Summary
Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.
Abstract
Çubuklar ve koniler: gözdeki görüntü oluşturan fotoreseptör iki ayrı sınıfı vardır. Konileri hızla parlak ışık koşullarında değişen altında sürekli faaliyet ise Çubuklar tek ışık fotonları tespit edebiliyoruz. Fotoreseptörlerin dış segmentlerinde çubuk ve koni-spesifik görsel pigmentleri tarafından ışığın emilimi sonunda plazma zarı ve hücre hiperpolarizasyon üzerinde siklik nükleotid kapılı kanallarının kapanmasına yol açan bir fototransdüksiyon basamaklarını tetikler. Mevcut ve potansiyel membran Bu ışık kaynaklı değişim ya klasik emme elektrot kayıt tekniği 1,2 veya farmakolojik olarak bloke postsinaptik yanıt bileşenleri 3-5 ile izole retina gelen transretinal elektroretinogram kayıtları (ERG) tarafından, bir photoresponse olarak tescil edilebilir. İkinci yöntem fare fotoreseptörlerin gelen ilaç-erişilebilir uzun süreli kayıtlar sağlar ve stabil photoresponses fr elde etmek için özellikle yararlı olduğuom kıt ve hassas fare konileri. Koni durumda, bu tür deneyler karanlık adaptasyonu 6,7 sırasında konik fotosensitivite iyileşme sürecini izlemek üzere, her iki esas olarak bütün görsel pigmenti karanlık açıcılar-adapte koşullar ve aşağıdaki yoğun ışık yapılabilir. Bu videoda, biz karanlığa uyumlu fare retinadan çubuk ve M / L-konik tabanlı transretinal kayıtları nasıl gerçekleştirebileceğimizi gösterecektir. Çubuk kayıtlar vahşi tip (C57BL / 6) farelerin retinanın kullanılarak yürütülecektir. 8 sinyal çubuğu yoksun fareler. Basitlik için, koni kayıtları genetiği değiştirilmiş çubuk transdusin gelen α-alt birimi nakavt - (- / Tα) elde edilecektir
Protocol
1. Elektrotlar yapma
- Cam elektrotlar hazırlayın. 120 mg agar tartılır ve 10 mL distile su (nihai agar konsantrasyonu% 1.2) karıştırın. Sıcak su banyosunda agar çözüm eritin. Plastik şırınga kullanılarak agar solüsyonu: cam kapilerleri (uzunluk = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm ve iç hacmi = 44 uL biz aşağıdaki boyutlara sahip TW100-4 kılcal Kelime Presision Aletleri kullanın) doldurun. 10 dakika oda sıcaklığında agar katılaşmaya. Böylece, en çok 200 ~ kılcal (agar karışımının geri kalanı -4 ° C ve yeniden kullanılabilir birkaç kez de muhafaza edilebilir) doldurulabilir.
- Bir elmas bıçak kullanarak parçaya kılcal kesin.
- 4 ° C'de en az 24 saat için fare elektrot çözüm sonuçlanan cam elektrot Soak 4 ° C'de elektrotlar saklayın ve 3-4 ay boyunca bunları kullanın.
2. Deneme Kurulumu
- Gecede bir fare koyu adapte. (Örneğin, C yabani türü kullanınÇubuk odaklı transretinal kayıtları ve T α için 57Bl / 6) farelerde - / - farelerde yoksun çubuk koni transretinal kayıtları için 8 sinyalizasyon.
- 1 L perfüzyon çözeltisi, 100 mL elektrot çözümü ve 20 ml inkübasyon solüsyonu (aşağıya bakınız) hazırlayın ve perfüzyon çözüm çukur bir Millipore 0.45 mikron veya filtre 0.22 mikron (isteğe bağlı) filtre.
- Retina düzlemine yerleştirilmiş olan bir fotometre kullanılarak ışık kaynağı (505 nm LED veya halojen ampul optik stimülatör) kalibre. LED ışık kaynağının durumunda, ışık homojenlik elde etmek için bir optik difüzör kullanabilir.
- Deneme (hazne inşaatları değişebilir) için perfüzyon odası hazırlayın. Odamızca küçük bir plastik Petri tabağı kapağı yapılmış bir taban ile 3 mm Pleksiglas yapılmış ve ~ aktif bir perfüzyon hacmi 400 uL (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm) sahiptir. 2 BaCl 2 mM L-glutamat ve 10 mM içeren elektrot çözeltisi ile odasının alt elektrot boşluğu doldurmak. Plastik boru ve cam bir kapiler kullanarak, düşük elektrot alanı (oda altına yapıştırılmış plastik boru bağlantısı yapılmış) ve elektrot tutucu çözümü arasında bir bağ kurmak. Elektrot kabarcık bağlayan boru veya elektrot tutucu (gerekirse plastik şırınga kullanarak çözüm temizlemek) olmadığından emin olun.
- Mikroskobun aşamasında (: mikroskop bir anti-vibrasyon masaya monte edilmiş ve mekanik ve elektromanyetik gürültü en aza indirmek için bir Faraday kafesi içinde korumalı olabilir isteğe bağlı) kayıt odasına monte edin. Diferansiyel amplifikatör (örneğin Warner Instruments DP-311 amplifikatör) pozitif headstage direğe alt elektrot tutucu bağlayın. Merkezi ve uyarıcı ışık spot açılması odasının alt elektrot hizalayın. Kayıt odasına perfüzyon hattı bağlayın ve perfüzyon açın.
- % 95 O 2 /% 5 CO 2 ile Kabarcık perfüzyon solüsyonu 40 içinde kuluçkaya ederken ° C water hamamı. CO 2 7,2 üzere çözeltinin pH ayarlar. Çözüm 36-37 onu yeniden ısıtma seramik bir direnç üzerinden geçen yerçekimi ° C ile şişeden kayıt odasına akar Isı kaybını azaltmak için, ısıtıcı ideal mikroskop sahnede, mümkün olduğunca kayıt odasına yakın bir yerde olmalıdır.
- Bir akış regülatörü ile yaklaşık 1 ml / dak akış hızı ayarlayın.
- Ikinci bir elektrot tutucu kullanarak headstage yılının ikinci (negatif) kutuplu Üst elektrodun bağlayın. O-ring kullanan üst elektrot için termokupl probu bağlayın. Elektrot ve termokupl uçları birbirine yakın sıcaklık okuması mümkün olduğunca retinanın merkezine yakın olarak alınır böylece olduğundan emin olun. Perfüzyon çözelti içinde üst elektrot ucu tutulur ve odasının merkezi yerleştirin. Başlangıç stabilizasyonu için 10-15 dakika bekleyin.
- Çözeltisinin sıcaklığı 36 böylece ısıtıcı DC gerilimini ayarlamak -37 ° C.
3. Fare Retina Ayırma
- Loş kırmızı ışık altında, CO 2 ve servikal dislokasyon ile karanlığa uyumlu fare euthanize. İsteğe bağlı: koter kalemi veya ısıtılmış diseksiyon iğne ile sklera en dorsal noktası dağlama her fare küresi üzerinde bir referans işareti yapmak. Tüm sonraki işlemler bir mikroskop için uygun kızılötesi görüntü dönüştürücüler kullanarak kızılötesi ışık altında yapılmaktadır.
- Nazik bir basınç uygulayarak ve her gözün iki tarafındaki deri gerilerek eğri makas ile gözleri parçalara ayır. Microscissors veya jilet kullanarak kızılötesi aydınlatma altında hem gözbebekleri Hemisect.
- Kornea ve lens çıkarın. Mümkün olduğunca vitreus kadar çıkarın.
- Pigment epiteli tabakasından retinanın ilk soyun ve gerekirse, pigment epiteli kalan granülleri çıkarmak için forseps ile iyice temizleyin. Biz genellikle çubuk ve koni transret hem de bütün retinanın kullanıyorsanızİnal kayıtları. Ancak, özellikle retinanın bir referans olarak koter işareti kullanarak bir jilet veya microscissors ile Vizör adaptör ventral kısmı kaldırmak soyma önce, daha M / L-koniler 9 olan fare retinanın dorsal kısmından kaydetmek istiyorsanız.
- İnkübasyon çözeltisi ile, küçük bir Petri tabağına yerleştirin ikinci hemisected küresi ve kullanılana kadar saf oksijen ile doymuş bir ışık geçirmeyen kutusuna hazırlanması inkübe edilir. Tipik olarak, bu şartlar altında ikinci fare Eyecup oda sıcaklığında birkaç saat boyunca saklanabilir ve kayıt için kullanılır.
- Bir cam veya plastik pipet kullanarak bir Petri kabının kapağı perfüzyon bir damla (yaklaşık 300 ul) ile izole retina aktarın. BaCl 2 ile ön inkübe retinaya BaCl 2 elektrot içeren solüsyon 5-6 küçük damla ekleyin. Arka tarafında bir kare parça (yaklaşık 5x5 mm) köşe yağlanmış (Dow Corning 111 vana yağ ve dolgu maddeleri) yerleştirin Millipore filtre kağıdı (0.45 um aynı çözeltisi damla olan merkezinde önceden hazırlanmış deliği (çapı 2-2,5 mm) ile) tipi HArg. Filtre kağıdı (fotoreseptör tarafı) üstüne forseps pozisyon retinanın kullanma ve düz monte onu çevresine kenarlarından basın. Retina filtre kağıdındaki deliğinin üzerine ortalanarak yazılmalıdır.
- Forseps kullanma perfüzyon odasına retina ile filtre kağıdı aktarmak ve uyarıcı spot hizalı alt elektrot alanı üzerinde yerleştirin. Biraz odası ile bağı ona filtre kağıdı yağlanmış kenarları basın.
- Retinanın merkezi (biraz fotoreseptör tabaka dokunmayın) üzerinden Üst elektrodun yerleştirin. Retina üzerine Üst elektrodun Merkezleme sinyal genliği (retina kenarına yakın yerleştirerek kıyasla kadar ~% 20-40) arttırır. Böyle elektrot lokasyonu biraz retina (Yüzölçümünün ~% 12-15) küçük bir sektör ulaşan etkili aydınlatma uyaran yoğunluğu bozan olmasına rağmen, hala elektrik yerleştirme iyi yolbilek düzeyinden. Hazırlanması artık transretinal kayıtlar için hazırdır.
4. Transretinal Kayıtlar
- Farenizi hattı, LED ışık kaynağı ya da optik stimülatör temin kalibre 505 nm parlak ışık yoğunluğuna loş tarafından rekor çubuk veya M / L-koni-sürücülü bir test flaş yanıtları bağlı. Bizim LED ışık kaynağı durumunda, flaş yoğunluğu LED giriş gerilimi, değiştirilebilir dirençler ve nötral yoğunluk filtreleri bir dizi (biz E-Renk Rosco Laboratories # 211 0.9 ND filmi filtreleri kullanmak ve bilgisayarlı kontrol kombinasyonu tarafından kontrol edilir ) LED ve retina arasına yerleştirilir. LED testi flaş (20 ms) süresi, bir bilgisayar tarafından kontrol edilmektedir. Bir halojen ampul optik stimülatörü kullanıyorsanız, test flaş yoğunluğu ve dalga boyu ise nötral yoğunluk filtreleri ve dar bant girişim filtreleri, bir takım kontrol edilebilir. Testi flash süresi bilgisayar kontrollü kepenkler ile kontrol edilebilir.
- İsteğe Bağlı: etkin korunması içinGün boyunca BaCl 2 photoresponse ve glial komponent bastırılması, taze solüsyon ile dolu plastik bir enjektör kullanarak tasfiye ederek (her retinaya test etmeden önce gibi) bazen de alt elektrot çözüm değiştirin.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Çözümler
- Fare retina perfüzyon solüsyonu: 112.5 mM NaCI, 3.6 mM KCI, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCI2, 10 mM HEPES (pH 7.2), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na süksinat, 0.5 mM Na glutamat, 0.02 mM EDTA, ve 10 mM glükoz. Buna ek olarak, çözelti 2 mM L-glutamat ve photoresponse 10,11 arasında yüksek dereceden bileşenlerin blok 10 uM DL-AP-4 ilave edilir, ve% 0.1 MEM vitaminler ve MEM amino asitler çözeltileri (Sigma) ile retina iyileştirmek için canlılığı.
- Fare elektrot solüsyonu: 140 mM NaCI, 3.6 mM KCI, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCI2, 3 mM HEPES (pH 7.4, NaOH). Düşük ele in solüsyonuctrode alanı da ek olarak, sinaptik 10 ve bloke etmek 2 mM L-glutamat içerir, 10 mM 2 BaCl photoresponse 3,12 arasında glial bileşeni bastırmak için.
- Retina inkübasyon çözüm: 272 mg L-15 orta (Sigma) ve 20 ml deiyonize su içinde 20 mg BSA çözülür. Son L-15 ve BSA konsantrasyonları sırasıyla 13.6 mg / mL ve 1 mg / mL, bulunmaktadır. 1 M HCl ile pH 7.4 'e ayarlayın.
Şekil 1. Transretinal ERG kayıtları için fare retinanın izolasyonu gösteren şematik diyagramı.
Şekil 2. Perfüzyon odası ve onların sahipleri ile kayıt elektrotları Fotoğraf. Kırmızı oklar perfüzyon akış yönünü gösterir.
Şekil 3. Transretinal ERG kayıtları için deney düzeneği şematik diyagramı. Kırmızı oklar perfüzyon akış yönünü gösterir.
. Şekil 4 Temsilcisi sonuçları: fare çubuk güdümlü transretinal yanıtları ailesi kaydedildi. Photoresponses low-pass 1 kHz sayısallaştırılmış, 30 Hz (8 kutuplu Bessel) süzülmüş ve detaylı analiz için bir bilgisayarda depolanan vardı. Gösterilen izleri doyurarak ışık şiddetlerinde loş ışık yoğunlukları ve 2-3 tepkiler az 5-6 yanıtları ortalamasını temsil etmektedir.
Şekil 5 Temsilcisi sonuçları:. Fare koni odaklı transretinal yanıtları kayıtlı aile. Photoresponses low-pass 1 kHz sayısallaştırılmış, 30 Hz (8 kutuplu Bessel) süzülmüş ve detaylı analiz için bir bilgisayarda depolanan vardı. Gösterilen izleri averag edilirdoyurarak ışık şiddetlerinde loş ışık yoğunlukları ve 3-5 cevaplara 5-10 tepkilerin es.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çubuk ve koni güdümlü transretinal ERG kayıt yöntemi vahşi tipi ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar hem de fare fotoreseptörlerin fonksiyonlarını araştırmak için güçlü bir araç haline gelmektedir yukarıda anlatılan. Temel photoresponse özelliklerinin kolay karakterizasyonu ek olarak, bu basit bir teknik ile yakın-bozulmadan retina preparatlar üzerinde gerçekleştirilen deneyler, uzun süreli sırasında büyük müdahale stabilite sağlar. Vahşi tip farelerde koyu adapte çubuk maksimal tepkisi genliği ve fotosensitivite Hem kayıtların başlangıcından itibaren en az 1s içinde istikrarlı, ve karanlığa uyumlu koni maksimum genlik ve fotosensitivite tipik olarak 30-40 dakika sonra% 10'dan fazla düşüş yok kayıtları. Bu tekniğin diğer avantajları canlı hayvan ERG kayıt yapmak için gerekli olan fare fotoreseptör klasik tek hücreli emme kayıtlarında erişilemiyor kolay farmakolojik manipülasyonlar amenability ve anestezi yokluğu vardırbulgular. - / - Tα retinaları kullanarak koni transretinal kayıtları için 8 sinyalizasyon ortadan çubuk ile fare hattı büyük ölçüde deneysel prosedür ve sonuçları yorumlamayı kolaylaştırır. Bu parlak bir ışık ve / maruz kaldıktan sonra fare konik görme pigmenti rejenerasyon izleme veya sabit arka plan ışığı varlığında koni fonksiyonu çalışmalarında yönelik deneyler özellikle önemlidir. Böylece, yeni heyecan verici perspektifler şimdi çubuk ve koni ile ilgili görsel bozukluklar için fare modelleri dahil olmak üzere fare çubuk ve koni fizyolojik özelliklerini araştırmak için açıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Körlük Engellenir Research Kariyer Geliştirme Ödülü tarafından desteklenen, NIH hibe EY19312 ve EY19543 (VJK) yanı sıra, Körlük ve EY02687 (Washington Üniversitesi Göz Hastalıkları ve Görsel Bilimleri Bölümü) Engellenir Research tarafından sınırsız ödenekle.
References
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
- Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
