Medición de la citosólica de Ca ^{2 +} En aislados linfáticos contráctil

Summary

Se introduce un enfoque para evaluar la citosólica de Ca

Abstract

Los vasos linfáticos forman un sistema de transporte multifuncional que mantiene la homeostasis de fluidos, proporciona los lípidos de la circulación central, y actúa como un sistema de vigilancia para los antígenos potencialmente peligrosos, la optimización de inmunidad de la mucosa y la respuesta inmune adaptativa ^1. Linfático está formado por el líquido intersticial que entra ciegos composición linfáticos iniciales, y luego se transporta en contra de un gradiente de presión en los vasos linfáticos más grandes de recolección. Cada linfático recolección se compone de una serie de segmentos llamados linfangiones, separados por válvulas bicúspides que evitar el reflujo. Cada lymphangion posee un ciclo de contracción que impulsa la linfa en contra de un gradiente de presión hacia la circulación central ^2. Este patrón de contracción fásica es análoga a la del ciclo cardíaco, con fases sistólica y diastólica, y con una contracción del ⁴ de baja frecuencia. Además, el músculo liso linfático genera tono y muestra la constricción y la dilatación miogénica in respuesta a los aumentos y disminuciones en la presión luminal, respectivamente ^5. Un híbrido de los mecanismos moleculares que apoyan tanto la contractilidad fásica y tónica de los linfáticos Así, se proponen.

Contracción del músculo liso está regulada por la citosólica de Ca ^{2 +} de concentración ([Ca ^{2 +]} _i), además de la sensibilidad a Ca ^{2 +,} de los elementos contráctiles en respuesta a cambios en el entorno que rodea la célula ^6. [Ca ^{2 +]} _i se determina por la combinación del movimiento de la Ca ^{2 +} a través de la membrana plasmática del ligando o voltaje de ^{Ca2 +} y los canales de la liberación y absorción de Ca ^{2 +} en las tiendas internas. Citosólica de Ca ^{2 +} se une a la calmodulina y activa las enzimas tales como la cadena ligera de la miosina (MLC) quinasa (MLCK), que a su vez fosforila MLC que conduce a la actina-miosina mediada por la contracción ^8. Sin embargo, la sensibilidad de esta vía a Ca 9. PCML actividad está regulada por la Rho quinasa (ROCK) y la fosfatasa miosina inhibidor de la proteína CPI-17.

A continuación, presentamos un método para evaluar los cambios en la [Ca ^{2 +]} _i en el tiempo en los vasos linfáticos aislados, perfundidos con el fin de estudiar Ca ^{2 +-dependiente} y Ca ^{2 +-sensibilizar} a los mecanismos de contracción del músculo liso linfático. El uso aislado linfáticos mesentéricos de ratas se estudió la recogida estirar los cambios inducidos en el [Ca ^{2 +]} _i y la actividad contráctil. El modelo linfático aislado ofrece la ventaja de que la presión, el flujo y la composición química de la solución del baño puede ser muy controlado. [Ca ^{2 +]} _i fue determinada por la carga de vasos linfáticos con el radiométrica, Ca ^{2 +-unión} del colorante Fura-2. Estos estudios proporcionan un nuevo enfoque al problema más amplio de estudio de los diferentes mecanismos moleculares que regulan fásicacontracciones tónico contra la constricción del músculo liso linfático.

Protocol

1. Los animales

1. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Louisiana State University Health Sciences Center, y se realizaron de acuerdo con las directrices del Instituto Nacional de Salud (NIH publicación N º 85-12, revisada en 1996). Las ratas macho Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 270-350 g de peso corporal) fueron alojados en una temperatura controlada (22 ° C) y la iluminación controlada (12:12 h ciclo de luz oscuridad) medio ambiente. Después de su llegada, las ratas fueron sometidas a un período de aclimatación de una semana y se les proporcionó comida de rata normal (2018 Teklad global dieta del 18% de proteínas de roedores, Harlan) y agua ad libitum.

2. Configuración de la prueba

1. Micropipetas de vidrio de los vasos linfáticos de montaje están hechos de vidrio borosilicato con filamentos de diámetro exterior 1,2 mm, 0.69mm ID (Sutter Instrumento BF 120-69-15). Tire de las pipetas con una Flaming / Brown Micropipeta Extractor modelo P-97 (Sutter Instrument) y bisel con una amoladora Micro EG 400 (Narishige) para obtener una punta biselada con un diámetro de ~ 60 micras exterior.
2. Monte el micropipetas en la cámara de vaso aislado (modelo CH-1, los sistemas vivos, Burlington, VT). Las pipetas deben ser emparejado resistencia (la apertura del mismo tamaño).
3. Llenar la cámara (5 ml) y micropipetas con solución salina fisiológica de albúmina (APSS, ver Tabla 1). Asegúrese de que no haya burbujas en el micropipetas o la tubería.
4. Prepare encima de la cabeza nudos con suturas oftálmicas y colocar uno en cada micropipeta.

3. Recogida de aislamiento linfático

1. Anestesiar a los animales con una inyección intramuscular de ketamina / xilazina (90 y 9 mg / kg, respectivamente), utilizando una jeringa BD (1 ml) y la aguja (bisel BD intradérmica 26G3 / 8).
2. Rocíe el área del abdomen con un 70% de alcohol para esterilizar, realizar una laparotomía media, y exteriorización y extirpar el intestino delgado y el mesenterio. Coloque el tejido en el ICe-frío APSS. La eutanasia de los animales con una sobredosis de ketamina / xilazina y confirmar la muerte por abrir el pecho (como por directrices de la American Veterinary Medical Association sobre la eutanasia).
3. Pin una sección del mesenterio en una cámara de disección llena de helado APSS. Con cuidado, la disección de un vaso linfático de recolección (80 a 200 m de diámetro interno y 2.1 mm de longitud) de los alrededores de tejido adiposo y conectivo, con la ayuda de un microscopio estereoscópico. Use unas pinzas de disección Dumont-INOX 55 (Herramientas de Bellas Ciencia # 11255-20) y la disección de las tijeras de primavera (Herramientas Artes Ciencia # 15000 a 03). Utilizar recipientes aislados con una sola válvula para asegurar el control de la presión óptima en todo el segmento durante el experimento.
4. Transferencia del sistema linfático aislado de la cámara de recipiente aislado que contiene 5 ml de la APSS. Montaje del buque en las dos pipetas de vidrio encontrados resistencia mediante la vinculación con las suturas oftálmicas.
5. Transferencia de la cámara a un microscopio de fluorescencia invertido (el nuestro es un Niken TE-2000U) equipado con una lámpara de xenón (Sutter Instrumentos Lambda LS2 300 W), 340/380 sistema de rueda de filtros (Sutter Lambda 10-3 con tecnología Chroma 340 y 380 nm de excitación filtros), 510 nm emisor dicroicos (D510 Chroma Technology / 80 m), una cámara CCD sensible (Photometrics HQ ^2), y software para la adquisición (Nikon Elementos AR) (Figura 1).
6. Conecte el tubo procedente de la micropipetas ya sea a los depósitos ajustables o con el sistema de bomba de servo-feedback (Vivir Instrumentación de Sistemas, Burlington VT), tanto que puede ser usado para alterar la presión y el flujo.
7. Conecte la cámara a la unidad de calentamiento (Sistemas Vivientes) y poner el baño a 37 ° C.
8. Ver el linfático directamente a través del cubreobjetos en la base de la cámara con un objetivo de 10 aumentos (Nikon Plan Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0,17, WD 16.0). Rápido lapso de tiempo los conjuntos de imágenes se pueden adquirir mediante el software de adquisición de imágenes (el sistema tiene elementos de software Nikon AR).

2 +] _i

1. [Ca ^{2 +]} i en el músculo liso aisladas linfático se mide por el Ca ^{2 +-detección} de colorante Fura 2-acetoximetil éster (AM) (Molecular Probes, Eugene, OR).
2. Cargue el vaso linfático con Fura-2 AM por el intercambio de la bañera para APSS solución que contiene Fura-2 AM (2 mM) y ácido plurónico (0,2% p / v) durante 30 minutos a 37 º C.
3. Después de 30 minutos cambiar la bañera de nuevo a APSS solución. Enjuague dos veces para lavar la Fura-2 a partir de la solución del baño. Tras dejar el puerto para un tiempo de equilibrio de al menos 20 minutos antes de la [Ca ^{2 +]} _i las medidas para permitir el restablecimiento de las contracciones espontáneas.
4. Recoger radiométrica Fura-2 mediciones en los vasos linfáticos aislados con un protocolo de adquisición que, alternativamente, ilumina a 340 y 380 nm longitud de onda para las duraciones de cada 50 ms. La luz fluorescente pasa a través de un espejo dicroico (400 nm; Chroma Tecnolog Corp. 400DCLP) y una amplia gama de filtros de banda de emisión (510 nm, 80 nm de ancho de banda, Chroma Technology Corp. D510/80m) y se adquiere por la Fotometría HQ cámara de ^2. Nosotros recogemos 2 minutos de los datos a una presión intraluminal de referencia de 2 cm H ₂ O y durante el aumento de paso de 2, 4, 6, 8 y 10 cm H ₂ O.
5. Para analizar el promedio de [Ca ^{2 +]} _i, dibuja una región de interés (ROI) que incluye el vaso linfático entero y sus alrededores para que el buque se encuentre en un seguimiento durante la relajación y la contracción (Figura 2). Si bien es micropipeta en el campo de visión de estas áreas no deben ser incluidos en el ROI. Menor rendimiento de la inversión también puede ser elegido, sin embargo, un problema potencial con el rendimiento de la inversión pequeña es que las paredes del recipiente se puede mover ligeramente en la dirección longitudinal del retorno de la inversión que el buque se contrae y se relaja. Otro problema potencial es que algunos buques de giro durante la contracción, y los vasos linfáticos no se debe utilizar para el estudio. ªmovimientos e torsión general, se evita limitando la duración de los linfáticos aislados, <1 mm. Además, a veces los segmentos a ambos lados de una válvula no se constriñen / relax en sincronía. En este caso, debido a que estos segmentos representan por separado linfangiones funcional, el sistema linfático debe ser estudiado en un solo lado de la válvula, o cada lymphangion pueden ser estudiados por separado con un retorno de la inversión colocados a ambos lados. Cuando se utiliza un objetivo de 10X, las paredes del recipiente debe permanecer enfocado durante las contracciones fásicas, sin embargo, si hay alguna parte de las paredes que van fuera de foco durante las contracciones estas áreas no deben ser incluidos en el ROI. Un retorno de la inversión de fondo también se utiliza y debe ser colocado lejos de la embarcación (por ejemplo, en la esquina de la imagen). Un aumento en la proporción 340/380 indica un aumento de [Ca ^{2 +]} _i. Diámetro de la luz en distintos momentos también se puede medir utilizando la función de software de medida o por el seguimiento de las paredes del recipiente a través del tiempo (ver sección 6). </ Li>

5. Protocolo de control de presión

1. Para el estudio independiente de la presión del flujo de impuestos, la misma presión se debe aplicar a cada micropipeta por la bomba de servo retroalimentación nulo. La tubería de cada micropipeta se une a través de un conector en T para tubos comunes montados en la bomba. Inicialmente, ajuste la presión intraluminal a 2 cm H ₂ O durante 45-60 min., Lo cual es suficiente tiempo para permitir el desarrollo de las contracciones espontáneas linfático.
2. Para estudiar el uso de sólo los buques que cumplen los criterios siguientes en el período de equilibrio: (1) el buque se desarrolla el tono espontáneo a 2 cm H ₂ O, (2) el buque se desarrolla contracciones regulares y espontáneas que son razonablemente uniforme en toda la eslora del buque . A menudo, el área aguas abajo de una válvula se contrae más que el resto de la nave, y estos buques serán utilizados siempre y cuando exista evidencia de que el resto de la nave muestra la actividad contráctil.
3. Registre el rápido time-lapse de imágenes durante el procedimiento paso a la presión. Para cada uno, la presión comenzará a las 2 cm H ₂ O durante 30 s, y luego se eleva en un paso a dos, cuatro, seis, ocho o 10 cm H ₂ O durante un minuto, y bajó de nuevo a 2 cm H ₂ O durante 30 s.
4. Después de completar la serie de paso la presión, el cambio de la solución del baño de una Ca ^{2 +} libre APSS a 37 ° C para medir el diámetro máximo pasiva (Max D) y Ca ^{2 +-mediciones} de fluorescencia en cada una de las presiones por encima de luminal. La D Max se utiliza para calcular el tono y normalizar los datos entre el sistema linfático de diferentes tamaños.

6. Linfática contráctil parámetros

1. Los cambios en el diámetro del vaso con el tiempo se puede determinar usando las herramientas de seguimiento de objetos en la mayoría de paquetes de software de análisis de imagen. Esto se puede lograr mediante el uso de sólo uno de los canales (se utiliza el canal de 340 nm, pero el canal 380 también podría ser utilizado). Un umbral de contraste es de aplicaciónmintió a la pila de imágenes para que las paredes del recipiente se ponen de relieve, y rendimiento de la inversión que abarca cada pared se sienten atraídos por su seguimiento en el tiempo (Figura 3). El diámetro interno puede ser determinada mediante la medición del centro de gravedad de cada pared y calcular la distancia entre los dos centroides, menos la mitad del espesor de cada pared.
   Una segunda opción cuando es difícil hacer un seguimiento de cada pared, debido a una fuerte señal en el área luminal es medir el diámetro exterior, y utilizar un factor de corrección basado en una medición estática de las paredes de los vasos para obtener un diámetro interior. En este caso, el retorno de la inversión se extiende por todo el barco y el diámetro exterior se hace un seguimiento (Figura 3 B). Este método también puede utilizarse para determinar la totalidad de la zona visible de la sección transversal de los vasos linfáticos (Figura 3 C). Debido a la forma típica de un lymphangion, esta última opción puede proporcionar una mejor estimación del volumen real del líquido bombeado en cada contracción que el uso de diámetro en la parte seleccionadadel buque.
2. A partir del estudio de lapso de tiempo determinar los siguientes parámetros de las mediciones de diámetro de la luz ^4,12,13 linfático:
   Contracción de frecuencia (CF), determina contando el número de contracciones fásicas por minuto.
   Diámetro de fin de diástole (EDD), que es el diámetro justo antes de una contracción fásica.
   Diámetro sistólico final (ESD), el diámetro en el extremo de una contracción fásica.
   Amplitud de la contracción (AMP = EDD-ESD), un índice simplificado del volumen sistólico.
   El diámetro máximo pasiva a cada presión (D Max, determinado en Ca ^{2 +-sin} condiciones), que puede ser usado para determinar el tono generado por el músculo liso linfático, y también se utiliza para normalizar los datos entre el sistema linfático de diferente diámetro, o el linfático mismo estudió a diferentes presiones luminal.
   EDD _1, que es la EDD asociados con la primera contracción después de una etapa de presión. Esto se utiliza como punto de partida alla determinación de la constricción miogénica de un vaso linfático en respuesta a un incremento gradual de la presión luminal ^5.
   Constricción miogénica de una linfático aislado después de una etapa de presión está representada por el cambio normalizado en EDD tras un aumento del paso de presión = 100 * (EDD - EDD ₁₎ / D Max.
   Variables adicionales que se pueden calcular, pero se discuten en detalle en otra parte ⁴ son:
   Tono = 100 * (Max D - EDD) / Max D, AMP normalizado = AMP / Max D
   Índice de volumen sistólico (IS) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   Fracción de eyección (FE) = SVI / (πEDD2)
   Índice de volumen de flujo (VFI) = CF x SVI.

7. Los resultados representativos:

Al comienzo de cada contracción fásica, se produjo un aumento transitorio de [Ca ^{2 +]} _i (Figura 4). Además, después de incrementos en la presión luminal, la frecuencia de Ca ^{2 +} transitorios y pcontracciones Hasic aumento en sincronía. Estas observaciones son similares a los de un hallazgo previo utilizando los conductos torácicos montado en un cable de ¹⁴ miografía y el apoyo de datos previos que indican un papel central para oscilatorio liberación de Ca ^{2 +} de los almacenes internos en el mecanismo subyacente del ciclo fásica contráctil ^15.

También se investigó si la [Ca ^{2 +]} _i durante la diástole (entre el Ca ^{2 +} transitorios y las contracciones fásicas) se asocia con el tono linfático y la constricción miogénica causada por el estiramiento cuando se incrementa el paso de la presión se imponen (Figura 5). Inmediatamente después de incrementos en la presión de 4 cm H ₂ O y superior, [Ca ^{2 +]} _i durante la diástole constante aumento, en comparación con el valor inicial antes de la etapa de presión (Figura 5). Además, después del aumento inicial de diámetro debido a los aumentos en la presión del paso (EDD _1), no había constricción miogénica (Fig.Ure 5C), definida como una disminución de la EDD de _un EDD en los informes anteriores ^5,12. Al comparar el cambio medio normalizado en EDD entre las medidas de presión, no había constricción significativamente mayor después de los aumentos de 8 y 10 cm H ₂ O en comparación con 2 cm H ₂ O (Figura 6 A). El aumento constante de la [Ca ^{2 +]} _i se relacionó también con la presión, con el aumento de paso de 6, 8 y 10 cm H ₂ O causar cambios significativamente más altos en Ca ^{2 +} de 2 cm H ₂ O ( Figura 6 B). Sin embargo, la presión del paso de Ca ^{2 +} aparece relación a la meseta a estas presiones también. Estos resultados sugieren que el Ca ^{2 +-dependiente} mecanismo se asocia a la constricción linfática miogénica en respuesta al estiramiento. Sin embargo, la meseta de la presión del paso de Ca ^{2 +} relación sugiere un mecanismo que aumenta la sensibilidad a Ca ^{2 +} también puede contribuir al aumento de constri miogénicacción de las medidas de presión más alta.

Figura 1. Esquema del sistema de microscopio utilizado para la medición de la [Ca ^{2 +]} _i en una linfático aislado. La cámara linfático aislado se coloca en la platina del microscopio invertido. La muestra se ilumina alternativamente a 340 y 380 nm, y la señal fluorescente emitida por el sistema linfático se recoge con una cámara CCD y almacenados en un ordenador personal. La presión intraluminal de la linfático es controlado por un sistema de realimentación servo-nulo. El usuario establece la presión para el sistema, y ​​los transductores de presión en línea con el sistema linfático del relé de la presión intraluminal en el sistema de retroalimentación, que dinámicamente se puede aumentar o disminuir la presión mediante una bomba.

Figura 2. Ejemplo de la región de interés (ROI) la selección de Fura-2 estudios de imagen radiométrica en los vasos linfáticos aislados. La región seleccionada incluye la mayor parte de la embarcación (con exclusión de tocar el micropipetas) y sus alrededores para asegurar el buque se realizará un seguimiento de la evolución en el tiempo entero. Un retorno de la inversión de fondo (en la esquina superior derecha) también se utiliza para eliminar la señal no específica del baño de los alrededores.

Figura 3. Métodos para el seguimiento de bombeo linfático. A. Diámetro interior se puede determinar en el tiempo utilizando el ROI que seguir el movimiento de las paredes de los vasos. B. Cuando el umbral de contraste va a incluir todo el buque, el diámetro exterior pueden ser seguidos por un retorno de la inversión individual. De diámetro interno puede estimarse a partir de estas mediciones mediante la corrección de espesor de pared. C. Otra opción es realizar el seguimiento del área abarcada por el buque, que puede ser utilizado para calcular el volumen mediante la corrección de espesor de pared yasumiendo que el sistema linfático tiene una geometría cilíndrica.

Figura 4. Relación entre la [Ca ^{2 +]} _i y el diámetro linfático. A. Imágenes representativas de un vídeo time-lapse de la Fura-2 de intensidad (en formato mapa de calor) en una linfático aislado. Las flechas en cada imagen contorno del diámetro exterior de la nave. La imagen 1 muestra el sistema linfático durante la diástole, con relativamente baja [Ca ^{2 +]} _i. En la imagen 2, la intensidad de la relación de 340/380 aumentos en las paredes del recipiente, justo antes de la contracción fásica que se produce en las imágenes 3.5. Por la imagen 4, el Ca ^{2 +} transitorio ha terminado, y por la imagen 5 de la fase sistólica se ha terminado y el barco está volviendo a su estado de reposo. B. Una parcela de [Ca ^{2 +]} _i y el diámetro luminal linfático muestra que un aumento transitorio de [Ca ^{2 +]} _i se produce justo antes de cadacontracción fásica.

Figura 5. Cambios en la linfática [Ca ^{2 +]} _i y el ciclo linfático contráctil en respuesta al paso aumento de la presión. Los protocolos de paso de presión (A), 340/380 datos de la proporción, que representa el [Ca ^{2 +]} _i (B), y cambios en el diámetro linfático a través del tiempo (C) se muestran. A. la presión basal luminal fue de 2 cm H ₂ O y los vasos linfáticos fue sometido a paso los aumentos de 2, 4, 6, 8 y 10 cm H ₂ O. El intervalo de tiempo entre cada grabación de paso la presión fue de 1-2 min. Cada etapa de presión provocado un aumento en la frecuencia de los aumentos transitorios de la [Ca ^{2 +]} _i (B) y las contracciones fásicas (C). Diámetro linfático también se incrementa con cada incremento gradual de la presión luminal, y para el 4 a 10 cm H ₂ O de presión pasos, se produjo una disminución inicial en las Jornadas que tuvieron lugar after EDD1 (C), se ha descrito anteriormente, como la constricción miogénica linfático. También hubo un aumento constante en la parte basal de [Ca ^{2 +]} _i entre transitorios inmediatamente después de cada incremento gradual de la presión (B). La constricción miogénica fue más pronunciada con los pasos de presión mayor, sin embargo el aumento en la temperatura basal [Ca ^{2 +]} _i fue de aproximadamente el mismo para los 4 a 10 cm H ₂ O de presión pasos (B). Un aumento ya se ha informado de compensación en el AMP también fue evidente después de los pasos de presión de 6 a 10 cm H ₂ O (C).

Figura 6. Constricción miogénica linfático y el aumento gradual de la libre [Ca ^{2 +]} _i durante la diástole, poco después de incrementos en la presión. A. El promedio EDD entre 30-50 s después de que el EDD ₁ se utiliza para calcular el cambio en la EDD normalizadas para cada etapa de presión. B. La intensidad de la relación 340/380 30-50 s después de que el EDD ₁ fue dividido por el promedio de 340/380 relación durante la línea base (2 cm H ₂ O). * P <0,05 frente a los 2 cm H ₂ O de presión paso. N = 4 barcos estudiados.

Movie 1. Ejemplo de las contracciones fásicas en un vaso linfático aislada que se utiliza para el estudio. La presión luminal se fijó en 2 cm H ₂ O. El tiempo transcurrido y una barra de escala se muestran en la parte inferior. Las imágenes con lapso de tiempo fueron recogidos con un objetivo de 10X con luz transmitida. Haga clic aquí para ver la película.

Movie 2. Proporcional Fura-2 en una imagen de bombeo linfático aislado. A escala del mapa de calor se muestra en la parte superior izquierda y el tiempo transcurrido y la barra de escala se muestran en la parte inferior. La presión se fijó inicialmente en 2 cm H ₂ O y se elevó a 8 cm H ₂ O a partir de 0,5 minutos y Returned a 2 cm H ₂ O en 1.5 min. Haga clic aquí para ver la película.

Discussion

Una nueva combinación de métodos se emplean para el estudio intrínseco de bombeo de los vasos linfáticos. La capacidad de medir simultáneamente los cambios en la [Ca ^{2 +]} _i y el diámetro de los vasos linfáticos de bombeo permitirá que para el estudio de las contribuciones relativas de Ca ^{2 +-dependiente} y Ca ^{2 +-sensibilizar} a las vías de señalización en el mecanismo general que rigen el ciclo de contracción linfático.

El ciclo de contracción linfático consiste en contracciones fásicas superpuesta sobre tono. Los datos muestran que cada contracción fásica se asocia con un aumento transitorio de [Ca ^{2 +]} _i, lo que sugiere un papel central de Ca ^{2 +} en el mecanismo de marcapasos, y que la frecuencia de Ca ^{2 +} transitorios es sensible a los cambios en la presión luminal . Nuestros datos también muestran que los aumentos rápidos de la presión puede provocar un aumento constante de la parte basal de [Ca ^{2 +]} _i entre los transeúntes. Este aumento puede contribuir ala constricción miogénica que se observa en la recogida de los vasos linfáticos a los aumentos de paso en la presión luminal. Sin embargo, se observó una meseta de los aumentos en este basal [Ca ^{2 +]} _i, con medidas de presión que van desde 6 hasta 10 cm H ₂ O, que tenían diversos grados de constricción miogénica. Estos datos sugieren que otro mecanismo, posiblemente una Ca ^{2 +-sensibilización} mecanismo, también está involucrada en la respuesta miogénica a la presión.

Una de las hipótesis de estos estudios es que la mayoría de la medida de Ca ^{2 +} se encuentra en el músculo liso. Sin embargo, Ca ^{2 +} en las células endoteliales y otros tipos de células que pueden estar presentes en los vasos linfáticos también contribuyen a la global observada [Ca ^{2 +]} _i, por lo tanto, los valores medidos son probablemente una sobreestimación del músculo liso [Ca ^{2 +]} _i en linfáticos. Cualquier ² Ca ⁺ mide desde el endotelio no se espera que contribuya directamentepara suavizar la contracción muscular sobre la base de estudios previos en las arteriolas ^16. Este tema será tratado en futuros experimentos en el que los vasos linfáticos son despojadas de endotelio.

Cuando el uso de tintes radiométrica para evaluar la [Ca ^{2 +]} _i en células o tejidos, el movimiento de la muestra pueden causar artefactos. Para minimizar artefactos de movimiento en la contratación de los vasos linfáticos, se utilizó un retorno de la inversión que incluye la mayor cantidad de buques como sea posible para determinar 340/380 ratios. También el estudio sólo los buques que permanecen en foco durante su ciclo de contracción. Debido a los artefactos que puedan surgir del movimiento de buques, en lugar de determinar la absoluta [Ca ^{2 +]} _i en un sitio particular, se obtiene el promedio de una amplia zona de la nave. Nos centramos en los cambios relativos en el promedio de [Ca ^{2 +]} _i en el tiempo y la forma en que estos cambios se relacionan con la contracción fásica y tónica de los vasos.

En resumen, determination de los cambios en la [Ca ^{2 +]} _i por la imagen radiométrica en los vasos linfáticos aislados recolección representa una herramienta poderosa para descifrar el Ca ^{2 +-dependiente} y Ca ^{2 +-sensibilizar} a los mecanismos subyacentes del ciclo contráctil linfático. Con este método, los estudios futuros utilizando agonistas selectivos o inhibidores de diferentes vías de transducción de señales también ayudará a diferenciar los mecanismos moleculares que subyacen a la contracción única fásica contra tónica en el músculo liso linfático.