Измерение цитозольного Са ^{2 +} В изолированном Сократительная лимфатических

Summary

Введем подхода к оценке цитозольного Са

Protocol

1. Животные

1. Все процедуры были утверждены по Уходу за животными и использованию Комитетом на Университет штата Луизиана Центра медицинских наук и были проведены в соответствии с руководящими принципами Национального института здоровья (NIH публикация № 85-12, пересмотренная 1996). Мужской Sprague-Dawley крыс (Charles River Laboratories, 270-350 г массы тела) были размещены в контролируемой температуре (22 ° С) и контролируемое освещение (12:12 ч свет темно цикла) окружающей среды. После прибытия, крысы были представлены одной недели акклиматизации период и были предоставлены стандартные крысы чау (2018 Teklad Глобальный 18% диета грызунов, Харлан) и без ограничений воды объявление.

2. Эксперимент Set-Up

1. Стекло микропипетки для монтажа лимфатических сделаны из боросиликатного стекла с диаметром нити 1,2 мм, ID 0.69mm (Саттер инструмент BF 120-69-15). Потяните пипетки использованием Flaming / коричневый микропипетки Puller модели Р-97 (Саттер InstrumЛОР) и конические с Micro Grinder EG 400 (Narishige), чтобы получить скошенным кончиком с ~ 60 мкм наружного диаметра.
2. Горы микропипетки в изолированной камере судна (модель CH-1, живых системах, Берлингтон, Вермонт). Пипетки должны быть сопротивление соответствует (то же самое открытие размера).
3. Заполнить камеру (5 мл) и микропипетки с альбумином-физиологического раствора соли (АПСС, см. Таблицу 1). Убедитесь Есть нет пузырьков в микропипетки или трубки.
4. Подготовка сверху узлов с глазной швы и места по одному на каждой микропипетки.

3. Сбор Лимфатический Изоляция

1. Анестезию животных с внутримышечной инъекции кетамина / ксилазина (90 и 9 мг / кг, соответственно), при помощи шприца BD (1 мл) и иглы (BD внутрикожные конических 26G3 / 8).
2. Спрей живота с 70% спиртом для стерилизации, выполните срединной лапаротомии, а экстериоризироваться и акцизных тонкой кишки и брыжейки. Место ткани в микросхемыэлектронной холодной АПСС. Эвтаназии животных с передозировки кетамином / ксилазина и подтвердить смерть от вскрытия грудной клетки (в соответствии с американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации руководящие принципы об эвтаназии).
3. Pin части брыжейки в рассечение камере, наполненной ледяной АПСС. Осторожно рассекают сбора лимфатический сосуд (80-200 мкм и внутренним диаметром 1-2 мм длины) от окружающих жировой и соединительной ткани с помощью стереомикроскопа. Используйте пинцет рассекает Дюмон-INOX 55 (тонкие инструменты Наука # 11255-20) и рассекает весенний ножницы (Fine Инструменты наук # 15000-03). Использование изолированных сосудов с одним клапаном для обеспечения оптимального управления давлением в весь сегмент в ходе эксперимента.
4. Передача изолированной лимфатической к изолированной камере сосуд, содержащий 5 мл АПСС. Горы судна на два сопротивления соответствием микропипетки стекла, связывая с глазной швов.
5. Передача камеры перевернутой флуоресцентного микроскопа (наша Никана TE-2000U), оснащенный ксеноновой лампы (Саттер инструменты Lambda LS2 300 Вт), 340/380 система фильтров колесо (Саттер Lambda 10-3 с Chroma Технология 340 и 380 нм фильтра возбуждения), 510 нм дихроичных эмиттера (Chroma D510 технологии / 80м), чувствительная камера CCD (Фотометрические HQ ^2), и программное обеспечение для приобретения (Nikon Элементы AR) (рис. 1).
6. Прикрепите трубку, происходящих из микропипетки либо регулируемые резервуаров или серво-обратной связи насоса системы (живые системы приборостроения, Burlington VT), и которые могут быть использованы для изменения давления и расхода.
7. Подключите камеру к нагревательный элемент (живые системы) и установите ванну до 37 ° C.
8. Посмотреть лимфатической непосредственно через покровное в базе камера с 10х цель (Nikon Plan Fluor 10x/0.3, ДВС L/N1, ∞ / 0,17, WD 16,0). Быстрое покадровой наборов изображений может быть приобретено с помощью программного обеспечения Image Acquisition (наша система Nikon Элементы АР программного обеспечения).

2 +] _я

1. [Ca ^{2 +]} я в изолированной лимфатической гладких мышц измеряется Ca ^{2 +-зондирования} красителя Фура 2-ацетоксиметил эфира (AM) (Molecular Probes, Юджин, OR).
2. Нагрузка лимфатический сосуд с Фура-2 утра, обмениваясь ванну АПСС раствор, содержащий Фура-2 AM (2 мкм) и плуроник кислоты (0,2% вес / объем) в течение 30 минут при 37 ° C.
3. Через 30 минут менять ванну обратно АПСС решение. Промойте 2 раза промыть Фура-2 из ванны решение. Оставить судно для уравновешивания в течение минимум 20 минут, прежде чем [Ca ^{2 +]} _я измерениях, чтобы восстановление спонтанных сокращений.
4. Сбор логометрических Фура-2 измерения в изолированных лимфатических с приобретением протокол, который поочередно загорается при 340 и 380 нм для длины волны длительностью 50 мс каждый. Флуоресцентный свет проходит через дихроичных зеркал (400 нм; Chroma Technology Корпорация 400DCLP) и широкой полосы излучения фильтр (510 нм, 80 нм, ширина полосы; Chroma технологий корпорации D510/80m) и приобретается Фотометрические HQ ² камеры. Мы собираем 2 минуты данных на базовых внутрипросветного давления 2 см H ₂ O и во время шаг повышения +2, +4, +6, +8, +10 см и H ₂ O.
5. Для анализа среднем [Ca ^{2 +]} _я, рисовать области интереса (ROI), которая включает все судно лимфатической и его окрестностях, так что судно полностью гусеничных во время расслабления и сокращения (рис. 2). Если какая-либо микропипетки находится в поле зрения, эти районы не должны быть включены в ROI. Меньшие трансформирования также может быть выбран, однако потенциальная проблема с небольшим трансформирования в том, что стенки сосуда могут немного двигаться в продольном направлении из ROI, как сосуд сужается и расслабляет. Другой потенциальной проблемой является то, что некоторые суда поворот при сжатии, и эти лимфатические не должны использоваться для исследования. Thдвижения электронного скручивания, как правило, избежать путем ограничения длины изолированной лимфатической до <1 мм. Кроме того, иногда сегменты по обе стороны клапана не сжимать / Отдых в синхронии. В этом случае, потому что эти сегменты представляют собой отдельные функциональные lymphangions, лимфатической должны быть изучены только на одной стороне клапана, или каждый лимфатический сосуд можно изучать отдельно с ROI размещены с обеих сторон. При использовании 10X цели, стенки сосудов должны оставаться в центре внимания во время фазовых сокращений, однако если Есть какой-либо части стен, которые идут не в фокусе во время схватки этих областях не должны быть включены в ROI. Фон ROI также используется и должен быть помещен далеко от судна (например, в углу изображения). Увеличение 340/380 соотношение указывает на увеличение [Ca ^{2 +]} _я. Люминал диаметра в различных точках времени также может быть измерена с помощью мера функции программного обеспечения или путем отслеживания стенок сосудов с течением времени (см. раздел 6). </ LI>

5. Протокол контроля давления

1. Для изучения давление независимо от введенных поток, то же давление должно быть применено к каждому микропипетки на серво-нулевой обратной связью насоса. Трубы от каждой микропипетки крепится с помощью Т-разъем для общей трубы монтируется на насос. Первоначально набор внутрипросветного давления на 2 см H ₂ O в течение 45-60 мин., Что достаточно времени, чтобы позволить развитие лимфатической спонтанных сокращений.
2. Для исследования используются только суда, которые отвечают следующим критериям в период равновесия: (1) Судно развивает спонтанным тон на 2 см H ₂ O, (2) Судно развивает регулярные, спонтанные сокращения, которые являются достаточно однородными по всей длине судна . Часто области ниже по течению от клапана сжимает больше, чем остальная часть судна, и эти суда будут использоваться до тех пор, как есть свидетельства, что оставшаяся часть судна отображает сократительной активности.
3. Запись быстрого покадровой изображения во время процедуры шаг давлением. Для каждого, давление начнется на 2 см H ₂ O в течение 30 с, а затем поднимается на шаг, +2, +4, +6, +8, или +10 см H ₂ O в течение одной минуты, и опускаться обратно до 2 см H ₂ O в течение 30 сек
4. После завершения серии шаг давления, изменение ванны решение Ca ^{2 +-бесплатный} АПСС при 37 ° С для измерения максимального диаметра пассивного (Max D) и Ca ^{2 +-флуоресцентных} измерений на каждом из выше просвета давления. Макс D используется для расчета тонуса и нормализации данных между лимфатической разных размеров.

6. Лимфатическая Параметры Сократительная

1. Изменения диаметра сосуда с течением времени может быть определена с помощью инструментов слежение за объектом изображения в большинстве пакетов программного обеспечения для анализа. Этого можно достичь, используя только один из каналов (мы используем 340 нм канале, но 380 каналов также могут быть использованы). Отличие порог приложениясолгал изображение стек так, что стенки сосудов, выделяются, а затем трансформирования охватывающий каждой стены тянутся к отслеживать их с течением времени (рис. 3). Внутренний диаметр может быть определено путем измерения тяжести каждой стены и вычисления расстояния между двумя центрами тяжести, за вычетом половины толщины каждой стены.
   Второй вариант, когда трудно отслеживать каждой стены из-за сильного сигнала в область просвета заключается в измерении внешнего диаметра, а также использовать поправочный коэффициент на основе статических измерений стенок сосудов для получения внутреннего диаметра. В этом случае возврат инвестиций охватывает все судно и наружным диаметром отслеживается (рис. 3 б). Этот метод может также использоваться для определения всей видимой площади поперечного сечения лимфатических (рис. 3 C). Из-за типичной формой лимфатический сосуд, этот последний вариант может дать более точную оценку фактического объема жидкости, перекачиваемой с каждым сокращением, чем при использовании диаметра в выбранной частисудна.
2. С покадровой исследования определяют следующие параметры лимфатической просвета измерения диаметра ^4,12,13:
   Сокращение частоты (CF), определяется путем подсчета количества фазовых сокращений в минуту.
   Конец диастолического диаметра (ЭДД), которая является диаметром непосредственно перед фазовый сокращения.
   Конец систолического диаметра (ОУР), диаметром в конце фазовый сокращения.
   Амплитуда сокращений (AMP = EDD-ESD), упрощенный индекс ударного объема.
   Максимальный диаметр пассивного давления на каждом (Max D; определяется в Ca ^{2 +-свободных} условиях), которые могут быть использованы для определения тона порожденных лимфатической гладких мышц, а также используется для нормализации данных между лимфатической разного диаметра, или же лимфатическая учился в различных просвета давления.
   ЭДД _1, что ЭДД связано с первым сокращением после давления шаг. Это используется в качестве отправной точки, когдаопределения миогенной сужение лимфатический сосуд в ответ на шаг увеличения просвета давления ^5.
   Миогенный сужение изолированной лимфатической после давления шаг представлена ​​нормированная изменение ЭДД следующий шаг усилит давление = 100 * (ЭДД - EDD ₁₎ / Макс D.
   Дополнительные переменные, которые можно рассчитать, но рассматриваются в других разделах подробно ⁴ являются:
   Тон = 100 * (Макс D - EDD) / Макс D, нормированной AMP AMP = / Max D
   Инсульт индекс физического объема (SVI) = π (EDD ² - ОУР ²⁾
   Фракция выброса (ФВ) = SVI / (πEDD2)
   Том Flow Index (VFI) = CF х SVI.

7. Представитель Результаты:

В начале каждого фазовый сокращения, было кратковременное повышение [Ca ^{2 +]} _я (рис. 4). Кроме того, после шага увеличения просвета давление, частота Са ^{2 +} переходных процессов и рhasic сокращений увеличилась в синхронности. Эти наблюдения похож на предыдущий вывод использованием грудного протока установлен на проволоку myograph ¹⁴ и поддерживать предыдущие данные, указывающие на центральную роль колебательных Са ^{2 +} освобождение от внутренних магазинов в механизм, лежащий в основе фазовых сократительной цикла ^15.

Мы также исследовали ли [Ca ^{2 +]} _я во время диастолы (между Са ^{2 +} переходные и фазовые сокращения) связана с лимфатической и тон миогенной сужение вызвано растягивается при шаге увеличения давления устанавливаются (рис. 5). Сразу же после шага увеличения давления +4 см H ₂ O и выше, [Ca ^{2 +]} _я во время диастолы постоянно увеличивается, по сравнению с исходным уровнем до давления шаг (рис. 5В). Кроме того, после первоначального увеличения в диаметре за шагом увеличения давления (ЭДД _1), не было миогенной сужение (рис.Юр 5C), определяемая как снижение ЭДД от EDD ₁ в предыдущих докладах ^5,12. При сравнении среднего нормированного изменение электронной доставки документов между различными шагами давления, было значительно больше сужение после повышения +8 и +10 см H ₂ O по сравнению с +2 см H ₂ O (рис. 6). Устойчивый рост [Са ^{2 +]} _я был также связан с давлением, с шагом увеличения +6, +8, и +10 см H ₂ O вызывает значительно выше, изменения в Ca ^{2 +,} чем + 2 см H ₂ O ( Рисунок 6 В). Тем не менее, давление шаг Са ^{2 +} отношений кажется плато при этих давлениях, а также. Эти результаты показывают, что Ca ^{2 +-зависимый} механизм связан с лимфатической миогенной сужение в ответ на растяжение. Тем не менее, плато давления шаг Са ^{2 +} отношений предлагает механизм, который увеличивает Са ^{2 +} чувствительность могут также способствовать увеличению мышечной constriction на более высоких ступенях давления.

Рисунок 1. Схема микроскопа система, используемая для измерения [Ca ^{2 +]} _я в изолированной лимфатической. Изолированной камере лимфатической находится на стадии инвертированного микроскопа. Образец освещается альтернативы при 340 и 380 нм, а флуоресцентный сигнал, излучаемый лимфатической собирается с ПЗС-камерой и хранится в персональном компьютере. Внутрипросветного давления лимфатической управляется серво-нуль-системы обратной связи. Пользователь устанавливает давление для системы, и датчики давления в линию с лимфатической реле внутрипросветного давления системы обратной связи, которая может динамически повышать или понижать давление с помощью насоса.

Рисунок 2. Пример области интереса (ROI) отбор для Фура-2 логометрических исследования изображений в изолированных лимфатических сосудов. Выбран регион включает в себя большую часть судна (за исключением областей трогательно микропипетки) и его окрестностях для обеспечения судна будет отслеживаться в течение всего учебного времени. Фон ROI (в правом верхнем углу) также используется для устранения неспецифической сигнала от окружающих ванну.

Рисунок 3. Методы отслеживания лимфатической накачки. А. Внутренний диаметр может быть определен по времени с помощью трансформирования, которые позволяют отслеживать движение стенок сосудов. B. Когда контраст порог устанавливается включить все судно, внешний диаметр можно отслеживать с помощью одного ROI. Внутренний диаметр можно оценить из этих измерений, корректируя при толщине стены. C. Другой вариант заключается в отслеживании область охватывается судна, которые могут быть использованы для вычисления объема, корректируя при толщине стенки ипредполагая лимфатической имеет цилиндрической геометрии.

Рисунок 4. Взаимосвязь между [Са ^{2 +]} _я и лимфатической диаметре.. Представитель изображения с покадровой видео Фура-2 интенсивность (формат тепловую карту), в изолированных лимфатических сосудов. Стрелки на каждом изображении контур наружный диаметр сосуда. Рисунок 1 показывает, лимфатической во время диастолы, с относительно низкими [Ca ^{2 +]} _я. В изображении 2, интенсивность 340/380 отношение увеличивается в стенках сосудов, непосредственно перед фазовый сокращение, которое происходит в образах 3-5. По изображения 4, Ca ^{2 +} переходных закончился, и изображение 5, фаза систолического закончилась и судно возвращается в исходное состояние. B. Сюжет [Ca ^{2 +]} _я и лимфатической просвета показывает, что кратковременное повышение [Ca ^{2 +]} _я происходит непосредственно перед каждымфазовый сокращения.

Рисунок 5. Изменения в лимфатических [Ca ^{2 +]} _я и лимфатической сократительной цикла в ответ на шаг увеличения давления. Давление шаг протоколов (), 340/380 соотношение данных, представляющих [Ca ^{2 +]} _я (В), и изменения в лимфатических диаметра с течением времени (С) показано на рисунке. А. Базовый просвета давление 2 см Н ₂ О и лимфатический сосуд был подвергнут шаг увеличения +2, +4, +6, +8, +10 см и H ₂ O. Временной интервал между каждой записи шаг давление 1-2 мин. Каждый шаг давление вызвало увеличение как частоты преходящее увеличение [Ca ^{2 +]} _я (В) и фазовый сокращений (С). Лимфатический диаметра также увеличилось с каждым шагом увеличения просвета давления, так и для +4 до +10 см H ₂ O шаги давление, не было первоначального снижения в электронной доставки документов, которые произошли афтер EDD1 (С), описанных ранее в качестве лимфатической миогенной сужения. Существовал также постоянное увеличение базального [Ca ^{2 +]} _я между переходными сразу же после каждого шага, увеличение давления (B). Миогенной сужения была более выраженной с большей шаги давления, однако увеличение базального [Ca ^{2 +]} _я был примерно одинаковым для +4 до +10 см H ₂ O давление шагов (B). Ранее сообщалось компенсаторное увеличение в AMP было также очевидно, после давления шагов от +6 до +10 см Н ₂ О (С).

Рисунок 6. Лимфатический миогенной сужения и постепенное увеличение свободного [Ca ^{2 +]} _я во время диастолы, вскоре после шага увеличения давления.. Средний ЭДД между 30-50 с после ЭДД ₁ используется для расчета изменения нормированного ЭДД для каждого давления шаг. B. Интенсивность 340/380 соотношение 30-50 с после ЭДД ₁ была разделена на среднее соотношение 340/380 во время базовой (2 см H ₂ O). * P <0,05 по сравнению с +2 см H ₂ O шаг давлением. N = 4 судна изучены.

Фильм 1. Пример фазовый сокращений в изолированной судна лимфатической используется для исследования. Просвета давления была установлена ​​на уровне 2 см H ₂ O. Прошло время и шкалы приведены в нижней части. Покадровой изображения были собраны с использованием 10X цель проходящем свете. Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.

Фильм 2. Логометрический Фура-2 изображений в насосной изолированных лимфатических сосудов. Тепловая карта масштаба отображается в верхнем левом углу и затраченное время и шкалы приведены в нижней части. Давление было изначально установлена ​​на уровне 2 см H ₂ O и был поднят на 8 см H ₂ O, начиная с 0,5 мин и returneг до 2 см H ₂ O на 1,5 мин. Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.

Discussion

Новую комбинацию методов был применен для изучения внутренней перекачки лимфатических сосудов. Возможность одновременно измерять изменения [Са ^{2 +]} _я и диаметром в насосных лимфатических позволит исследований относительный вклад Ca ^{2 +-зависимый} и Са ^{2 +-информирование} сигнальных путей в общем механизме регулирующего лимфатической сократительной цикла.

Лимфатической сократительной цикл состоит из сокращения фазовый накладываются на тон. Данные показывают, что каждый фазовый сокращение связано с переходным рост [Са ^{2 +]} _я, предполагая, центральную роль Са ^{2 +} в pacemaking механизм, и что частота Са ^{2 +} переходных чувствителен к изменениям в просвета давления . Наши данные также показывают, что быстрое увеличение давления может вызвать устойчивый рост базальной [Ca ^{2 +]} _я между переходными процессами. Этот рост может способствоватьмиогенной сужение, которое наблюдается в сборе лимфатических следующий шаг увеличения просвета давления. Тем не менее, мы наблюдали плато увеличивается в этом базальные [Ca ^{2 +]} _я с давлением шагах от +6 до +10 см H ₂ O, которая различной степени миогенной сужения. Эти данные показывают, что другой механизм, возможно, Ca ^{2 +-информирование} механизм, также участвует в миогенной ответ на давление.

Одно предположение с этих исследований состоит в том, что большинство измеряемых Са ^{2 +} содержится в гладкой мускулатуре. Тем не менее, Ca ^{2 +} в эндотелиальные клетки и другие типы клеток, которые могут присутствовать в лимфатические также внести вклад в общую наблюдается [Ca ^{2 +]} _я, поэтому измеренные значения, возможно, переоценивают гладких мышц [Ca ^{2 +]} _я в лимфатические сосуды. Любой Са ^{2 +} измеряется от эндотелия не ожидается непосредственно способствоватьсгладить сокращение мышц на основе предыдущих исследований, в артериолах ^16. Этот вопрос будет рассмотрен в будущих экспериментах, в которых находятся лимфатические лишенной эндотелия.

При использовании логометрических красители для оценки [Ca ^{2 +]} _я в клетки или ткани, движение образца может привести к появлению артефактов. Чтобы свести к минимуму артефакты движения при заключении контрактов лимфатической, мы использовали ROI, который включает в себя как можно больше судна, как можно определить 340/380 отношения. Мы также изучать только судам, которые остаются в центре внимания во время их сократительная цикла. Из-за потенциальных артефактов, которые могут возникнуть в результате движения судна, а не определения абсолютного [Ca ^{2 +]} _я на конкретном сайте, мы получаем в среднем по большой площади судна. Мы ориентируемся на относительные изменения в среднем [Ca ^{2 +]} _я в течение долгого времени и как эти изменения связаны с фазической и тонической сокращение сосудов.

Таким образом, Определяетrmination изменения [Са ^{2 +]} _я по логометрических изображений в изолированных сбора лимфатической представляет собой мощный инструмент для расшифровки Ca ^{2 +-зависимый} и Са ^{2 +-информирование} механизмы, лежащие лимфатические сократительной цикла. С помощью этого метода, будущих исследований с использованием селективных агонистов или ингибиторов различных путей передачи сигнала также поможет отличать уникальные молекулярные механизмы, лежащие в сравнении с фазовыми тоник сокращение лимфатических гладких мышц.