류 솔루션 : 112.5 MM NaCl, 3.6 MM KCl, 2.4 밀리미터 MgCl 2, 1.2 MM CaCl 2, 10 MM HEPES (산도 7.2), 20 MM NaHCO 3, MM 호박산 NA, 0.5 MM 나 글루 탐 산염, 0.02 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM 포도당합니다. 또한,이 솔루션은 2 밀리미터 L-글루 탐 산염 및 photoresponse 10,11 높은 순서 구성 요소를 차단하는 10 μm의 DL-AP-4와 보충하고, 0.1 % MEM 비타민과 MEM 아미노산 솔루션 (시그마)와 망막을 향상시키기 위해 생존.
- 마우스 전극 용액 : 140 MM NaCl, 3.6 MM KCl, 2.4 밀리미터 MgCl 2, 1.2 MM CaCl 2, 3 MM HEPES (산도 7.4, NaOH). 낮은 ele의 솔루션ctrode 공간도 추가로 시냅스 전달 10을 차단하는 두 MM L-글루 탐 산염을 포함, 10 MM BaCl 2 photoresponse 3,12의 glial 구성 요소를 억제합니다.
- 망막 보육 솔루션 : 272 MG L-15 배지 (시그마) 20 ML 탈이온수 20 밀리그램 BSA를 해산. 결승전 L-15와 BSA의 농도는 각각 13.6 밀리그램 / ML 및 1 밀리그램 / ML입니다. 1 M HCL과 7.4로 산도를 조정합니다.
그림 1. transretinal 에르그 녹음을위한 마우스 망막의 절연을 보여주는 도식 다이어그램.
그림 2. 재관류 챔버와 그 소유자와 기록 전극의 사진. 빨간 화살표 관류 흐름의 방향을 나타냅니다.
그림 3. transretinal 에르그 녹음을위한 실험 설정의 개략도. 빨간 화살표 관류 흐름의 방향을 나타냅니다.
. 그림 4 대표자 결과 : 마우스 막대 중심 transretinal 응답 가족을 기록했다. Photoresponses는 로우 패스는 1 kHz에서에서 디지털, 30 Hz에서 (8 극 베셀)에서 필터링 및 추가 분석을 위해 컴퓨터에 저장되어 있었다. 표시된 트레이스는 포화 광 농도에서 희미한 조명 농도 후 2-3 반응에서 5-6 반응의 평균을 나타냅니다.
그림 5 대표자 결과 :. 마우스 콘 중심 transretinal 응답 기록된 가족. Photoresponses는 로우 패스는 1 kHz에서에서 디지털, 30 Hz에서 (8 극 베셀)에서 필터링 및 추가 분석을 위해 컴퓨터에 저장되어 있었다. 표시된 흔적 averag있다포화 광 농도에서의 희미한 조명 농도와 3-5 반응의 5-10 응답 네;.
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Discussion
막대와 원뿔 중심 transretinal 에르그 녹음의 방법은 야생 유형 및 유전자 변형 동물 모두에서 마우스 photoreceptors의 기능을 조사하는 강력한 도구되고 위에서 설명한. 기본 photoresponse 속성의 쉬운 특성뿐만 아니라,이 간단한 기술은 가까운 - 투 - 그대로 망막의 준비에서 수행 오랫동안 실험을하는 동안 좋은 반응 안정성을 제공합니다. 야생 형 마우스의 어두운 적응로드 최대한의 응답 진폭과 photosensitivity 모두 레코딩의 시작부터 적어도 1 시간 내에 안정이며, 어두운 적응 콘 최대한의 진폭과 photosensitivity는 일반적으로 30-40 분 후 10 % 이상을 거절하지 녹음. 이 기술의 다른 장점은 살아있는 동물의 에르그 기록을 수행하는 데 필요한 자사의 마우스 photoreceptors에서 고전적인 단일 셀 흡입 녹음에 연결할 수 없습니다 쉬운 pharmacological 조작에 복종할 의무, 그리고 마취의 부재입니다ings. / - - Tα의 망막 사용 원추 transretinal 녹음을 위해 8 신호 제거로드와 마우스 선 것은 실질적으로 실험 절차 및 결과의 해석을 모두 용이하게합니다. 이것은 밝은 조명과 /에 노출 후 마우스 콘 시각 색소 재생을 모니터링하거나 안정적인 배경 빛의 존재에 원추 기능을 연구 대상으로 실험에서 특히 중요합니다. 따라서, 새로운 흥미로운 관점은 이제 막대 및 원뿔 관련 시각 장애에 대한 마우스 모델을 포함하여 마우스 막대와 원뿔의 생리적 특성을 조사를 위해 개방된다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
실명을 방지하기 위해 연구에서 경력 개발 상을 지원, NIH 보조금 EY19312 및 EY19543 (VJK)뿐만 아니라 실명과 EY02687을 (워싱턴 대학에서 안과 및 Visual 과학 계열) 방지하기위한 연구에서 제한없이 부여함으로써.
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