Måling av cytosoliske Ca ^{2 +} I isolerte kontraktile lymfesystem

Summary

Vi introduserer en tilnærming for å evaluere cytosoliske Ca

Abstract

Lymfekar utgjør et multifunksjonelt transport system som opprettholder væske homeostase, leverer lipider til den sentrale sirkulasjon, og fungerer som et overvåkingssystem for potensielt skadelige antigener, optimalisere mucosal immunitet og adaptive immunresponser ^1. Lymfe er dannet fra interstitiell væske som kommer blind-ended innledende lymfekjertlene, og deretter transporteres mot en trykkgradient i større samle lymfekar. Hver samle lymfatisk består av en rekke segmenter som kalles lymphangions, atskilt av bicuspid ventiler som hindrer tilbakestrømning. Hver lymphangion besitter en kontraktile syklus som driver lymph mot en trykkgradient mot den sentrale sirkulasjon ^2. Dette phasic kontraktile mønsteret er analogt til hjerte-syklus, med systolisk og diastolisk faser, og med en lavere sammentrekning frekvens ^fire. I tillegg genererer lymphatic glatt muskel tone og viser myogenic innsnevring og utvidelse in respons på økning og reduksjon i luminal press, henholdsvis ^5. En hybrid av molekylære mekanismer som støtter både phasic og tonic kontraktilitet av lymfekjertlene er dermed foreslått.

Sammentrekning av glatt muskulatur er generelt regulert av cytosoliske Ca ^{2 +} konsentrasjon ([Ca ^{2 +]} _i) pluss sensitivitet til Ca ^{2 +,} av kontraktile elementer i respons til endringer i miljøet som omgir cellen ^6. [Ca ^{2 +]} _i er bestemt av kombinasjonen av bevegelsen av Ca ^{2 +} gjennom plasmamembranen ligand eller spenning gated Ca ^{2 +} kanaler og frigjøring og opptak av Ca ^{2 +} fra interne butikker. Cytosoliske Ca ^{2 +} binder seg til calmodulin og aktiverer enzymer som myosin lett kjede (MLC) kinase (MLCK), som igjen phosphorylates MLC fører til actin-myosin-mediert kontraksjon ^8. Men følsomheten av denne veien til Ca 9. MLCP aktiviteten er regulert av Rho kinase (ROCK) og myosin fosfatase inhibitor protein KPI-17.

Her presenterer vi en metode for å vurdere endringer i [Ca ^{2 +]} _i over tid i isolerte, perfused lymfekjertlene for å studere Ca ^{2 +-avhengige} og Ca ^{2 +-sensibiliserende} mekanismer av lymfatisk glatt muskel sammentrekning. Bruk isolerte rotte mesenteric samle lymfekar vi studert stretch-indusert forandringer i [Ca ^{2 +]} _i og kontraktil aktivitet. Den isolerte lymfatiske Modellen har den fordelen at trykk, flow, og den kjemiske sammensetningen av badekaret løsningen kan være strengt kontrollert. [Ca ^{2 +]} _i ble bestemt ved lasting lymfekar med ratiometric, ² Ca ^+-bindende dye Fura-2. Disse studiene vil gi en ny tilnærming til bredere problemet med å studere de forskjellige molekylære mekanismer som regulerer phasicsammentrekninger versus tonic innsnevring i lymfatisk glatt muskulatur.

Protocol

1. Dyr

1. Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og Bruk komité ved Louisiana State University Health Sciences Center og ble utført i samsvar med retningslinjene for National Institute of Health (NIH publikasjon nr 85-12, revidert 1996). Mann Sprague-Dawley rotter (Charles River Laboratories, 270-350 g kropp vekt) ble plassert i en kontrollert temperatur (22 ° C) og kontrollert belysning (12:12 h lyse mørke syklus) miljø. Etter ankomst ble rottene sendt til en ukes akklimatiseringsperiode og ble levert standard rat Chow (2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, Harlan) og vann ad libitum.

2. Eksperimenter Set-Up

1. Glass mikropipetter for montering lymfekjertlene er laget av borsilikatglass med filament OD 1.2mm, ID 0.69mm (Sutter Instrument BF 120-69-15). Trekk pipettene med en Flaming / Brown mikropipette Puller modell P-97 (Sutter InstrumØNH) og er bevel med et Micro Grinder EG 400 (Narishige) for å oppnå en beveled tips med en ~ 60 mikrometer ytre diameter.
2. Monter mikropipetter i isolerte fartøy kammeret (modell CH-1, Living Systems, Burlington, VT). The Pipettes bør motstand matchet (samme størrelse åpning).
3. Fyll kammeret (5 ml) og mikropipetter med albumin-fysiologisk salt-løsning (APSS, se tabell 1). Pass på at det ikke er noen bobler i mikropipetter eller slangen.
4. Forbered halvstikk knop med oftalmisk suturer og plassere en på hver mikropipette.

3. Samle Lymfatisk Isolation

1. Anesthetize dyrene med en intramuskulær injeksjon av ketamin / xylazin (90 og 9 mg / kg, henholdsvis), med en BD sprøyte (1 ml) og nål (BD intradermal bevel 26G3 / 8).
2. Spray buken området med 70% alkohol for å sterilisere, utføre en midtlinjen laparotomi, og exteriorize og avgifter tynntarmen og mesenteriet. Plasser vev i ice-kald APSS. Avlive dyrene med en overdose av ketamin / xylazin og bekreft døden ved å åpne brystet (som per American Veterinary Medical Association retningslinjer for aktiv dødshjelp).
3. Pin en del av mesenteriet i en disseksjon kammer fylt med iskald APSS. Forsiktig dissekere en innsamling lymphatic fartøy (80-200 mikrometer innvendig diameter og 1-2 mm i lengde) fra omkringliggende fettvev og bindevev ved hjelp av et stereomikroskop. Bruk dissecting Dumont tang-INOX 55 (Fin Science Verktøy # 11255-20) og dissekere våren saks (Fine Science Verktøy # 15000-03). Bruk isolert fartøy med bare én ventil for å sikre optimal trykkontroll i hele segmentet under forsøket.
4. Overfør isolerte lymphatic til den isolerte skipet kammeret inneholder 5 ml APSS. Mount fartøyet på de to motstanden-matchet glass mikropipetter ved å binde med oftalmisk suturer.
5. Transfer i kammeret til en invertert fluorescerende mikroskop (vi har er en Nikpå TE-2000U) utstyrt med xenon lampe (Sutter Instruments Lambda LS2 300 W), 340/380 filter hjul system (Sutter Lambda 10-3 med Chroma Technology 340 og 380 nm eksitasjon filtre), 510 nm dichroic emitter (Chroma Technology D510 / 80m), en følsom CCD kamera (fotometriske HQ ^2), og programvare for oppkjøp (Nikon Elements AR) (figur 1).
6. Fest slangen som stammer fra mikropipetter enten justerbare reservoarer eller til servo-feedback pumpesystem (Living Systems Instrumentation, Burlington VT), begge som kan brukes til å endre trykk og flyt.
7. Koble kammer til varmeenhet (Living Systems) og sett badekaret til 37 ° C.
8. Vis lymfatisk direkte gjennom dekkglass i bunnen av kammeret med en 10X objektiv (Nikon Plan 10x/0.3 Fluor, L/N1 DIC, ∞ / 0.17, WD 16,0). Rapid time-lapse bilde sett kan erverves ved hjelp av Image Acquisition programvaren (systemet vårt har Nikon Elements AR programvare).

2 +] _i

1. [Ca ^{2 +]} i i den isolerte lymfatiske glatt muskulatur er målt ved Ca ^{2 +-sensing} dye Fura 2-acetoxymethyl ester (AM) (molekylære prober, Eugene, OR).
2. Legg lymfatiske fartøyet med Fura-2 AM ved å skifte ut badekaret til APSS løsning som inneholder Fura-2 AM (2 mM) og pluronic syre (0,2% wt / vol) for 30 minutter ved 37 ° C.
3. Etter 30 minutter endre badet tilbake til APSS løsning. Skyll 2 ganger for å vaske ut Fura-2 fra badet løsningen. La fartøyet for en likevekt på minst 20 min før [Ca ^{2 +]} _i målinger for å tillate re-etablering av spontane sammentrekninger.
4. Samle ratiometric Fura-2 målinger i isolerte lymfekar med et oppkjøp protokoll som alternativt lyser ved 340 og 380 nm bølgelengde for varigheten av 50 ms hver. Det fluorescerende lyset passerer gjennom et dichroic speil (400 nm; Chroma Technology Corp 400DCLP) og et bredt bånd utslipp filter (510 nm, 80 nm bandet bredde; Chroma Technology Corp D510/80m) og er ervervet av den fotometriske HQ ^to kamera. Vi samler inn 2 minutter av data ved baseline intraluminal trykk på 2 cm H ₂ O og under trinn øker med 2, 4, 6, 8 og 10 cm H ₂ O.
5. For å analysere den gjennomsnittlige [Ca ^{2 +]} _i, tegne en region av interesse (ROI) som inkluderer hele lymfesystemet fartøyet og området rundt, slik at fartøyet er fullt spores under avslapping og sammentrekning (figur 2). Hvis enten mikropipette er i synsfeltet disse områdene ikke bør inkluderes i ROI. Mindre Rois kan også velges, men et potensielt problem med små Rois er at fartøyet veggene kan bevege seg litt i lengderetningen ut av ROI som fartøyet constricts og slapper av. Et annet potensielt problem er at enkelte fartøy vri under kontraksjon, og disse lymfekjertlene bør ikke brukes for å studere. The vridning bevegelser er vanligvis unngås ved å begrense lengden på den isolerte lymphatic til <1 mm. I tillegg, noen ganger segmenter på hver side av en ventil ikke constrict / slappe av i synkront. I dette tilfellet, fordi disse segmentene representerer separate funksjonelle lymphangions bør lymphatic studeres på bare én side av ventilen, eller hver lymphangion kan studeres separat med en ROI plassert på hver side. Når du bruker en 10X objektiv, bør fartøyet vegger opphold i fokus under phasic sammentrekninger, men hvis det er noen deler av veggene som går ut av fokus under ri disse områdene bør ikke inngå i ROI. En bakgrunn ROI er også brukt, og bør plasseres langt fra fartøy (f.eks i hjørnet av bildet). En økning i 340/380 ratio indikerer en økning i [Ca ^{2 +]} _i. Luminal diameter på ulike tidspunkter kan også måles ved hjelp av programvaren måle funksjon eller ved å spore fartøy vegger over tid (se kapittel 6). </ Li>

5. Pressure Control Protocol

1. Å studere trykket uavhengig av pålagt flyt, må det samme trykket brukes på hver mikropipette av servo-null tilbakemeldinger pumpe. Slangen fra hver mikropipette er festet via en T-kontakten til felles rør montert på pumpen. Utgangspunktet satt den intraluminal trykket på 2 cm H ₂ O i 45-60 min., Noe som er nok tid til å tillate utviklingen av lymfatisk spontane sammentrekninger.
2. For undersøkelsen bruker bare fartøy som oppfyller følgende kriterier innenfor likevekt periode: (1) fartøyet utvikler spontan tone på 2 cm H ₂ O, (2) fartøyet utvikler regelmessige, spontane sammentrekninger som er rimelig ensartet på tvers av fartøyets lengde . Ofte området nedstrøms fra en ventil constricts mer enn resten av skipet, og disse fartøyene vil bli brukt så lenge det er bevis for at resten av skipet viser kontraktile aktivitet.
3. Ta den raske time-lapse bilder under trykket steg prosedyren. For hver, vil trykket begynne på 2 cm H ₂ O for 30 s, og da er oppvokst i en steg 2, 4, 6, 8 eller 10 cm H ₂ O i ett minutt, og senkes igjen til 2 cm H ₂ O i 30 s.
4. Etter gjennomføringen av trykket trinnet serien, endre badekaret løsning til en Ca ^{2 +-free} APSS ved 37 ° C for å måle maksimal passiv diameter (Max D) og Ca ^{2 +-fluorescens} målinger på hver av de ovennevnte luminal press. Max D brukes til å beregne tone og normalisere data mellom lymfekar i forskjellige størrelser.

Seks. Lymfatisk kontraktile Parametere

1. Endringer i fartøy diameter over tid kan bestemmes ved hjelp objekt sporing verktøy i de fleste bildeanalyse programvarepakker. Dette kan oppnås ved å bruke bare en av kanalene (vi bruker 340 nm kanal, men den 380 kanalen kan også brukes). En kontrast terskel er caløyet til bildestakk slik at fartøyet vegger er uthevet, og deretter Rois omfatter hver vegg er trukket for å spore dem over tid (figur 3 A). Den interne diameter kan bestemmes ved å måle Tyngdepunktet av hver vegg og beregne avstanden mellom de to centroids, minus halvparten av tykkelsen på hver vegg.
   Et annet alternativ når det er vanskelig å spore hver vegg pga et sterkt signal i luminal området er å måle ytre diameter, og bruk en korreksjonsfaktor basert på en statisk måling av fartøy vegger for å oppnå indre diameter. I dette tilfellet spenner over ROI hele fartøyet og ytre diameter spores (figur 3 B). Denne metoden kan også brukes til å bestemme hele synlige tverrsnitt av lymphatic (figur 3 C). På grunn av den typiske form av en lymphangion, kan dette siste alternativet gi et bedre estimat av det faktiske volumet av væske pumpes med hver sammentrekning enn å bruke diameter i en valgt delav fartøyet.
2. Fra time-lapse studie fastslå følgende parametere av lymfatisk luminal diameter målinger ^4,12,13:
   Sammentrekning frekvens (CF), bestemt ved å telle antall phasic kontraksjoner per minutt.
   Slutt diastolisk diameter (EDD), som er diameteren like før en phasic sammentrekning.
   Slutt systolisk diameter (ESD), diameteren på slutten av en phasic sammentrekning.
   Amplitude av sammentrekning (AMP = EDD-ESD), en forenklet indeks over slagvolum.
   Den maksimale passiv diameter på hvert trykk (Max D; bestemt i Ca ^{2 +-frie} forhold), som kan brukes til å bestemme tonen som genereres av lymphatic glatt muskulatur, og brukes også for å normalisere data mellom lymfekar av forskjellig diameter, eller samme lymfatiske studert ved ulike luminal press.
   ₁ EDD, som er EDD forbundet med den første sammentrekningen etter et press trinn. Dette brukes som utgangspunkt nårbestemme myogenic innsnevring av en lymphatic fartøy som svar på et trinn økning i luminal trykket ^5.
   Myogenic innsnevring av en isolert lymfesystemet etter et press trinn er representert ved normalisert endring i EDD etter press skritt økning = 100 * (EDD - EDD ₁₎ / Max D.
   Flere variabler som kan beregnes, men er omtalt andre steder i detalj ⁴ er:
   Tone = 100 * (Max D - EDD) / Max D, normalisert AMP = AMP / Max D
   Slagvolum indeks (SVI) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   Ejeksjonsfraksjon (EF) = SVI / (πEDD2)
   Volum Flow Index (VFI) = CF x SVI.

7. Representant Resultater:

I begynnelsen av hver phasic sammentrekning, var det en forbigående økning i [Ca ^{2 +]} _i (figur 4). I tillegg, etter trinn øker i luminal press, frekvensen av Ca ^{2 +} transienter og phasic sammentrekninger økt i synkront. Disse observasjonene er lik en tidligere funn ved hjelp av thorax kanaler montert på en wire myograph ¹⁴ og støtter tidligere data indikerer en sentral rolle for oscillasjon Ca ^{2 +} løslatelse fra interne butikker i mekanismen bak phasic kontraktile syklus ^15.

Vi har også undersøkt om [Ca ^{2 +]} _i løpet av diastole (mellom Ca ^{2 +} transienter og phasic kontraksjoner) er forbundet med lymfesystemet tone og myogenic innsnevring på grunn av strekk når steg økning i trykket er pålagt (figur 5). Umiddelbart etter trinn øker presset av 4 cm H ₂ O og høyere, [Ca ^{2 +]} _i løpet diastole stadig økt, sammenlignet med baseline før trykket trinn (Figur 5B). I tillegg, etter den første økningen i diameter grunn til trinnet økning i trykket (EDD _1), var det myogenic innsnevring (Figure 5C), definert som en reduksjon i EDD fra EDD ₁ i tidligere rapporter ^5,12. Når man sammenligner gjennomsnittlig normalisert endring i EDD mellom de ulike trykket steg, var det betydelig mer innsnevring etter økninger på 8 og 10 cm H ₂ O i forhold til 2 cm H ₂ O (Figur 6 A). Den stadige økningen i [Ca ^{2 +]} _Jeg var også relatert til press, med trinn øker med 6, 8 og 10 cm H ₂ O forårsaker betydelig høyere endringer i Ca ^{2 +} enn 2 cm H ₂ O ( Figur 6 B). Men trykket step-Ca ^{2 +} forhold ser ut til platå på dette presset også. Disse resultatene tyder på at en Ca ^{2 +-avhengig} mekanisme er assosiert med lymfatisk myogenic innsnevring i respons på strekningen. Men platået i trykket step-Ca ^{2 +} forholdet foreslår en mekanisme som øker Ca ^{2 +} følsomhet kan også bidra til økt myogenic constriDette skjer ved høyere trykk trinn.

Figur 1. Skjematisk av mikroskopet system som brukes for måling av [Ca ^{2 +]} _i i et isolert lymfesystemet. Den isolerte lymfatiske kammeret er plassert på scenen av invertert mikroskop. Prøven er opplyst alternativt ved 340 og 380 nm, og den fluorescerende signal slippes ut av lymfatiske samles med et CCD-kamera og lagret i en personlig datamaskin. Den intraluminal trykket av lymfatisk er kontrollert av en servo-null feedback system. Brukeren setter press for systemet, og trykket transdusere i tråd med lymphatic relé intraluminal press på feedback system som dynamisk kan heve eller senke trykket via en pumpe.

Figur 2. Eksempel på Region of Interest (ROI) utvalg for Fura-2 ratiometric imaging studier i isolerte lymfekar. Regionen valgt omfatter det meste av skipet (unntatt områder berøre mikropipetter) og området rundt for å sikre at fartøyet vil spores for hele tiden kurset. En bakgrunn ROI (øverst til høyre) er også brukes til å eliminere spesifikk signal fra omliggende bad.

Figur 3. Metoder for sporing lymphatic pumping. A. Innvendig diameter kan bestemmes over tid ved hjelp Rois som sporer bevegelsen av fartøyet vegger. B. Når kontrasten terskelen er satt til å omfatte hele fartøyet, kan ytre diameter spores med en enkelt ROI. Innvendig diameter kan estimeres fra disse målingene ved å korrigere for veggtykkelse. C. Et annet alternativ er å spore det området som omfattes av fartøyet, som kan brukes til å beregne volum ved å korrigere for veggtykkelse ogforutsatt at lymfatiske har sylindrisk geometri.

Figur 4. Forholdet mellom [Ca ^{2 +]} _i og lymfatiske diameter. A. Representant bilder fra en time-lapse video av Fura-2 intensitet (varme map format) i et isolert lymfesystemet. Pilene i hvert bilde skissere ytre diameter av fartøyet. Bilde 1 viser lymphatic under diastole, med relativt lav [Ca ^{2 +]} _i. I bilde 2, intensiteten av 340/380 ratio øker i fartøy vegger, like før phasic sammentrekning som oppstår i bilder 3-5. Etter bilde 4, har Ca ^{2 +} forbigående avsluttet, og etter bilde 5, har det systoliske fase avsluttet og skipet er tilbake til sin hviletilstand. B. En tomt på [Ca ^{2 +]} _i og lymfatiske luminal diameter viser at en forbigående økning i [Ca ^{2 +]} _i inntreffer like før hverphasic sammentrekning.

Figur 5. Endringer i lymfesystemet [Ca ^{2 +]} _i og lymfatiske kontraktile syklusen i respons til trinn økning i trykket. Trykket steg protokoller (A), 340/380 ratio data, som representerer [Ca ^{2 +]} _i (B), og endringer i lymfatiske diameter over tid (C) vises. A. Baseline luminal lufttrykket var 2 cm H ₂ O og lymfatiske skipet ble utsatt til trinn øker med 2, 4, 6, 8 og 10 cm H ₂ O. Tidsintervallet mellom hvert trykk steg opptaket ble 1-2 min. Hvert trykk steg forårsaket en økning i både hyppighet av forbigående økning i [Ca ^{2 +]} _i (B) og phasic sammentrekninger (C). Lymfatisk diameter økte også med hvert trinn økning i luminal press, og for 4-10 cm H ₂ O press trinn, var det en initial reduksjon i EDD som skjedde after EDD1 (C), tidligere beskrevet som lymfatisk myogenic innsnevring. Det var også en jevn økning i basal [Ca ^{2 +]} _i mellom transienter umiddelbart etter hvert trinn økning i trykket (B). Den myogenic innsnevring var mer uttalt med større press skritt, men økningen i basal [Ca ^{2 +]} _jeg var omtrent den samme for 4-10 cm H ₂ O press trinn (B). En tidligere rapportert kompensatorisk økning i AMP var også tydelig etter at trykket trinn på 6-10 cm H ₂ O (C).

Figur 6. Lymfatisk myogenic innsnevring og gradvis økning i frie [Ca ^{2 +]} _i løpet diastole, kort tid etter trinn økning i trykket. A. Den gjennomsnittlige EDD mellom 30-50 s etter at EDD ₁ brukes til å beregne endringen i normalisert EDD for hvert trykk trinn. B. Intensiteten av 340/380 ratio 30-50 s etter at EDD ₁ ble dividert med gjennomsnittlig 340/380 ratio under baseline (2 cm H ₂ O). * P <0,05 vs 2 cm H ₂ O press trinn. N = 4 skip studert.

Movie 1. Eksempel på phasic sammentrekninger i et isolert lymphatic fartøy som brukes for å studere. Den luminal lufttrykket var satt til 2 cm H ₂ O. Medgått tid og en skala bar vises nederst. The time-lapse bilder ble samlet med en 10X objektiv bruker overført lys. Klikk her for å se filmen.

Movie 2. Ratiometric Fura-2 bildebehandling i en pumping isolert lymfesystemet. Et varmen kartmålestokk vises øverst til venstre og medgått tid og omfang bar vises nederst. Trykket ble i utgangspunktet satt til 2 cm H ₂ O og ble hevet til 8 cm H ₂ O som starter på 0,5 min og returned til 2 cm H ₂ O på 1,5 min. Klikk her for å se filmen.

Discussion

En roman kombinasjon av metoder ble benyttet for å studere iboende pumping av lymfekar. Muligheten til å samtidig måle forandringer i [Ca ^{2 +]} _i og diameter i pumping lymfekar vil tillate for studier av relative bidrag av Ca ^{2 +-avhengige} og Ca ^{2 +-sensibiliserende} signalveier i den generelle mekanismen som styrer lymfatiske kontraktile syklus.

Det lymfatiske kontraktile syklus består av phasic sammentrekninger oppå tone. Dataene viser at hver phasic sammentrekning er forbundet med en forbigående økning i [Ca ^{2 +]} _i, tyder en sentral rolle Ca ^{2 +} i pacemaking mekanisme, og at hyppigheten av Ca ^{2 +} transienter er følsom for endringer i luminal press . Våre data viser også at en rask økning i trykket kan lokke fram en jevn økning i basal [Ca ^{2 +]} _i mellom transienter. Denne økningen kan bidra tilden myogenic innsnevring som er observert i å samle lymfekar følgende steg økninger i luminal press. Men observerte vi et platå av økningene i denne basal [Ca ^{2 +]} _i med press skritt spenner 6-10 cm H ₂ O, som hadde varierende grad av myogenic innsnevring. Disse dataene tyder på at en annen mekanisme, muligens en ² Ca ^{+-sensibiliserende} mekanismen, er også involvert i myogenic svar på trykk.

Ett antakelse med disse studiene er at majoriteten av de målte Ca ^{2 +} finnes i glatt muskulatur. Men, Ca ^{2 +} i endotelceller og andre celletyper som kan være til stede i lymfekar også bidra til den generelle observerte [Ca ^{2 +]} _i, derfor de målte verdiene er trolig en overvurdere av glatt muskulatur [Ca ^{2 +]} _i i lymfekar. Eventuelle Ca ^{2 +} målt fra endotelet er ikke forventet å direkte bidraå glatte muskel sammentrekning basert på tidligere studier i arterioler ^16. Dette problemet vil bli behandlet i senere eksperimenter der lymfekjertlene er ribbet for endothelium.

Når du bruker ratiometric fargestoffer for å vurdere [Ca ^{2 +]} _i i celler og vev, bevegelse av prøven kan forårsake artefakter. For å minimere bevegelse artefakter i entreprenørvirksomhet lymfekar, benyttet vi en avkastning som inkluderer så mye av skipet som mulig for å avgjøre 340/380 forholdstall. Vi har også bare studere fartøy som opphold i fokus under deres kontraktile syklus. På grunn av mulige gjenstander som kan oppstå fra fartøy bevegelse, snarere enn fastslå absolutte [Ca ^{2 +]} _i på et bestemt nettsted, får vi gjennomsnittet for et stort område av skipet. Vi fokuserer på de relative endringene i gjennomsnittlig [Ca ^{2 +]} _i over tid og hvordan disse endringene er knyttet til phasic og tonic sammentrekning av skipene.

I sammendraget, Determination av endringer i [Ca ^{2 +]} _i ved ratiometric bildebehandling i isolerte samle lymfekar representerer et kraftig verktøy for å dechiffrere Ca ^{2 +-avhengige} og Ca ^{2 +-sensibiliserende} mekanismene bak lymfatiske kontraktile syklus. Med denne metoden, vil fremtidige studier benytte selektive agonister eller hemmere av ulike signaltransduksjonsveiene også hjelpe differensiere unike molekylære mekanismene bak phasic versus tonic sammentrekning i lymfatisk glatt muskulatur.