Die Messung der cytosolischen Ca ^{2 +} In Isolated Kontraktile Lymphgefäße

Summary

Wir stellen eine Annäherung an die cytosolische Ca bewerten

Abstract

Lymphgefäße aus einem multifunktionalen Transport-System, das Flüssigkeitshomöostase unterhält, liefert Lipide zu den zentralen Kreislauf und wirkt wie ein Überwachungssystem für potenziell schädliche Antigene, die Optimierung der Schleimhaut-Immunität und adaptive Immunantworten ^1. Lymphe ist in der interstitiellen Flüssigkeit, die blind endenden initialen Lymphgefäße eintritt, und dann gegen einen Druckgradienten in größeren Sammlung Lymphgefäße transportiert gebildet. Jeder sammelt lymphatischen besteht aus einer Reihe von Segmenten bezeichnet Lymphangiome gemacht, getrennt durch bicuspid Ventile Rückfluss zu verhindern. Jeder Lymphangione besitzt einen kontraktilen Zyklus, der Lymphe gegen ein Druckgefälle in Richtung der zentralen Kreislauf ² antreibt. Diese phasischen kontraktilen Muster ist analog zu den Herzzyklus mit systolischen und diastolischen Phasen, und mit einem geringeren Rückgang Frequenz ^4. Darüber hinaus generiert lymphatische Tonus der glatten Muskulatur und zeigt myogene Verengung und Erweiterung in Reaktion auf Zu-und Abnahmen in luminalen Druck bzw. ^5. Ein Hybrid aus molekularen Mechanismen, die sowohl die phasischen und tonischen Kontraktilität Lymphgefäße Unterstützung sind daher vorgeschlagen.

Kontraktion der glatten Muskulatur in der Regel durch die cytosolische Ca ^{2 +-Konzentration} reguliert ([Ca ^{2 +]} _i) plus Sensibilität für Ca ^{2 +,} der kontraktilen Elemente in Reaktion auf Veränderungen in der Umgebung der Zelle ^6. [Ca ^{2 +]} _i wird durch die Kombination der Bewegung der Ca ^{2 +} durch Plasmamembran Liganden oder spannungsgesteuerten Ca ^{2 +-Kanäle} und die Freisetzung und Aufnahme von Ca ^{2 +} aus dem internen Speicher bestimmt. Cytosolischen Ca ^{2 +} bindet an Calmodulin und aktiviert Enzyme wie Myosin Light Chain (MLC)-Kinase (MLCK), die wiederum phosphoryliert MLC führt zu Aktin-Myosin-vermittelte Kontraktion ^8. Allerdings ist die Sensitivität dieses Weges zu Ca 9 geregelt werden. MLCP Aktivität wird durch Rho-Kinase (ROCK) und der Myosin-Phosphatase-Inhibitors Protein CPI-17 geregelt.

Hier stellen wir eine Methode, um Veränderungen in auszuwerten [Ca ^{2 +]} _i im Laufe der Zeit in isolierten, perfundierten Lymphbahnen um Ca ^{2 +-abhängige} und Ca ^{2 +-sensibilisierende} Mechanismen des lymphatischen Kontraktion der glatten Muskulatur zu studieren. Die Verwendung von isolierten Ratten mesenterialen sammeln Lymphbahnen wir untersucht stretch-induzierten Veränderungen in [Ca ^{2 +]} _i und kontraktile Aktivität. Die isolierten Lymph-Modell bietet den Vorteil, dass Druck, Durchfluss, und die chemische Zusammensetzung der Badlösung eng kontrolliert werden kann. [Ca ^{2 +]} _i wurde durch das Laden Lymphgefäße mit dem ratiometrisch, Ca ^{2 +-bindenden} Farbstoff Fura-2 bestimmt. Diese Studien werden einen neuen Ansatz für die breitere Problem der Untersuchung der verschiedenen molekularen Mechanismen, die phasischen regulieren bietenKontraktionen im Vergleich Tonic Verengung in lymphatischen glatten Muskulatur.

Protocol

1. Animals

1. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss am Louisiana State University Health Sciences Center genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institute of Health (NIH Publikation Nr. 85-12, revised 1996) durchgeführt. Männliche Sprague-Dawley Ratten (Charles River Laboratories, 270-350 g Körpergewicht wt) wurden in einer kontrollierten Temperatur (22 ° C) und kontrollierte Ausleuchtung (12:12 h Licht-Dunkel-Zyklus) Umgebung untergebracht. Nach der Ankunft wurden die Ratten zu einer einwöchigen Eingewöhnungszeit eingereicht und wurden zur Verfügung gestellt Standard Rattenfutter (2018 Teklad Globale 18% Protein Nagerfutter, Harlan) und Wasser ad libitum.

2. Experiment Set-Up

1. Glasmikropipetten für die Montage Lymphgefäße sind aus Borosilikatglas mit Filament OD 1,2 mm, 0,69 mm ID (Sutter Instrument BF 120-69-15) hergestellt. Ziehen Sie die Pipetten mit einem Flaming / Brown Micropipette Puller Modell P-97 (Sutter Instrument) und Fase mit einem Micro Grinder EG 400 (Narishige), um eine abgeschrägte Spitze mit einem ~ 60 pm Außendurchmesser zu erhalten.
2. Montieren Sie die Mikropipetten in den isolierten Behälter Kammer (Modell CH-1, Living Systems, Burlington, VT). Die Pipetten sollten Widerstand abgestimmt (gleiche Größe Öffnung) werden.
3. Füllen Sie die Kammer (5 mL) und Mikropipetten mit Albumin-physiologischer Kochsalzlösung (APSS, siehe Tabelle 1). Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen in der Mikropipetten oder den Schlauch.
4. Bereiten overhand Knoten mit ophthalmologischen Nähten und Platz auf jeder Mikropipette.

3. Sammeln Lymphatische Isolation

1. Anesthetize die Tiere mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin / Xylazin (90 und 9 mg / kg), mit einem BD Spritze (1 ml) und Nadel (BD intradermal Fase 26G3 / 8).
2. Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Alkohol zu sterilisieren, führen Sie eine Mittellinie Laparotomie und exteriorisieren und Verbrauchsteuern im Dünndarm und Mesenterium. Legen Sie das Gewebe in icE-kalten APSS. Euthanize die Tiere mit einer Überdosis Ketamin / Xylazin und bestätigen den Tod durch das Öffnen der Brust (per American Veterinary Medical Association Richtlinien zur Sterbehilfe).
3. Pin einen Abschnitt von Mesenterium in einer Sektion Kammer mit eiskaltem APSS gefüllt. Sorgfältig sezieren einen Sammelbehälter Lymphgefäßsystem (80-200 um Innendurchmesser und 1-2 mm Länge) aus den umliegenden Fett-und Bindegewebe mit Hilfe von einem Stereomikroskop. Verwenden Sie sezieren Dumont Pinzetten-INOX 55 (Fein Science Tools # 11255-20) und seziert Frühjahr Schere (Fine Science Tools # 15000-03). Verwenden Sie isolierte Behälter mit nur einem Ventil, um eine optimale Druckregelung in das gesamte Segment während des Experiments zu gewährleisten.
4. Übertragen Sie die isolierten lymphatischen der isolierten Gefäß Kammer mit 5 ml des APSS. Montieren Sie das Schiff auf die beiden Widerstands-abgestimmt Glasmikropipetten durch das Binden mit der ophthalmologischen Nähten.
5. Übertragen Sie die Kammer auf einen invertierten Fluoreszenzmikroskop (unsere ist eine Nikauf TE-2000U) mit einer Xenon-Lampe (Sutter Instruments Lambda LS2 300 W), 340/380 Filterrad-System (Sutter Lambda 10-3 mit Chroma Technology 340 und 380 nm Anregungs-Filter), 510 nm dichroitischen Emitter (Chroma Technology D510 ausgestattet / 80m), eine empfindliche CCD-Kamera (Photometrics HQ ^2), und Software für den Erwerb (Nikon Elements AR) (Abbildung 1).
6. Befestigen Sie den Schlauch aus der Mikropipetten entweder einstellbar Stauseen oder die Servo-Feedback-Pumpensystem (Living Systems Instrumentation, Burlington VT), die beide, mit dem Druck und Durchfluss verändert werden kann.
7. Schließen Sie die Kammer auf die Heizung (Living Systems) und stellen Sie das Bad auf 37 ° C.
8. Sehen Sie sich die lymphatischen direkt durch das Deckglas in der Basis der Kammer mit einem 10X-Objektiv (Nikon Plan Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0,17, WD 16,0). Schnelle Zeitraffer-image-Sets können aufgenommen mit der Bildaufnahme-Software (unser System hat Nikon Elements AR-Software) werden.

2 +] _i

1. [Ca ^{2 +]} i in der isolierten lymphatischen glatten Muskulatur wird durch die Ca ^{2 +-Sensing-Farbstoff} Fura 2-Acetoxymethylester (AM) (Molecular Probes, Eugene, OR) gemessen.
2. Laden Sie das Lymphgefäßsystem mit Fura-2 AM durch den Austausch des Bades auf Lösung mit Fura-2 AM (2 uM) und Pluronsäure (0,2% wt / vol) für 30 Minuten bei 37 ° C. APSS
3. Nach 30 Minuten wechseln die Wanne zurück zur Lösung APSS. Spülen Sie 2 Mal zum Auswaschen der Fura-2 aus der Badlösung. Lassen Sie das Gefäß für ein Gleichgewicht von mindestens 20 min vor [Ca ^{2 +]} _i-Messungen zu ermöglichen Wiederherstellung der spontanen Kontraktionen.
4. Sammeln ratiometrische Fura-2-Messungen in isolierten Lymphgefäße mit einer Übernahme-Protokoll, das alternativ leuchtet bei 340 und 380 nm Wellenlänge für eine Dauer von 50 ms je. Das fluoreszierende Licht durch einen dichroitischen Spiegel (400 nm; Chroma Technik Corp 400DCLP) und ein breites Band Emissionsfilter (510 nm, 80 nm Bandbreite, Chroma Technology Corp D510/80m) und wird durch die Photometrics HQ ^2-Kamera erworben. Wir sammeln 2 Minuten von Daten auf eine Grundlinie intraluminalen Druck von 2 cm H ₂ O und während des Schrittes steigt von +2, +4, +6, +8 und +10 cm H ₂ O.
5. Zur Analyse der durchschnittlichen [Ca ^{2 +]} _i, zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI), dass die gesamte Lymphgefäßsystem und Umgebung, so dass das Schiff voll ist während der Entspannung und Kontraktion (Abbildung 2) verfolgt umfasst. Wenn eine Mikropipette in das Blickfeld dieser Bereiche sollten nicht in den ROI eingeschlossen werden. Kleinere ROIs können auch gewählt werden, aber ein potenzielles Problem mit kleinen ROIs ist, dass die Gefäßwände geringfügig verschieben in Längsrichtung aus der ROI als das Schiff verengt und entspannt. Ein weiteres mögliches Problem ist, dass einige Schiffe während der Kontraktion drehen, und diese Lymphbahnen sollten nicht für das Studium verwendet werden. The Drehbewegungen sind in der Regel durch eine Begrenzung der Länge der isolierten lymphatischen bis <1 mm vermieden. Darüber hinaus, manchmal Segmente auf beiden Seiten ein Ventil nicht einengen / Entspannung im Gleichtakt. In diesem Fall, weil diese Segmente getrennte Funktionseinheiten Lymphangiome stellen, sollte das Lymphsystem nur auf einer Seite des Ventils untersucht werden, oder jede Lymphangione können separat mit einem ROI auf beiden Seiten platziert untersucht werden. Bei Verwendung eines 10X-Objektiv, sollte die Gefäßwände im Fokus während phasische Kontraktionen bleiben, aber wenn es irgendwelche Teile der Wände, die gehen Schwerpunkt während der Wehen, diese Bereiche nicht in die ROI einbezogen werden. Ein Hintergrund ROI wird auch verwendet, und sollte weit aus dem Behälter (z. B. in der Ecke des Bildes) platziert werden. Eine Erhöhung der 340/380 Ratio zeigt eine Zunahme der [Ca ^{2 +]} _i. Luminal Durchmesser zu verschiedenen Zeitpunkten kann auch unter Verwendung der Software zu messen Funktion oder durch die Verfolgung der Gefäßwände im Laufe der Zeit werden (siehe Abschnitt 6). </ Li>

5. Pressure Control Protocol

1. Zur Untersuchung Druck unabhängig von der verhängten fließen kann, muss der gleiche Druck auf jeden Mikropipette durch den servo-null Feedback Pumpe eingesetzt werden. Der Schlauch von jedem Mikropipette wird über einen T-Stecker an gemeinsamen Schlauch an der Pumpe montiert ist. Stellen Sie anfangs den intraluminalen Druck bei 2 cm H ₂ O für 45-60 min., Das ist genug Zeit, um die Entwicklung des lymphatischen spontane Kontraktionen zu ermöglichen.
2. Für Studie nur Schiffe verwendet, die folgende Kriterien im Gleichgewicht zu decken: (1) das Schiff entwickelt spontanen Ton bei 2 cm H ₂ O, (2) das Schiff entwickelt regelmäßige, spontane Kontraktionen, die weitgehend einheitlicher sind über die Länge des Schiffes . Oft ist der Bereich hinter einem Ventil verengt mehr als der Rest des Schiffes, und diese Schiffe werden, solange gibt es Hinweise, dass der Rest des Schiffes kontraktile Aktivität Displays eingesetzt werden.
3. Notieren Sie sich die schnelle Zeitraffer-Bilder während der Druck Verfahren. Für jeden, wird der Druck auf 2 cm H ₂ O für 30 s zu starten, und dann wird in einem Schritt um +2 erhöht, +4, +6, +8 oder +10 cm H ₂ O für eine Minute, und senkte zurück bis 2 cm H ₂ O für 30 s.
4. Nach Abschluss der Druckstufe Serie, ändern Sie die Badlösung bis zu einem Ca ^{2 +-freien} APSS bei 37 ° C, die maximale passive Durchmesser (Max D) und Ca ^{2 +-Fluoreszenz-Messungen} an jedem der oben luminalen Druck zu messen. Das Max-D wird verwendet, um Ton zu berechnen und zu normalisieren Daten zwischen Lymphbahnen in verschiedenen Größen.

6. Lymphatische Kontraktile Parameter

1. Änderungen in Gefäßdurchmesser im Laufe der Zeit kann mittels Objekt-Tracking-Tools in den meisten Bild-Analyse-Software-Paketen werden. Dies kann durch Verwendung von nur einer der Kanäle (wir benutzen das 340 nm-Kanal, aber die 380-Kanal könnte auch verwendet werden) erreicht werden. Ein Kontrast Schwelle appgelogen, um das Bild Stack, so dass die Gefäßwände hervorgehoben sind, und dann ROIs umfasst jede Wand gezogen werden, um sie über die Zeit verfolgen (Abb. 3 A). Der Innendurchmesser kann durch Messung der Schwerpunkt jeder Wand und die Berechnung der Entfernung zwischen den beiden Schwerpunkten bestimmt werden, abzüglich der Hälfte der Dicke jeder Wand.
   Eine zweite Option, wenn es schwierig ist, jede Wand durch ein starkes Signal in der luminalen Bereich Track ist zu Außendurchmesser zu messen und mit einem Korrekturfaktor auf eine statische Messung der Gefäßwände zu Innendurchmesser erhalten basiert. In diesem Fall erstreckt sich über den ROI des gesamten Schiffes und der Außendurchmesser verfolgt wird (Abbildung 3 B). Diese Methode kann auch verwendet werden, um den gesamten sichtbaren Querschnitt des lymphatischen (Abbildung 3 C) zu bestimmen. Wegen der typischen Form eines Lymphangione, kann diese letztere Option eine bessere Schätzung der tatsächlichen Volumen der Flüssigkeit, mit jeder Kontraktion als mit einem Durchmesser in einem ausgewählten Teil gepumptdes Schiffes.
2. Von der Zeitraffer-Studie die folgenden Parameter bestimmen lymphatischen Lumendurchmessers Messungen ^4,12,13:
   Kontraktion Frequenz (CF), durch Zählen der Anzahl der phasischen Kontraktionen pro Minute bestimmt.
   Enddiastolischen Durchmesser (EDD), dessen Durchmesser gerade vor einer phasischen Kontraktion ist.
   Endsystolischen Durchmesser (ESD), der Durchmesser am Ende eines phasischen Kontraktion.
   Amplitude der Kontraktion (AMP = EDD-ESD), eine vereinfachte Übersicht des Schlagvolumens.
   Die maximale passive Durchmesser bei jedem Druck (Max D; bestimmt in Ca ^{2 +-freien} Bedingungen), die verwendet werden, um den Ton durch das lymphatische glatten Muskelzellen erzeugt ermittelt werden kann, und wird auch verwendet, um Daten zwischen Lymphbahnen mit unterschiedlichem Durchmesser zu normalisieren, oder den gleichen lymphatischen an verschiedenen luminalen Druck untersucht.
   EDD _1, welche die EDD mit der ersten Kontraktion nach einem Druck Schritt verbunden ist. Dies ist als Ausgangspunkt verwendet werden, wennBestimmung myogene Verengung eines Lymphgefäßsystem in Reaktion auf eine deutliche Erhöhung der luminalen Druck ^5.
   / Max D - Myogenic Verengung eines isolierten lymphatischen nach einem Druck Schritt wird durch die normierte Änderung der EDD nach einer Druckstufe erhöhen = 100 * (EDD ₁ EDD) vertreten.
   Weitere Variablen, die berechnet werden, sind aber an anderer Stelle im Detail ⁴ diskutiert werden, sind:
   Tone = 100 * (Max D - EDD) / Max D, normalisiert AMP = AMP / Max D
   Hubvolumen-Index (SVI) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   Auswurffraktion (EF) = SVI / (πEDD2)
   Volume Flow Index (VFI) = CF x SVI.

7. Repräsentative Ergebnisse:

Zu Beginn eines jeden phasische Kontraktion, es war ein vorübergehender Anstieg der [Ca ^{2 +]} _i (Abbildung 4). Darüber hinaus wird nach dem Schritt steigt in luminalen Druck, die Häufigkeit der Ca ^{2 +-Transienten} und pHasic Kontraktionen erhöht synchron. Diese Beobachtungen sind ähnlich wie bei einem früheren Befund mit Brust-Kanäle auf einem Draht Myographions ¹⁴ montiert und Unterstützung früheren Daten, die eine zentrale Rolle für die oszillatorische Ca ^{2 +-Freisetzung} aus internen Speichern in den Mechanismus der phasischen kontraktilen Zyklus ^15.

Wir haben auch untersucht, ob [Ca ^{2 +]} _i während der Diastole (zwischen den Ca ^{2 +-Transienten} und phasische Kontraktionen) wird mit dem Lymph-Ton und myogene Verengung durch Dehnung verursacht, wenn Schritt erhöht in Druck auferlegt werden (Abbildung 5) verbunden ist. Unmittelbar nach dem Schritt steigt der Druck von +4 cm H ₂ O und höher, [Ca ^{2 +]} _i während der Diastole stetig gestiegen, im Vergleich zum Ausgangswert vor der Druckstufe (Abb. 5B). Darüber hinaus wird nach der anfänglichen Zunahme des Durchmessers durch den Schritt erhöht in Druck (EDD _1), gab es myogenen Konstriktion (Abb.Abbildung 5C), da eine Abnahme der EDD von EDD ₁ in früheren Berichten ^5,12 definiert. Beim Vergleich der mittleren normalisierten Änderung EDD zwischen den verschiedenen Druckstufen, gab es deutlich mehr Verengung nach einem Anstieg von +8 und +10 cm H ₂ O bis +2 cm H ₂ O (Abbildung 6 A) verglichen. Der stetige Anstieg der [Ca ^{2 +]} _i wurde auch auf Druck bezogen, mit dem Schritt steigt von +6, +8 und +10 cm H ₂ O verursacht deutlich höhere Veränderungen in Ca ^{2 +} als +2 cm H ₂ O ( Abbildung 6 B). Doch der Druck Schritt für Ca ^{2 +} Beziehung scheint Plateau auf diesen Druck als auch. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Ca ^{2 +-abhängigen} Mechanismus mit lymphatischer myogenen Konstriktion in Reaktion auf Dehnung verbunden ist. Doch das Plateau in der Druck Schritt für Ca ^{2 +} Beziehung schlägt einen Mechanismus, der Ca ^{2 +} erhöht die Empfindlichkeit auch auf die erhöhte myogene constri beitragen könnenktion bei den höheren Druckstufen.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Mikroskop-System für die Messung von gebrauchten [Ca ^{2 +]} _i in einem isolierten lymphatischen. Die isolierten lymphatischen Kammer befindet sich auf der Bühne des inversen Mikroskop gelegt. Die Probe wird alternativ bei 340 und 380 nm beleuchtet, und das Fluoreszenz-Signal durch das lymphatische emittiert wird mit einer CCD-Kamera gesammelt und in einem Personal Computer. Die intraluminale Druck des lymphatischen wird durch einen Servo-null-Feedback-System gesteuert. Der Anwender stellt den Druck für das System und die Drucksensoren in-line mit der lymphatischen Relais des intraluminalen Druckes auf das Feedback-System, das dynamisch erhöhen können oder niedrigerem Druck über eine Pumpe.

Abbildung 2. Beispiel für Region of Interest (ROI) Auswahl für Fura-2 ratiometrische Bildgebung in isolierten Lymphgefäße. Die Region ausgewählt umfasst den größten Teil des Schiffes (ausgenommen Bereiche berühren die Mikropipetten) und Umgebung, um sicherzustellen, das Schiff für die gesamte Zeit Kurs verfolgt werden. Ein Hintergrund ROI (oben rechts) wird auch verwendet, um unspezifische Signal aus den umliegenden Bad zu beseitigen.

Abbildung 3. Verfahren zur Verfolgung lymphatischen pumpen. A. Innendurchmesser kann im Laufe der Zeit bestimmt werden mittels ROIs, dass die Bewegung verfolgen der Gefäßwände. B. Wenn der Kontrast Schwelle eingestellt ist, dass das gesamte Gefäß umfassen, kann der Außendurchmesser mit einem ROI verfolgt werden. Innendurchmesser kann aus diesen Messungen durch die Korrektur für Wandstärken geschätzt werden. C. Eine weitere Möglichkeit ist die Zone von dem Schiff, mit dem Volumen berechnen kann durch die Korrektur für Wandstärken und Trackvorausgesetzt, das Lymphsystem hat zylindrische Geometrie.

Abbildung 4. Beziehung zwischen [Ca ^{2 +]} _i und lymphatischen Durchmesser. A. Repräsentative Bilder von einem Zeitraffer-Video von Fura-2-Intensität (Heat Map-Format) in einer isolierten lymphatischen. Die Pfeile in jedem Bild einen Überblick über die äußere Durchmesser des Gefäßes. Bild 1 zeigt das lymphatische während der Diastole, mit einem relativ niedrigen [Ca ^{2 +]} _i. In Bild 2 ist die Intensität der 340/380 Verhältnis steigt in den Gefäßwänden, kurz vor der phasischen Kontraktion, die in den Bildern 3-5 auftritt. Mit Bild 4, hat die Ca ^{2 +} Transienten zu Ende, und von Bild 5, der systolischen Phase ist beendet und das Schiff in den Ruhezustand zurück. B. Ein Grundstück von [Ca ^{2 +]} _i und lymphatischen Lumendurchmessers zeigt, dass ein vorübergehender Anstieg der [Ca ^{2 +]} _{i just} vor jedem auftrittphasische Kontraktion.

Abbildung 5. Changes in lymphatischen [Ca ^{2 +]} _i und das lymphatische kontraktilen Zyklus in Reaktion auf Schritt erhöht in Druck. Der Druck Schritt-Protokolle (A), 340/380 Verhältnis von Daten, was [Ca ^{2 +]} _i (B), und Veränderungen in der lymphatischen Durchmesser im Laufe der Zeit (C) gezeigt. A. Baseline luminalen Druck war 2 cm H ₂ O und das Lymphgefäßsystem wurde einer Erhöhung von +2, +4, +6, +8 Schritt und +10 cm H ₂ O. Der Zeitabstand zwischen den einzelnen Druck Step-Aufnahme wurde 1-2 min. Jeder Druck Schritt führte zu einem Anstieg sowohl in der Häufigkeit von vorübergehender Anstieg von [Ca ^{2 +]} _i (B) und phasische Kontraktionen (C). Lymphatische Durchmesser auch mit jedem Schritt Erhöhung der luminalen Druck erhöht, und für die 4 bis 10 cm H ₂ O Druckstufen, gab es einen ersten Rückgang der EDD, dass af aufgetretenter EDD1 (C), die zuvor als lymphatische myogenen Konstriktion beschrieben. Es gab auch ein stetiger Anstieg der basalen [Ca ^{2 +]} _{i-Transienten} zwischen unmittelbar nach jedem Schritt Erhöhung des Drucks (B). Die myogene Verengung ausgeprägter war mit dem größeren Druck Schritte, aber der Anstieg der basalen [Ca ^{2 +]} _i in etwa dem Betrag für die 4 bis 10 cm H ₂ O Druckstufen (B). Ein zuvor berichtet kompensatorische Zunahme in AMP wurde auch nach dem Druck-Schritten von 6 bis 10 cm H ₂ O (C) sichtbar.

Abbildung 6. Lymphatische myogene Verengung und die schrittweise Erhöhung der freien [Ca ^{2 +]} _i während der Diastole, kurz nach Schritt erhöht in Druck. A. Die durchschnittliche zwischen 30-50 s nach der EDD ₁ EDD wird verwendet, um die Veränderung der normierten EDD für jeden Druck Schritt berechnen. B. Die Intensität der 340/380 Verhältnis 30-50 s nach der EDD ₁ wurde durch die durchschnittliche 340/380 Verhältnis während der Baseline (2 cm H ₂ O) unterteilt. * P <0,05 im Vergleich zu den +2 cm H ₂ O Druckstufe. N = 4 Schiffe untersucht.

Movie 1. Beispiel phasische Kontraktionen in einer isolierten Lymphgefäßsystem für das Studium verwendet werden. Die luminalen Druck wurde bei 2 cm H ₂ O. gesetzt Die verstrichene Zeit und ein Maßstab werden am unteren Rand angezeigt. Die Zeitraffer-Aufnahmen wurden mit einem 10X-Objektiv mit Durchlicht gesammelt. Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.

Movie 2. Ratiometric Fura-2 Imaging in einen pumpenden isoliert lymphatische. Eine Heatmap Skala ist nach oben links zu sehen und die verstrichene Zeit und Maßstab werden am unteren Rand angezeigt. Der Druck wurde ursprünglich auf 2 cm H ₂ O eingestellt und war bis 8 cm H ₂ O erhöht ab 0,5 min und returned bis 2 cm H ₂ O bei 1,5 min. Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.

Discussion

Eine neuartige Kombination von Methoden wurde eingesetzt, um innere Pumpen von Lymphgefäßen zu studieren. Die Fähigkeit, gleichzeitig zu messen Veränderungen in [Ca ^{2 +]} _i und Durchmesser in Pumpen Lymphgefäße wird für die Untersuchung der relativen Beiträge der Ca ^{2 +-abhängige} und Ca ^{2 +-sensibilisierende} Signalwege in der gesamten Mechanismus für die lymphatischen kontraktilen Zyklus. Zulassen

Das lymphatische kontraktilen Zyklus besteht aus phasische Kontraktionen über Ton überlagert. Die Daten zeigen, dass jeder phasische Kontraktion mit einem vorübergehenden Anstieg in [Ca ^{2 +]} _i verknüpft ist, was auf eine zentrale Rolle der Ca ^{2 +} in der Schrittmacher-Mechanismus, und dass die Häufigkeit der Ca ^{2 +-Transienten} reagiert empfindlich auf Veränderungen in luminalen Druck . Unsere Daten zeigen auch, dass eine rasche Zunahme der Druck kann einen stetigen Anstieg in den basalen entlocken [Ca ^{2 +]} _i zwischen Transienten. Dieser Anstieg kann dazu beitragen,der myogenen Konstriktion, dass bei der Erhebung Lymphgefäße folgenden Schritt erhöht in luminalen Druck beobachtet wird. Allerdings beobachteten wir ein Plateau der Erhöhungen in diesem basalen [Ca ^{2 +]} _i mit Druckstufen bis hin 6 bis 10 cm H ₂ O, die in unterschiedlichem Maße von myogenen Verengung hatte. Diese Daten legen nahe, dass ein anderer Mechanismus, möglicherweise ein Ca ^{2 +-sensibilisierende} Mechanismus auch in der myogene Reaktion auf den Druck beteiligt.

Eine Annahme mit diesen Studien ist, dass die Mehrheit der gemessenen Ca ^{2 +} in der glatten Muskulatur enthalten ist. Allerdings, Ca ^{2 +} in Endothelzellen und andere Zelltypen, die vorhanden sein in die Lymphbahnen kann sich auch auf die gesamte beobachtet [Ca ^{2 +]} _i, so dass die gemessenen Werte sind vermutlich eine Überschätzung der glatten Muskulatur [Ca ^{2 +]} _i in beizutragen Lymphgefäße. Jede Ca ^{2 +} aus dem Endothel gemessen wird voraussichtlich nicht direkt dazu beitragenKontraktion der glatten Muskulatur auf der Grundlage früherer Studien in den Arteriolen ^16. Dieses Problem wird in zukünftige Experimente, in denen die Lymphbahnen des Endothels entblößt angesprochen werden.

Bei der Verwendung von ratiometrische zu beurteilen [Ca ^{2 +]} _i in Zellen oder Geweben, die Bewegung der Probe Artefakte verursachen kann. Zur Minimierung der Bewegungsartefakte in öffentliche Lymphgefäße, verwendeten wir einen ROI, dass so viel von dem Schiff wie möglich zu 340/380 Verhältnisse bestimmen umfasst. Wir haben auch nur studieren Schiffe, die im Fokus bleiben während ihrer kontraktilen Zyklus. Wegen der Möglichkeit von Artefakten, die aus dem Gefäß Bewegung entstehen, anstatt kann die absolute [Ca ^{2 +]} _i an einer bestimmten Stelle, so erhalten wir im Durchschnitt eine große Fläche des Schiffes. Wir konzentrieren uns auf die relativen Veränderungen in der durchschnittlichen Konzentration [Ca ^{2 +]} _i im Laufe der Zeit und wie diese Veränderungen beziehen sich auf phasische und tonische Kontraktion der Gefäße.

Zusammenfassend Determination von Veränderungen in [Ca ^{2 +]} _i durch ratiometrische Bildgebung in isolierten sammeln Lymphbahnen stellt ein leistungsfähiges Tool zur Entschlüsselung der Ca ^{2 +-abhängige} und Ca ^{2 +-sensibilisierende} Mechanismen der lymphatischen kontraktilen Zyklus. Mit dieser Methode werden die künftigen Studien mit selektiven Agonisten oder Inhibitoren von verschiedenen Signaltransduktionswegen auch dazu beitragen, unterscheiden die einzigartige molekulare Mechanismen, die phasischen gegen tonische Kontraktion der glatten Muskulatur in lymphatischen.