Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses

Summary

We beschrijven een relatief eenvoudige methode van transretinal electroretinogram (ERG) opnamen voor het verkrijgen van staafjes en kegeltjes photoresponses uit intacte muis netvlies. Deze aanpak maakt gebruik van het blok van synaptische transmissie van fotoreceptoren hun lichte reacties te isoleren en hen te registreren met behulp van elektroden veld geplaatst over de geïsoleerde platte gemonteerde netvlies.

Abstract

Er zijn twee verschillende klassen van beeldvormende fotoreceptoren in het netvlies gewervelde: staafjes en kegeltjes. Hengels zijn in staat om enkele fotonen van het licht te detecteren terwijl kegels werken voortdurend onder snel veranderende fel licht. Absorptie van licht door staaf-en kegelvormige specifieke visuele pigmenten in de buitenste segmenten van fotoreceptoren activeert een fototransductie cascade die uiteindelijk leidt tot de sluiting van de cyclische nucleotide-gated kanalen op de plasmamembraan en cel hyperpolarisatie. Dit licht-geïnduceerde verandering in membraan huidige en potentiële kunnen worden geregistreerd als een photoresponse, door een van beide klassieke zuig-elektrode opnametechniek ^1,2 of door transretinal electrogram opnamen (ERG) van geïsoleerde netvlies met farmacologisch geblokkeerd postsynaptische respons componenten ^3-5. Deze laatste methode maakt het mogelijk drugs-toegankelijke langdurige opnames van de muis fotoreceptoren en is vooral handig voor het verkrijgen van een stabiele photoresponses frOM de schaarse en kwetsbare muis kegels. In het geval van kegels, kunnen dergelijke experimenten worden uitgevoerd, zowel in donker aangepaste voorwaarden en volgende intense verlichting die in wezen bleekt alle visuele pigment, om het proces van kegel fotosensibiliteit herstel te volgen tijdens de donkere aanpassing ^6,7. In deze video laten we zien hoe de staaf-en M / L-cone-driven transretinal opnames van donker aangepaste muis netvlies uit te voeren. Stang opnamen worden uitgevoerd met netvlies van wild type (C57BL / 6) muizen. Voor de eenvoud zal conus opnames worden verkregen uit genetisch gemodificeerde staaf transducin α-subunit knockout (Tα ^{- / -)} muizen die stang missen signalering ^8.

Protocol

1. Het maken van elektroden

1. Bereid glas elektroden. Weeg 120 mg agar en meng dit in 10 ml gedestilleerd water (uiteindelijke concentratie van 1,2% agar). Smelt de agar oplossing in heet water bad. Vul het glas haarvaten (we gebruiken Word Presision Instrumenten TW100-4 capillairen met de volgende afmetingen: lengte = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, en de interne volume = 44 pi) met de agar oplossing met behulp van plastic spuit. Verstevigen de agar bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Zo tot ongeveer 200 capillairen worden gevuld (de rest van de agar mengsel kan worden bewaard bij 4 ° C en opnieuw gebruikt meerdere malen).
2. Snijd de haarvaten in twee helften met behulp van een diamant mes.
3. Geniet van de daaruit voortvloeiende glas elektroden in de muis elektrode oplossing ten minste 24 uur bij 4 ° C. Bewaar de elektroden bij 4 ° C en gebruik ze in de periode van 3-4 maanden.

2. Het experiment opzetten

1. 'S nachts donker aan te passen een muis. Gebruik wild type (bijvoorbeeld C57Bl / 6) muizen voor staaf-driven transretinal opnamen en T α ^{- / -} muizen zonder hengel signalering ⁸ voor conus transretinal opnames.
2. Bereid 1 L perfusie-oplossing, 100 ml elektrode oplossing en 20 ml incubatie-oplossing (zie hieronder) en filteren de perfusie oplossing via een Millipore 0,45 pm of 0,22 micrometer filter (optioneel).
3. Kalibreer de lichtbron (505-nm LED of halogeen lamp optische stimulator) met behulp van een fotometer geplaatst op het vlak van het netvlies. Bij LED lichtbron gebruik van een optische diffusor licht uniformiteit.
4. Bereid de perfusie kamer voor experiment (kamer constructies kan variëren). De kamer wordt gemaakt van 3 mm plexiglas, met een bodem uit het deksel van een kunststof petrischaaltje en een actieve perfusie volume van 400 ul ~ (L = 25 mm, b = 8 mm, H ≈ 2 mm). Vul de onderelectrode ruimte van de kamer met elektrode oplossing die 2 mM L-glutamaat en 10 mM BaCl ₂. Behulp plastic buis en een glazen capillair, een verbinding tussen de oplossing onderelectrode ruimte (van kunststof buis connector aan de kamer beneden) en de elektrodehouder. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de elektrode, het aansluiten van slangen, of de elektrode houder (zuiveren de oplossing om met plastic spuit indien nodig).
5. Monteer de opname kamer op het podium van de microscoop (optioneel: de microscoop kan worden gemonteerd op een anti-vibratie tafel en afgeschermd in een kooi van Faraday tegen mechanische en elektromagnetische ruis te minimaliseren). Sluit de onderelectrode houder met de positieve pool headstage van de verschilversterker (bijvoorbeeld Warner Instruments DP-311 versterker). Center en breng de kamer onderste elektrode openen met de stimulus lichte plaats. Sluit de perfusie lijn om de opname kamer en zet de doorbloeding aan.
6. Bubble de perfusie oplossing met 95% O _2/5% CO2 gedurende incubatie in 40 ° C watER bad. CO _{2 wordt} de pH van de oplossing 7,2. De oplossing stroomt uit de fles naar de opname kamer door de zwaartekracht die door een keramische weerstand opwarmen naar 36-37 ° C. Om warmteverlies te beperken, moet de verwarming worden geplaatst zo dicht mogelijk bij de opname kamer mogelijk zijn, idealiter op het podium van de microscoop.
7. Met een debietregelaar aan te passen het debiet tot ongeveer 1 ml / min.
8. Sluit de bovenste elektrode naar de tweede (negatieve) pool van de headstage met een tweede elektrode houder. Binden thermokoppelsonde de bovenste elektrode middel van een O-ring. Zorg dat de elektrode en thermokoppel uiteinden dicht bij elkaar, zodat de temperatuur wordt zo dicht bij het centrum van het netvlies mogelijk. Dompel het uiteinde van de bovenste elektrode in de perfusieoplossing en plaats in het midden van de kamer. Laat 10-15 minuten voor aanvang stabilisatie.
9. Stel de gelijkspanning voor de toestel, zodat de temperatuur van de oplossing 36 -37 ° C.

3. Het isoleren van de muis Retina

1. Onder gedimd rood licht, euthanaseren het donker aangepaste muis met CO ₂ en cervicale dislocatie. Optioneel: maak een merkteken op elke muis oogbol door het verbranden van de meest dorsale punt van de sclera met een cauterisatie pen of verwarmde ontleden pin. Alle volgende procedures worden uitgevoerd onder infrarood licht met behulp van infrarood beeldomzetters fit aan een stereomicroscoop.
2. Ontleden de ogen met gebogen schaar door het toepassen van lichte druk en het uitrekken van de huid aan de zijkanten van elk oog. Hemisect beide oogbollen onder infrarood verlichting met behulp van microscissors of een scheermesje.
3. Verwijder het hoornvlies en de lens. Verwijder zo veel van het glasvocht mogelijk te maken.
4. Peel eerste netvlies van de pigmentepitheel laag en, indien nodig, grondig te reinigen met een tang om resterende pigmentkorrels epitheel verwijderen. Wij meestal met hele retina voor staaf en kegel transretrechtelijke opnamen. Echter, als u wilt specifiek op te nemen van het dorsale deel van de muis netvlies dat er meer M / L-kegeltjes ⁹ heeft, voor het schillen van de retina het ventrale deel van de oogschelp te verwijderen met een scheermesje of microscissors het gebruik van de cauterisatie merk als referentie.
5. Plaats de tweede hemisected oogbol in een klein petrischaaltje met een incubatie-oplossing en incubeer de bereiding in een lichtdichte doos verzadigd met zuivere zuurstof tot gebruik. Typisch, onder deze omstandigheden de tweede muis oogkap worden opgeslagen gedurende enkele uren bij kamertemperatuur en voor opnamen.
6. Een glazen of plastic pipet overdragen geïsoleerde retina een druppel perfusie oplossing (ca. 300 pi) op ​​het deksel van een petrischaal. Voeg 5-6 kleine druppels van de elektrode oplossing die BaCl ₂ tot en met pre-incubeer het netvlies met BaCl _2. Plaats een vierkant stuk (ca. 5x5 mm) van de achterzijde hoek-ingevette (we gebruiken Dow Corning 111 klep smeermiddel en kit) Millipore filter papier (0,45 urn Harg type) met vooraf gemaakte gat in het midden (2-2,5 mm) tot dezelfde oplossing vallen. Met behulp van een tang positie van het netvlies op de top van het filterpapier (fotoreceptor kant naar boven) en druk de randen aan de rand van de vaste mounten. Het netvlies worden gecentreerd boven de opening in het filtreerpapier.
7. Met behulp van een tang overdracht van de filter papier met het netvlies aan de perfusie kamer en plaats deze boven de stimulus spot-lijn lager elektrode ruimte. Licht op de ingevette randen van het filterpapier te binden met de kamer.
8. Plaats de bovenste elektrode op het netvlies centrum (iets aan te raken de fotoreceptor laag). Het centreren van de bovenste elektrode op het netvlies verhoogt de signaalamplitude (tot ongeveer 20-40% in vergelijking tot het plaatsen van het dichter bij de retina rand). Hoewel een dergelijke elektrode locatie verstoort de lichtjes van de effectieve licht stimulusintensiteit het bereiken van een kleine sector van het netvlies (~ 12-15% van de totale gebied), is het nog steeds de optimale manier van het plaatsen van de elektronischevertrad. De voorbereiding is nu klaar voor transretinal opnames.

4. Transretinal Recordings

1. Afhankelijk van uw muis lijn, record staaf of M / L-cone-driven proefflits reacties van zwak om heldere intensiteit van gekalibreerde 505 nm licht voorzien van LED-lichtbron of optische stimulator. In het geval van onze LED-lichtbron, wordt de flitsintensiteit door een combinatie van geautomatiseerde controle van de LED-ingangsspanning, schakelbare weerstanden, en een set van grijsfilters (we gebruiken E-Kleur # 211 0.9 ND film filters van Rosco Laboratories ) geplaatst tussen de LED en het netvlies. De duur van de LED-test flash (20 ms) wordt aangestuurd door een computer. Bij gebruik van een halogeenlamp optische stimulator kan proefflits intensiteit en golflengte worden bestuurd door een reeks grijsfilters smalle band interferentiefilters respectievelijk. Test flash duur kan worden gecontroleerd door computer-gestuurde rolluiken.
2. Optioneel: voor het behoud van een efficiënteonderdrukking van de gliale component van photoresponse met BaCl ₂ de hele dag door, af en toe veranderen de onderste elektrode-oplossing (bijvoorbeeld voor het testen van elke retina) door zuivering met behulp van een plastic injectiespuit gevuld met verse oplossing.

5. Representatieve resultaten

Oplossingen

1. Mouse retina perfusieoplossing: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM _MgCl2, 1,2 mM _CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCO _{3, 3} mM Na succinaat, 0,5 mM Na glutamaat, 0,02 mM EDTA, en 10 mM glucose. Bovendien wordt de oplossing aangevuld met 2 mM L-glutamaat en 10 uM DL-AP-4 hogere orde componenten van de photoresponse ^10,11 blokkeren en met 0,1% MEM vitamines en MEM aminozuren oplossingen (Sigma) netvlies verbeteren levensvatbaarheid.
2. Mouse elektrode oplossing: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM _MgCl2, 1,2 mM _CaCl2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). De oplossing in het onderste elementctrode ook ruimte 2 mM L-glutamaat de synaptische transmissie ¹⁰ en blokkeren biedt bovendien, 10 mM BaCl ₂ onderdrukken gliale component van de photoresponse ^3,12.
3. Retina incubatie: los 272 mg L-15 medium (Sigma) en 20 mg BSA in 20 ml gedeioniseerd water. Final L-15 BSA concentraties 13,6 mg / ml en 1 mg / ml. Pas de pH tot 7,4 met 1 M HCl.

Figuur 1. Schematische weergave van de isolatie van muis netvlies van transretinal ERG opnamen.

Figuur 2. Foto van de perfusie kamer en de opname elektroden met hun houders. Rode pijlen geven de richting van perfusie flow.

Figuur 3. Schematische weergave van de experimentele opstelling voor transretinal ERG opnames. Rode pijlen geven de richting van perfusie flow.

. Figuur 4 vertegenwoordiger resultaten: opgenomen familie van muis staaf-driven transretinal reacties. Photoresponses waren low-pass gefilterd bij 30 Hz (8-polige Bessel), gedigitaliseerd bij 1 kHz en opgeslagen op een computer voor verdere analyse. Getoond sporen geven een gemiddelde van 5-6 reacties op weinig licht intensiteiten en 2-3 reacties op verzadigen lichtintensiteiten.

Figuur 5 vertegenwoordiger resultaten:. Opgenomen familie van muis kegel-driven transretinal reacties. Photoresponses waren low-pass gefilterd bij 30 Hz (8-polige Bessel), gedigitaliseerd bij 1 kHz en opgeslagen op een computer voor verdere analyse. Getoond sporen zijn gemiddelde tees van 5-10 reacties op weinig licht intensiteiten en 3-5 reacties op verzadigen lichtintensiteiten.

Discussion

De methode van staaf-en kegelvormige gedreven transretinal ERG opnames hierboven beschreven wordt een krachtig instrument voor het onderzoeken van de functie van de muis fotoreceptoren in zowel wild-type en genetisch gemodificeerde dieren. Naast de gemakkelijke karakterisering van elementaire photoresponse eigenschappen deze eenvoudige techniek biedt grote respons stabiliteit tijdens langdurige experimenten uitgevoerd op nagenoeg in intacte retina preparaten. Zowel donker aangepaste hengel maximale respons amplitude en lichtgevoeligheid in wild-type muizen zijn stabiel binnen minimaal 1 uur van het begin van de opnames, en de donker aangepaste conus maximale amplitude en lichtgevoeligheid meestal niet meer dan 10% niet dalen na 30-40 min. van opnamen. Andere voordelen van deze techniek zijn de ontvankelijkheid voor eenvoudige farmacologische manipulaties die niet bereikbaar is in de klassieke single-cell zuig opnames van de muis fotoreceptoren, en de afwezigheid van de anesthesie, die nodig zijn voor het uitvoeren van levende dieren ERG opnamemingen. Met behulp van het netvlies van Tα ^{- / -} muis lijn met geëlimineerd staaf signalering ⁸ voor conus transretinal opnames aanzienlijk vergemakkelijkt zowel de experimentele procedures en de interpretatie van de resultaten. Dit is vooral belangrijk bij experimenten gericht op het controleren muis kegel visuele pigment regeneratie na blootstelling aan licht belichting en / of bestuderen conus functie in aanwezigheid van vaste achtergrondlicht. Zo worden nieuwe, spannende perspectieven openen nu voor het onderzoeken van de fysiologische eigenschappen van de muis staafjes en kegeltjes met muismodellen voor hengel-en kegel-gerelateerde visuele stoornissen.