Summary
Nós descrevemos um método relativamente simples de transretinal eletrorretinograma (ERG) para a obtenção de gravações photoresponses haste e cone da retina do rato intacto. Esta abordagem tira vantagem do bloco de transmissão sináptica de fotorreceptores para isolar as suas respostas de luz e gravar os usando eléctrodos de campo colocados através da retina plana montado isolado.
Abstract
Existem duas classes distintas de imagem formadoras de fotorreceptores na retina de vertebrados: bastonetes e cones. Rods são capazes de detectar fótons individuais de luz, enquanto cones operar continuamente sob rápidas mudanças das condições de luz brilhante. A absorção de luz pela vara e cone específicos pigmentos visuais nos segmentos exteriores de fotorreceptores desencadeia uma cascata de fototransdução que conduz eventualmente a encerramento de nucleótidos cíclicos-gated canais na membrana plasmática e hiperpolarização da célula. Esta mudança induzida pela luz em corrente e potencial de membrana pode ser registrado como um photoresponse, por qualquer de sucção 1,2 eletrodo clássica técnica de gravação ou por gravações eletrorretinograma transretinal (ERG) de retinas isoladas com farmacologicamente bloqueados componentes da resposta pós-sinápticos 3-5. O último método permite a droga acessíveis de longa duração gravações de fotorreceptores do rato e é particularmente útil para a obtenção de photoresponses estáveis from os cones do mouse escassos e frágeis. No caso de cones, tais experimentos podem ser realizados tanto em condições de adaptação ao escuro e iluminação intensa seguinte que branqueia essencialmente todo o pigmento visual, para acompanhar o processo de recuperação fotossensibilidade cone durante a adaptação ao escuro 6,7. Neste vídeo, vamos mostrar como realizar vara e M / L-cone-driven gravações transretinal de escuro-adaptado retina mouse. Gravações haste irá ser efectuada utilizando retina do tipo selvagem (C57BL / 6) ratinhos. Por simplicidade, as gravações de cone será obtida a partir geneticamente modificado haste transducina α subunidade knockout (Tα - / -) ratinhos que carecem de haste de sinalização 8.
Protocol
1. Fazendo Eletrodos
- Prepare-se eletrodos de vidro. Pesar 120 mg de agar e misturá-lo em 10 mL de água destilada (concentração final de ágar 1,2%). Derreta a solução ágar-ágar em banho de água quente. Encha capilares de vidro (usamos Instruments Presision palavra TW100-4 capilares com as seguintes dimensões: comprimento = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, eo volume interno = uL 44) com a solução de agar usando uma seringa de plástico. Solidificar o ágar, à temperatura ambiente durante 10 min. Assim, até ~ 200 capilares podem ser preenchidos (o resto da mistura de ágar pode ser armazenada a -4 ° C e re-usados várias vezes).
- Cortar os capilares em metades, utilizando uma faca de diamante.
- Embeber os eléctrodos de vidro resultantes em solução eléctrodo rato durante pelo menos 24 horas a 4 ° C. Armazenar os eléctrodos a 4 ° C e utilizá-los ao longo do período de 3-4 meses.
2. Configurando o Experimento
- Dark-se adaptar um mouse durante a noite. Use tipo selvagem (por exemplo, C57Bl / 6) ratos para vara-driven gravações transretinal e alfa T - / - ratos haste falta de sinalização 8 para gravações de cone transretinal.
- Preparar uma solução de perfusão L, 100 mL solução eléctrodo, e 20 mL solução de incubação (ver abaixo) e filtrar a solução de perfusão através de um Millipore de 0,45 ou 0,22 mM de filtro (opcional).
- Calibrar a fonte de luz (505 nm LED ou estimulador de halogénio lâmpada óptico), utilizando um fotómetro colocado no plano da retina. No caso da fonte de luz de LED, usar um difusor óptico para alcançar a uniformidade da luz.
- Prepare a câmara de perfusão para a experiência (construções de câmara pode variar). A nossa câmara é feita de 3 Plexiglas mm, com uma parte inferior feita a partir da tampa de uma placa de Petri de plástico pequeno, e tem um volume de perfusão activa de ~ 400 uL (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm). Encher o espaço eléctrodo inferior da câmara de eléctrodo com uma solução contendo 2 mM de L-glutamato e 10 mM de BaCl 2. Usando tubos de plástico e um capilar de vidro, fazer uma ligação entre a solução no espaço inferior do eléctrodo (feita de ligador de tubagem de plástico ligado à parte inferior da câmara) e do suporte de eléctrodo. Certifique-se que não há bolhas no eletrodo, o tubo de ligação, ou o titular do eletrodo (purgar a solução com seringa de plástico, se necessário).
- Montar a câmara de gravação sobre a fase do microscópio (opcional: o microscópio pode ser montado sobre uma mesa de anti-vibração e blindado dentro de uma gaiola de Faraday para minimizar o ruído mecânica e electromagnética). Ligue o suporte inferior do eléctrodo para o pólo headstage positivo do amplificador diferencial (por exemplo, Warner Instruments amplificador DP-311). Centro e alinhar o eletrodo câmara inferior de abertura com o ponto de luz de estímulo. Ligue a linha de perfusão para a câmara de gravação e transformar a perfusão no.
- Solução de bolha a perfusão com 95% O2 / 5% CO 2, enquanto incubando-lo em 40 ° C watbanho de er. CO 2 ajusta o pH da solução para 7,2. A solução flui a partir do frasco para a câmara de gravação por gravidade passando através de uma resistência de cerâmica de reaquecimento para 36-37 ° C. Para reduzir a perda de calor, o aquecedor deve estar localizado mais próximo da câmara de registo quanto possível, preferencialmente na fase do microscópio.
- Com um regulador de fluxo ajustar a taxa de fluxo de até cerca de 1 mL / min.
- Ligue o eléctrodo superior ao pólo (negativo) do segundo headstage usando um suporte de eléctrodo segundo. Se ligam a sonda do termopar ao eléctrodo superior usando um O-ring. Assegure-se que as pontas de eléctrodos e termopar estão juntos de modo a que a leitura da temperatura é tomado como perto do centro da retina quanto possível. Mergulha-se o ponta do eléctrodo superior na solução de perfusão e coloque-o no centro da câmara. Permitir 10-15 min para a estabilização de linha de base.
- Ajustar a tensão de CC para o aquecedor de modo que a temperatura da solução é de 36 -37 ° C.
3. Isolando a retina do rato
- Sob a luz vermelha ofuscante, a eutanásia o mouse de adaptação ao escuro com CO 2 e deslocamento cervical. Opcional: fazer uma marca de referência em cada olho do rato por cauterização do ponto mais dorsal da esclera com uma caneta de bisturi ou pino dissecando aquecida. Todos os procedimentos subsequentes são realizados sob a luz infravermelha utilizando conversores de imagem de infravermelhos ajustado a um microscópio de dissecação.
- Dissecar os olhos com tesouras curvas através da aplicação de uma ligeira pressão e esticar a pele sobre os lados de cada olho. Hemisect ambos os globos oculares sob iluminação infravermelha usando microtesoura ou uma lâmina de barbear.
- Remover o córnea e do cristalino. Remover o máximo do vítreo quanto possível.
- Peel a retina primeiro a partir da camada de epitélio pigmentar e, se necessário, limpar cuidadosamente com uma pinça para remover os grânulos permanência do epitélio do pigmento. Estamos tipicamente usando retina todo para ambos haste e transret conegravações Inal. No entanto, se você deseja gravar especificamente da parte dorsal da retina do rato que tem mais M / L de cones 9, antes de descascar a retina remover a parte ventral da ocular com uma lâmina de barbear ou microtesoura usando a marca de cauterização como uma referência.
- Coloque o globo ocular segundo hemisected numa placa de Petri com solução de incubação pequeno e incubar a preparação de uma caixa à prova de luz saturado com oxigénio puro até à utilização. Tipicamente, nestas condições a ocular do rato segundo pode ser armazenada durante várias horas à temperatura ambiente e utilizada para gravações.
- Usando uma pipeta de vidro ou de plástico transferir a retina isolado para uma gota de solução de perfusão (300 uL ca.) sobre a tampa de uma placa de Petri. Adicionar 5-6 pequenas gotas de solução de eléctrodo contendo BaCl 2 a pré-incubar o retina com BaCl 2. Coloque um pedaço quadrado (mm 5x5 ca.) do lado do canto-untada (usamos Dow Corning lubrificante válvula 111 e selante) papel de filtro Millipore (0,45 mm Harg tipo) com pré-fabricados furo no seu centro (2-2,5 mm de diâmetro) para a gota mesma solução. Usando posição pinça da retina no topo do papel de filtro (fotoreceptor lado para cima) e pressionar os seus bordos na periferia à secção plana-montá-lo. A retina deve ser centrado sobre a abertura no papel de filtro.
- Utilizando uma pinça transferir o papel de filtro com a retina para a câmara de perfusão e colocá-lo acima do estímulo spot-alinhados espaço eléctrodo inferior. Ligeiramente pressionar as bordas untadas do papel de filtro para ligação com a câmara.
- Coloque o eletrodo superior sobre o centro da retina (ligeiramente tocar na camada dos fotorreceptores). Centrando o eléctrodo superior sobre a retina aumenta a amplitude do sinal (até 20-40% ~, em comparação com colocando-o mais perto da borda da retina). Embora a localização do eletrodo como distorce um pouco a intensidade do estímulo eficaz luz que atinge um pequeno setor da retina (~ 12-15% de sua área total), ainda é a melhor maneira de colocar a elecatropelou. A preparação está agora pronto para gravações transretinal.
4. Gravações Transretinal
- Dependendo da sua linha de mouse, registro haste ou M / L-cone-driven respostas flash de teste de fraca a intensidade de luz brilhante nm calibrado 505 fornecidos a partir de fonte de luz LED ou estimulador óptico. No caso de a nossa fonte de luz de LED, a intensidade do flash é controlada por uma combinação de controlo computadorizado de tensão de entrada de LED, resistores comutáveis, e um conjunto de filtros de densidade neutra (usamos E Cor-# 211 0,9 filtros ND película de Rosco Laboratories ), colocada entre o LED ea retina. A duração do teste LED de flash (20 ms) é controlado por um computador. Se usando uma lâmpada de halogéneo de estimulador óptico, teste de intensidade de flash e comprimento de onda pode ser controlada por um conjunto de filtros de densidade neutra e filtros de interferência de banda estreita, respectivamente. Teste de duração do flash pode ser controlado por computador orientadas persianas.
- Opcional: para a manutenção eficientesupressão do componente glial de photoresponse com BaCl 2 ao longo do dia, mudar a solução eléctrodo inferior, ocasionalmente (por exemplo, antes do ensaio, cada retina) pela purga-lo usando uma seringa de plástico cheio com solução fresca.
5. Os resultados representativos
Soluções
- Rato solução de perfusão retina: 112,5 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM de MgCl2, 1,2 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCO3, 3 mM Na succinato, 0,5 mM de glutamato, de Na 0,02 mM de EDTA, e 10 mM de glucose. Além disso, a solução é suplementado com 2 mM de L-glutamato e 10 uM de DL-AP-4 para bloquear os componentes de ordem superior do photoresponse 10,11, e com 0,1% de vitaminas MEM e soluções de MEM de aminoácidos (Sigma) para melhorar a retina viabilidade.
- Solução rato eléctrodo: 140 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM de MgCl2, 1,2 mM de CaCl2, 3 mM de HEPES (pH 7,4, NaOH). A solução na parte inferior do elementoctrode espaço também contém 2 mM de L-glutamato de bloquear a transmissão sináptica 10 e, além disso, 10 mM de BaCl 2 para suprimir o componente glial do photoresponse 3,12.
- Solução de incubação retina: dissolver 272 mg de L-15 médio (Sigma) e 20 mg de BSA em 20 mL de água desionizada. Final L-15 e as concentrações de BSA são 13,6 mg / mL e 1 mg / mL, respectivamente. Ajustar o pH para 7,4 com 1 M de HCl.
Figura 1. Diagrama esquemático, mostrando o isolamento de retina do rato para gravações transretinal ERG.
Figura 2. Fotografia da câmara de perfusão e eletrodos de registro com seus titulares. As setas vermelhas indicam a direção do fluxo de perfusão.
Figura 3. Diagrama esquemático da montagem experimental para as gravações transretinal ERG. As setas vermelhas indicam a direção do fluxo de perfusão.
Os resultados representativos Figura 4:. Gravado família de rato haste-driven respostas transretinal. Photoresponses foram filtrada passa-baixa de 30 Hz (8-pólo Bessel), digitalizados em 1 kHz e armazenadas em um computador para análise posterior. Traços apresentados representam médias de 5-6 respostas em intensidades de luz ténue e 2-3 respostas a intensidades luminosas saturantes.
Figura 5: Os resultados representativos. Família gravada do rato-driven cone respostas transretinal. Photoresponses foram filtrada passa-baixa de 30 Hz (8-pólo Bessel), digitalizados em 1 kHz e armazenadas em um computador para análise posterior. Traços são mostrados averages de respostas 5-10 em intensidades de luz ténue e 3-5 respostas a intensidades luminosas saturantes.
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Discussion
O método de vara e cone-driven gravações transretinal ERG descrito acima está se tornando uma poderosa ferramenta para investigar a função dos fotorreceptores do mouse tanto no tipo selvagem e animais geneticamente modificados. Além disso para a caracterização das propriedades de fácil photoresponse básicos, esta técnica simples fornece estabilidade grande resposta de longa duração, durante experimentos realizados em preparações próxima do intactas da retina. Ambos de adaptação ao escuro haste amplitude de resposta máxima e fotossensibilidade em ratinhos de tipo selvagem são estáveis dentro de, pelo menos, 1H partir do início da gravação, ea amplitude de cone de adaptação ao escuro máxima e fotossensibilidade tipicamente não diminuir mais de 10% após 30-40 min de gravações. Outras vantagens desta técnica são a sua receptividade ao simples manipulações farmacológicas que está inacessível no clássicas gravações de uma única célula de sucção de fotorreceptores de rato, ea ausência de anestesia, necessário para a realização de animais vivos registro ERGedifícios. Usando retinas de Tα - / - linha de mouse com vara eliminada sinalização 8 para gravações de cone transretinal substancialmente facilita ambos os procedimentos experimentais e interpretação dos resultados. Isto é particularmente importante em experiências destinadas a controlar rato cone regeneração pigmento visual após a exposição a iluminação brilhante e / ou estudar a função de cone, na presença de luz de fundo estacionário. Assim, novas perspectivas excitantes agora estão abrindo para investigar as propriedades fisiológicas das varas do mouse e cones, incluindo modelos de mouse para haste e cone relacionados com distúrbios visuais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Apoiado pelo Prémio Carreira de Desenvolvimento de Pesquisa para a Prevenção da Cegueira, NIH concede EY19312 e EY19543 (VJK), bem como pela concessão irrestrita de Pesquisa para a Prevenção da Cegueira e EY02687 (Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da Universidade de Washington).
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